4個北美冬青品種對干旱脅迫的應(yīng)激反應(yīng)及耐旱性比較1)

李雪霞 鐘頌正 陳茜 狄晶晶 陳穎

(南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心(南京林業(yè)大學(xué)),南京,210037)

落葉型冬青(IlexverticillataL.)又名輪生冬青、北美冬青,是冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬(Ilex)多年生落葉灌木,引自歐洲和北美洲[1],其冬季落葉,果實紅色,掛果時間長,具有較高的觀賞價值和商業(yè)價值,在園林綠化、切枝觀賞市場上占有重要地位[2-3]。近十幾年來,在我國東部沿海地區(qū)開展了北美冬青的種質(zhì)資源引進(jìn)和新品種推廣,相關(guān)研究也逐漸開展,如在組織培養(yǎng)[4-5]、抗逆性[3,6-7]、基因組大小[8]、整形修剪[9]、果實呈色及生長發(fā)育[10-11]等方面都有了一些進(jìn)展。由于北美冬青來自國外,引種到國內(nèi)后,其品種適應(yīng)性會有差異,在各地區(qū)的生長也不同,若向西北部地區(qū)推廣就會遇到干旱缺水的問題,即使在雨量比較充沛的地區(qū),也會遇到季節(jié)性干旱問題。因此,研究北美冬青的耐旱性機(jī)制可為其抗旱新品種的篩選、推廣及應(yīng)用提供技術(shù)參考,具有重要的現(xiàn)實意義和必要性。

干旱是植物生長和分布的主要限制因子之一[12-13]。干旱脅迫會導(dǎo)致氣孔關(guān)閉,光合降低,進(jìn)而導(dǎo)致滲透脅迫,膜脂過氧化,最終會導(dǎo)致核酸蛋白質(zhì)的降解[14-16]。植物主要通過形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理代謝、提高抗氧化酶活性、基因表達(dá)等共同作用體現(xiàn)對干旱環(huán)境的適應(yīng)性[14],這方面的研究在農(nóng)作物和林木較多,但對北美冬青的耐旱性及其耐旱性機(jī)制的研究頗少。

本研究選擇4個北美冬青新品種(分別為IlexverticillataL.‘Red Sprite’、IlexverticillataL.‘Gray’、IlexverticillataL.‘Oosterwijk’、IlexverticillataL.‘Winter Gold’)的兩年生扦插苗為試驗材料,研究不同干旱脅迫強度對其生長的影響及抗氧化應(yīng)激機(jī)制,并通過綜合分析評定各品種的耐旱能力,從而篩選出抗逆性較好的品種,為北美冬青新品種的推廣、繁育及適應(yīng)性提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

試驗材料:供試材料為4個北美冬青(IlexverticillataL.)2年生扦插苗,品種分別為‘Red Sprite’(Rp)、‘Gray’(Gr)、‘Oosterwijk’(Os)、‘Winter Gold’(Gd),其中Rp引自美國,其他品種來自南京青珠果園藝有限公司。將苗木移植到花盆中,苗木培育及管理方法見文獻(xiàn)[3]。人工氣候室溫度控制在(25±2)℃,光合有效輻射為160 μmol·m-2·s-1,光照時間為每天14 h。

處理方法:采用自然控水干旱處理方法,使土壤含水量逐漸降低,達(dá)到水分脅迫梯度的要求[15]。經(jīng)預(yù)試驗發(fā)現(xiàn),在自然失水0、6、12 d后,可以得到3個水分梯度:對照組(正常供水,土壤含水量在58%～64%),輕度干旱組(自然失水6 d,土壤含水量在40%～51%),重度干旱組(自然失水12 d,土壤含水量在31%～37%)。每處理6株植株,3次重復(fù),每處理共18株。選取長勢一致、健壯、無病蟲害植株進(jìn)行處理。試驗前對盆栽苗木充分澆水,使土壤含水量達(dá)到飽和狀態(tài),然后通過持續(xù)控水的方法,逐漸降低土壤含水量達(dá)到水分脅迫梯度,并分別在各時段取樣。選取枝條頂端從上往下第3～6片葉為材料,其中一部分葉片立即用于含水量、葉綠素和電導(dǎo)率的測定,剩余的葉片在超低溫冰箱中-80 ℃保存,用于各項生理生化指標(biāo)的測定。

數(shù)據(jù)處理:試驗設(shè)置3次重復(fù),采用Microsoft Excel 2016對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用SPSS 21.0軟件對處理間的差異顯著性進(jìn)行分析(Duncan新復(fù)極法,P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對北美型冬青葉片形態(tài)、含水量及葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

經(jīng)干旱處理12 d(嚴(yán)重干旱)時,4個冬青品種的葉片表型對干旱的反應(yīng)不同,從圖1可見,Gr和Rp品種葉片沒有出現(xiàn)干枯現(xiàn)象。Gr品種葉片顏色呈現(xiàn)黃綠色,葉片較厚;Rp品種葉色為深綠色,葉片較硬、較厚;Os品種的葉緣出現(xiàn)了稍許干枯,葉片較薄;而Gd品種的葉緣大部分出現(xiàn)了干枯,葉色深綠,為最不耐旱品種。

圖1 4個北美冬青品種干旱處理時葉片的表現(xiàn)

由表1可見,4個北美冬青品種的葉片含水量均隨著干旱脅迫時間的增加而呈下降趨勢。在處理6 d(輕度干旱)時,各品種的葉片含水量下降幅度較小,含水量均在62.20%～70.80%之間;而干旱脅迫12 d(嚴(yán)重干旱)時,Rp的葉片含水量較對照只下降了9.5%,Gr、Os、Gd的葉片含水量下降幅度較大,分別比對照下降了43.4%、43.0%、25.9%,各處理均與對照存在顯著差異(P<0.05)。

表1 干旱脅迫時4個北美冬青品種的含水量和葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

4個北美冬青品種的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)也隨著干旱脅迫時間的延長呈下降趨勢。在干旱處理6 d時,Gr的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降幅度最大(43.2%),與對照存在顯著差異(P<0.05);在干旱12 d時,Rp、Gr、Os、Gd 4個品種的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對照相比下降幅度明顯,分別下降了44.0%、58.3%、44.7%、36.9%,其中降低幅度最小的品種為Gd(表1)。

各品種的葉綠素a、b質(zhì)量分?jǐn)?shù)比均隨著干旱脅迫時間的增加呈增加趨勢,在干旱12 d時,Rp、Gr、Os、Gd 4個品種的葉綠素a、b質(zhì)量分?jǐn)?shù)比分別比對照提高了102.5%、67.8%、48.6%、41.0%,Rp、Gr品種提高幅度較大,說明干旱脅迫對葉綠素b影響更大,葉綠素a在光合作用中占主導(dǎo)力量。

從類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化可見,Rp、Os在輕度干旱時變化不顯著,只有Gr出現(xiàn)了下降。但在嚴(yán)重干旱(12 d)情況時,Rp、Gr、Os 3個品種的類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)都出現(xiàn)了顯著降低,分別比對照(正常澆水)降低了16.0%、42.9%、28.0%,Gd品種也降低了21.3%,但與對照差異不顯著。但由類胡蘿卜素與總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比可知,各品種的比值均隨脅迫強度的增加呈上升趨勢,在輕度干旱(6 d)時,Rp、Gr、Os、Gd的類胡蘿卜素與總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比分別比對照提高了36.8%、27.8%、23.5%、20.0%,而在嚴(yán)重干旱(12 d)時,4個品種的比值分別比對照升高了47.3%、38.9%、35.3%、25.0%,Rp與Gr品種上升幅度較大(P<0.05)。

2.2 干旱脅迫對北美冬青相對電導(dǎo)率及丙二醛、H2O2、超氧陰離子自由基質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

隨著干旱脅迫時間增加,4個北美冬青品種的相對電導(dǎo)率均呈上升趨勢。但輕度干旱脅迫(6 d)時,Rp、Os的相對電導(dǎo)率上升幅度較大,分別比對照提高了55.9%、83.6%;在嚴(yán)重干旱(12 d)時,各品種的相對電導(dǎo)率都顯著增加(P<0.05),Rp、Gr、Os、Gd分別比對照增加了140.4%、131.7%、170.4%、158.2%,Gr與Rp品種的電導(dǎo)率增加相對較低(表2)。

表2 干旱脅迫時4個北美冬青品種的相對電導(dǎo)率及丙二醛、H2O2、超氧陰離子自由基質(zhì)量分?jǐn)?shù)

與相對電導(dǎo)率變化的趨勢相似,隨著干旱脅迫強度的增加,4個品種的丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)也整體呈上升趨勢。在干旱脅迫6 d時,各品種丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化幅度不大,都與對照無顯著差異。但在干旱脅迫12 d(重度干旱)時,Rp、Gr、Os、Gd 4個品種的丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)都大幅度上升,分別比對照增加了23.3%、37.9%、33.1%、40.6%(表2)。

由表2可見,各品種的H2O2和超氧陰離子自由基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大多隨著干旱脅迫時間的增加而增加,在干旱脅迫12 d時達(dá)到最大值。在輕度干旱(6 d)時,Rp、Gr、Gd的H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對照相比沒有顯著變化,只有Os品種的H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)比對照顯著下降了32.0%;而在嚴(yán)重干旱(12 d)時,Rp、Gr、Os、Gd 4個品種H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)都顯著增加,分別比對照提高47.0%、89.5%、7.4%、23.8%,Gr的H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加最多。在輕度脅迫(6 d)時,Gr和Os品種超氧陰離子自由基的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加,分別比對照增加了50.3%、23.6%;而嚴(yán)重干旱脅迫時,Rp、Gr、Os、Gd的超氧陰離子自由基都出現(xiàn)顯著增加,分別比對照增加57.7%、124.6%、131.0%、104.9%,Rp的增加值最小。

2.3 干旱脅迫對北美冬青抗氧化酶活性的影響

由表3可見,各個品種的超氧化物歧化酶活性均隨著干旱脅迫強度的加大而增強,Rp、Gr增加的相對較小(小于20%),而Os、Gd品種的酶活性顯著增加,在輕度脅迫時,分別比對照提高了29.1%、35.7%;在嚴(yán)重脅迫時,Rp、Gr、Os、Gd的超氧化物歧化酶活性顯著增加,分別比對照提高了16.3%、20.1%、50.0%、58.0%,差異達(dá)極顯著水平(P<0.01),其中,Gd的超氧化物歧化酶活性提高的最多,Rp的超氧化物歧化酶活性提高幅度低于其他品種。

表3 干旱脅迫時北美冬青4個品種的抗氧化酶活性

與超氧化物歧化酶活性變化不同,各品種的過氧化物酶活性在輕度干旱(6 d)時大幅提高,Rp、Gr、Os、Gd的過氧化物酶活性分別比對照提高了146.9%、278.3%、138.9%、13.9%,Gr提高的最多;而在嚴(yán)重干旱(12 d)時,Rp、Gr、Os、Gd的過氧化物酶活性均高于對照,分別比對照增加了115.6%、89.1%、33.7%、4.0%(與對照無顯著差異),Rp與Gr品種增加的幅度較大(P<0.05)。但與輕度脅迫相比,4個品種的過氧化物酶活性都出現(xiàn)下降,分別比輕度干旱時下降了12.7%、50.0%、44.0%、8.7%(表3)。

過氧化氫酶活性與超氧化物歧化酶、過氧化物酶變化也不同,Rp、Gr 2個品種在輕度和嚴(yán)重干旱脅迫時,過氧化氫酶活性都出現(xiàn)降低,且活性在嚴(yán)重脅迫時遠(yuǎn)低于輕度脅迫。Rp、Gr在嚴(yán)重干旱脅迫時,過氧化氫酶活性分別比對照降低了69.5%、33.0%,比輕度脅迫降低了65.8%、18.4%。Os、Gd的過氧化氫酶活性在輕度脅迫時也出現(xiàn)降低,分別比對照降低了45.1%、40.7%,但在嚴(yán)重干旱情況時,Os、Gd的過氧化氫酶活性又出現(xiàn)上升,分別比對照提高了71.2%、6.7%(差異不顯著),比輕度脅迫時分別提高了211.9%、80.0%,差異顯著(P<0.05)。

隨著干旱脅迫時間的增加,各品種的谷胱甘肽還原酶(GR)活性呈上升趨勢。在輕度干旱脅迫時,只有Rp的谷胱甘肽還原酶活性與對照和嚴(yán)重干旱處理都存在顯著差異(P<0.05),其活性比對照提高了46.8%。而在嚴(yán)重干旱處理(12 d)時,Rp、Gr、Os、Gd的谷胱甘肽還原酶活性都顯著提高(P<0.05),分別比對照提高了108.9%、225.4%、151.6%、80.5%,Gr的活性上升幅度最大,差異非常顯著(表3)。

2.4 干旱脅迫對北美冬青品種抗氧化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由表4可見,還原型谷胱甘肽(GSH)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在輕度干旱脅迫時,只有Gr出現(xiàn)了顯著增加,比對照提高了35.6%,其他3個品種雖低于對照,但差異未達(dá)到顯著水平;在嚴(yán)重干旱脅迫(12 d)時,4個品種的還原型谷胱甘肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)都有所增加,但只有Gr、Os、Gd與對照存在顯著差異(P<0.05),分別比對照增加了274.3%、22.7%、12.2%,特別是Gr品種,增加了2.74倍,與谷胱甘肽還原酶的活性相對應(yīng)。

表4 干旱脅迫時北美冬青抗氧化劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)

在輕度干旱脅迫時,只有Os品種的抗壞血酸(AsA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加(P<0.05),比對照提高了58.7%,而其他3個品種的抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與對照不存在顯著差異;在嚴(yán)重干旱脅迫時,Gr、Os抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)都顯著高于對照和輕度脅迫處理的,分別比對照提高了174.8%、104.6%、Gr提高的最多,而Rp、Gd品種的變化不顯著(表4)。

2.5 15個指標(biāo)間的相關(guān)性分析

對干旱脅迫時的15個指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果見表5(去除相關(guān)性不顯著的數(shù)據(jù)和指標(biāo))。其中,抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與還原型谷胱甘肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、谷胱甘肽還原酶活性、H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超氧陰離子自由基質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著的正相關(guān),與葉片含水量呈極顯著的負(fù)相關(guān);谷胱甘肽還原酶活性與還原型谷胱甘肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超氧陰離子自由基質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間呈顯著的正相關(guān),與總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、葉片含水量之間呈顯著負(fù)相關(guān);還原型谷胱甘肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)與H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)和超氧陰離子自由基質(zhì)量分?jǐn)?shù)間呈正相關(guān),與葉片含水量呈負(fù)相關(guān);H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)與超氧陰離子自由基質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān),與葉片含水量呈負(fù)相關(guān);丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)與超氧陰離子自由基質(zhì)量分?jǐn)?shù)、相對電導(dǎo)率呈正相關(guān),與葉片含水量呈負(fù)相關(guān);總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈極顯著的正相關(guān)(表5)。

表5 各指標(biāo)間的相關(guān)性分析結(jié)果

2.6 4個北美冬青品種抗旱性綜合評價

采用主成分分析方法,對13個干旱性狀(葉綠素a、b質(zhì)量分?jǐn)?shù)比與類胡蘿卜素、總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比指標(biāo)沒有計入)指標(biāo)換算出的耐旱系數(shù)進(jìn)行主成分分析,將多個相關(guān)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為4個獨立的綜合指標(biāo),并對4個品種的耐旱性進(jìn)行綜合評價(表6、7)。由表6可見,對處理后的數(shù)據(jù)取大于1的特征值,可獲得4個主成分,其累計貢獻(xiàn)率達(dá)91.524%,表明4個主成分可以把13項指標(biāo)91.524%的信息表現(xiàn)出來。第一主成分特征值為6.202,貢獻(xiàn)率為47.707%,載荷較高(綜合指標(biāo)系數(shù)絕對值大于0.5)的正值指標(biāo)有超氧陰離子自由基質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.921)、還原型谷胱甘肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.859)、谷胱甘肽還原酶活性(0.775)、H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.766)、抗壞血酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.731);而過氧化物酶活性(-0.881)、總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(-0.848)、丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)(-0.744)、葉片含水量(-0.701)為負(fù)向指標(biāo),因此,第一主成分反映的是抗氧化與葉綠素方面的信息。第二主成分特征值為2.599,貢獻(xiàn)率為19.996%,載荷較高的指標(biāo)有,葉片含水量(0.683)、類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.838)、H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.580)為正值指標(biāo),過氧化氫酶活性(-0.527)為負(fù)值指標(biāo),主要反映與H2O2的作用相關(guān)的信息。第三主成分特征值為2.031,貢獻(xiàn)率為15.625%,主要指標(biāo)有超氧化物歧化酶活性(0.870)、相對電導(dǎo)率(0.793)。第四主成分特征值為1.065,貢獻(xiàn)率為8.196%,主要指標(biāo)有谷胱甘肽還原酶活性(0.545)。

表6 干旱脅迫時4個冬青品種主成分分析結(jié)果

表7 干旱脅迫時4個冬青品種綜合指標(biāo)系數(shù)

根據(jù)各主成分特征值、主成分因子得分,構(gòu)建4個北美冬青品種的綜合得分計算公式:D=0.521×U(X1)+0.218×U(X2)+0.171×U(X3)+0.090×U(X4)。4個北美冬青在干旱處理6 d(輕度干旱)時的耐旱性綜合排名從前到后依次為Gr、Rp、Gd、Os;干旱處理12 d(嚴(yán)重干旱)時的耐旱性綜合排名從前到后依次為Gr、Rp、Os、Gd。平均后耐旱性總排名順序從前到后依次為Gr、Rp、Os、Gd(表8)。

表8 干旱脅迫時4個品種耐旱性評價結(jié)果

3 討論與結(jié)論

植物耐旱性為數(shù)量遺傳性狀,受多基因調(diào)控,因此,對于耐旱性的評價,應(yīng)該用盡可能多的指標(biāo)來綜合評定,從而減少單個指標(biāo)對評定植物耐旱性所造成的片面性[18-19]。目前,植物耐逆性評價方法主要有隸屬函數(shù)平均值法[20-21]、主成分分析法[22]、灰色度關(guān)聯(lián)分析法[23]、熵值法和熵權(quán)TOPSIS法[24]等。綜合來看,主成分分析法應(yīng)用較多,更具有可靠性和普遍性。本研究通過將指標(biāo)的原始測定值換算成耐旱系數(shù),并通過主成分分析法進(jìn)行綜合評價,得出4個北美冬青的耐旱性強弱的順序依次為Gr、Rp、Os、Gd,評價結(jié)果與實際野外觀察到的相符合,可靠性較強。

植物葉片含水量和光色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)是植物生長的2個重要指標(biāo)。干旱情況時,葉片會因失水出現(xiàn)枯萎現(xiàn)象,失水少、萎縮輕的品種耐旱性更強[25]。已有研究表明,隨著干旱程度的加劇,參與光合色素代謝的基因顯著下調(diào),導(dǎo)致光合色素的降解速度超過合成速度,因而葉綠素和類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)都減少,尤以葉綠素b更為敏感[14-15]。本研究也發(fā)現(xiàn),4個品種的葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)、葉片含水量、類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)在干旱情況都出現(xiàn)了下降,特別是在嚴(yán)重干旱情況時,下降幅度更大,其中,Gr降低幅度較其他3個品種大。但從葉綠素a、b質(zhì)量分?jǐn)?shù)比可見,干旱情況時,4個品種該指標(biāo)都出現(xiàn)了顯著上升,特別是Rp與Gr上升幅度較Os、Gd大,說明干旱脅迫對北美冬青葉綠素b的影響較大,而對主要色素葉綠素a的影響較小,即干旱對Rp和Gr的傷害低于Os和Gd。類胡蘿卜素具有保護(hù)葉綠素、提高抗氧化能力的作用[6],本研究中還發(fā)現(xiàn),干旱脅迫提高了各品種的類胡蘿卜素、總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比,表明類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)較葉綠素降低的程度低,仍然是Rp與Gr品種上升的幅度較大,說明Rp與Gr抵抗力較Os、Gd強。這些結(jié)果與北美冬青、豇豆(Pisumsativum)和文冠果(Xanthocerassorbifolium)等在干旱處理的結(jié)果相一致[3,15,26]。

植物干旱傷害的最初和關(guān)鍵部位是膜系統(tǒng),而相對電導(dǎo)率(REC)與膜脂過氧化產(chǎn)物是判定植物受逆境脅迫損傷程度的重要評價指標(biāo),在某種程度上,相對電導(dǎo)率和膜脂過氧化產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高的植物耐旱性較弱[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn),嚴(yán)重干旱脅迫時,4個品種的相對電導(dǎo)率和丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)都比對照出現(xiàn)了顯著增加,其中,Os、Gd的相對電導(dǎo)率和丙二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加百分率都高于Rp、Gr,說明干旱對Rp、Gr的細(xì)胞膜傷害低于Os、Gd,即Rp、Gr具有較強的抗氧化能力。