中美歐食品中沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的比較分析

丁衛(wèi)平 張士財(cái) 伊廷存

摘 要：沙門氏菌是一種重要的食源性致病菌，與食品安全及人類健康息息相關(guān)。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是沙門氏菌鑒定的基礎(chǔ)與依 據(jù)。為給我國(guó)現(xiàn)行食品沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考依據(jù)，使我國(guó)食品中沙門氏菌的檢測(cè)更加科學(xué)準(zhǔn)確，本文收集了中 國(guó)、美國(guó)及歐洲的食品沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，從適用范圍、預(yù)增菌、選擇性增菌、平板分離、鑒定等方面進(jìn)行了系統(tǒng)比較分析。 結(jié)果表明，我國(guó)沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)與歐洲所使用標(biāo)準(zhǔn)較為相似，與美國(guó)所使用標(biāo)準(zhǔn)差別較大，建議在我國(guó)食品沙門氏菌檢 驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的制修訂過(guò)程中，借鑒國(guó)外同類型標(biāo)準(zhǔn)先進(jìn)經(jīng)驗(yàn)，完善改進(jìn)我國(guó)沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，滿足實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)需要。

關(guān)鍵詞：食品，沙門氏菌，檢驗(yàn)，方法，比較

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.03.034

0 引 言

沙門氏菌為革蘭氏陰性桿菌，是一種重要的食 源性致病菌[1]，廣泛分布于奶和奶制品、肉與肉制 品、蛋及蛋制品等食物中[2-4]。感染沙門氏菌的食品 被人類食用后，可導(dǎo)致腸胃炎、傷寒、副傷寒[5]，呈現(xiàn) 發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀[6-7]，癥狀嚴(yán)重的甚至 會(huì)使患者死亡。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界各國(guó)的細(xì)菌性食物中毒中，由沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首，其中 就包括中國(guó)[8]。因此，對(duì)食品中是否存在沙門氏菌進(jìn) 行準(zhǔn)確鑒定具有十分重要的意義。對(duì)于沙門氏菌的 鑒定，中美歐分別采用了不同的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。中國(guó)所采 用的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為GB 4789.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[9]。美國(guó)所采 用的的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA） 所制定的細(xì)菌分析學(xué)手冊(cè)（Bacteriological Analytical Manual，簡(jiǎn)稱BAM）第八版[10]，其最新版本為2023年 4月份修訂版本。歐盟所采取的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn) 化組織（International Organization for Standardization， 簡(jiǎn)稱ISO）制定的ISO 6579-1：2017《食物鏈微生物 學(xué)沙門氏菌檢測(cè)、計(jì)數(shù)和血清分型的水平方法第 1部分：沙門氏菌的檢測(cè)》（Microbiology of the food chain - Horizontal method for the detection， enumeration and serotyping of Salmonella - Part 1： Detection of Salmonella spp.）[11]，ISO 6579-1：2017現(xiàn)行版本為2020 年修訂版本，用ISO 6579-1：2017+A1：2020表示。 GB 4789.4—2016從正式實(shí)施至今已有7年多的 時(shí)間，當(dāng)前正在開展標(biāo)準(zhǔn)修訂前的各項(xiàng)準(zhǔn)備工作。 美歐作為發(fā)達(dá)國(guó)家的代表，深入分析沙門氏菌檢驗(yàn) 標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)我國(guó)沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的修訂具有重要的 意義。本研究針對(duì)此問(wèn)題，對(duì)中美歐所使用沙門氏 菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的相同點(diǎn)與不同點(diǎn)進(jìn)行了深入比較與分 析，并提出了有針對(duì)性的意見建議。

1 三種檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的相同之處

中美歐三種檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的鑒定步驟都可以分為 四步，即前增菌或稱預(yù)增菌、選擇性增菌、平板分 離、鑒定，雖然三種標(biāo)準(zhǔn)每一步的具體操作有所不 同，但大致都可以分為這四個(gè)步驟。

2 三種檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的不同之處

對(duì)于三種檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的不同之處，從以下6個(gè)方 面進(jìn)行逐項(xiàng)分析。

2.1 適用范圍

GB 4789.4—2016第一部分范圍中規(guī)定該標(biāo)準(zhǔn) 適用于食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)，但由于我國(guó)僅對(duì)預(yù) 包裝食品及散裝即食食品中的沙門氏菌規(guī)定了限 量[12-13]，因此在實(shí)際檢驗(yàn)中，此標(biāo)準(zhǔn)主要用于預(yù)包 裝食品及散裝即食食品的檢驗(yàn)。

ISO 6579-1：2017中規(guī)定了該標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍， 主要包括供人類食用或動(dòng)物飼養(yǎng)的產(chǎn)品、在食品生 產(chǎn)和處理范圍內(nèi)的環(huán)境樣品、初級(jí)生產(chǎn)階段的樣品 如動(dòng)物糞便、灰塵和棉簽。

FDA細(xì)菌分析學(xué)手冊(cè)第8版未明確規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)的 適用范圍，但從該標(biāo)準(zhǔn)的第C部分內(nèi)容中可以知道 該標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍不僅包括27類食品及食品添加 劑，還包括食品周邊環(huán)境及苜蓿、綠豆和西蘭花等 作物的發(fā)芽灌溉用水。

2.2 預(yù)增菌

GB 4789.4—2016預(yù)增菌過(guò)程為無(wú)菌操作稱取 25 g或25 mL樣品，置入盛有225 mL緩沖蛋白胨水 （BPW）的無(wú)菌均質(zhì)杯或合適容器內(nèi)均質(zhì)后，再于 36℃±1℃培養(yǎng)8 h～18 h。

ISO 6579-1：2017規(guī)定，最常用的預(yù)增菌過(guò)程 為稱取25 g樣品，加入225 mL BPW 10倍稀釋均質(zhì) 后進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為34℃～38℃培養(yǎng)18 h±2 h。 低于25 g的樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)按比例加入BPW達(dá)10 倍稀釋即可，超過(guò)25 g的樣品及混合樣品根據(jù)此方 法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需要分別按照ISO 16140及ISO 6887- 1：2017附錄D的規(guī)定進(jìn)行方法驗(yàn)證。靴襪及灰塵的 稀釋比例不是10倍，具體要求參照ISO 6887。樣品 量大BPW使用量超過(guò)1 L時(shí)，在與樣品混合前，需預(yù) 先將BPW加熱至34℃～38℃。ISO 6579-1：2017還規(guī) 定，預(yù)增菌液可在5℃最多保存72 h。

FDA細(xì)菌分析學(xué)手冊(cè)第8版中沙門氏菌檢測(cè)的 預(yù)增菌方法是這3種標(biāo)準(zhǔn)中最為復(fù)雜的，其應(yīng)用范 圍內(nèi)的29類產(chǎn)品預(yù)增菌方法都不相同，用到的預(yù) 增菌液類型多達(dá)10種，在預(yù)增菌正式培養(yǎng)之前還需要進(jìn)行各種各樣的預(yù)處理，伴隨著各種添加劑 的適用。進(jìn)行預(yù)增菌時(shí)，樣品稀釋比例通常為25 g （或mL）樣品中加入225 mL液體培養(yǎng)基。樣品量 低于或高于25 g（或mL）時(shí)，根據(jù)樣品量調(diào)整液體 培養(yǎng)基的量，使樣品達(dá)到10倍稀釋。部分樣品的 稀釋比例非10倍，如香料中的多香果、肉桂和牛至 稀釋比例為1：100；丁香稀釋比例為1：1000。雖然 不同產(chǎn)品的預(yù)增菌方法有所不同，但預(yù)增菌的培 養(yǎng)條件基本保持一致，大多要求35℃培養(yǎng)24 h±2 h，少量產(chǎn)品要求35±2℃培養(yǎng)24 h±2 h。值得注 意的是，該方法中還規(guī)定，動(dòng)物性食品預(yù)增菌后， 可以直接用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，簡(jiǎn)稱LAMP）進(jìn)行篩查， 僅LAMP篩查結(jié)果為陽(yáng)性的需要對(duì)其預(yù)增菌液進(jìn) 行進(jìn)一步檢測(cè)。

2.3 選擇性增菌

GB 4789.4—2016規(guī)定的選擇性增菌過(guò)程為 移取1 mL預(yù)增菌液，轉(zhuǎn)種于10 mL 四硫磺酸鈉煌綠 （TTB）內(nèi)，于42℃±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。同時(shí)，另取 1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL 亞硒酸鹽胱氨酸（SC）內(nèi)，于 36℃±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。

ISO 6579—1：2017規(guī)定，對(duì)于食品、動(dòng)物飼料 樣品、食品生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境樣品，其選擇性增菌過(guò) 程為取預(yù)增菌液0.1mL轉(zhuǎn)種到含10mL Rappaport[1]Vassiliadis Enrichment Broth（RVS）肉湯的試管中或 Modified Semi-Solid Rappaport-Vassiliadis（MSRV） 瓊脂平板表面（等距接種1至3個(gè)點(diǎn)），于41.5℃培 養(yǎng)24h±3h。同時(shí)取預(yù)增菌液1mL轉(zhuǎn)移到Muller[1]Kauffmann Tetrathionate- novobiocin（MKTTn）肉湯 中，于34℃～38℃之間培養(yǎng)24 h±3 h。在干奶制品或 奶酪中，沙門氏菌可能會(huì)受到致命的傷害，檢測(cè)這些 產(chǎn)品時(shí)，選擇性培養(yǎng)基需要額外培養(yǎng)24 h±3 h。還 有一點(diǎn)需要注意的是，MSRV瓊脂用于檢測(cè)具有動(dòng)力 的沙門氏菌，不適用于無(wú)動(dòng)力沙門氏菌株。初級(jí)生 產(chǎn)階段樣品的選擇性增菌需要取0.1 mL預(yù)增菌液轉(zhuǎn) 移到MRSV瓊脂平板進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為41.5℃培 養(yǎng)24 h±3 h，標(biāo)準(zhǔn)中還說(shuō)明如果使用第2種選擇性培 養(yǎng)基比如MKTTn培養(yǎng)24 h檢測(cè)靈敏度能得以改善。

FDA細(xì)菌分析學(xué)手冊(cè)第8版中規(guī)定，對(duì)于瓜爾 豆膠和懷疑受鼠傷寒沙門氏菌污染的食品，其選擇 性增菌過(guò)程為分別取1毫升預(yù)增菌液轉(zhuǎn)種至10 mL SC和10 mL TTB培養(yǎng)基，并在35℃培養(yǎng)24 h±2 h。 其他所有食品的預(yù)增菌過(guò)程則為，將0.1 mL預(yù)增菌 液轉(zhuǎn)種至10 mL Rappaport-Vassiliadis（RV）培養(yǎng)基， 于42℃±0.2℃條件下培養(yǎng)24 h±2 h；同時(shí)另取1 mL 預(yù)增菌液轉(zhuǎn)種至10 mL TTB培養(yǎng)基，這些食品中微 生物負(fù)荷量高的食物，轉(zhuǎn)種至TTB培養(yǎng)基后需要在 43℃±0.2℃條件下培養(yǎng)24 h±2 h，微生物負(fù)荷量低 的食物轉(zhuǎn)種至TTB培養(yǎng)基后則需要在35℃±2.0℃條 件下培養(yǎng)24 h±2 h。

2.4 平板分離

GB 4789.4—2016規(guī)定，取培養(yǎng)后的TTB及SC選 擇性增菌液，分別劃線接種于亞硫酸鉍（BS）瓊脂 平板和木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂平板（或 Hektoen Enteric（HE）瓊脂平板或沙門氏菌屬顯色培 養(yǎng)基平板），其中BS 瓊脂平板需要在36℃±1℃培養(yǎng) 40 h～48 h，XLD 瓊脂平板、HE 瓊脂平板、沙門氏菌 屬顯色培養(yǎng)基平板需要在36℃±1℃培養(yǎng)18 h～24 h。

ISO 6579-1：2017規(guī)定，對(duì)于食品、動(dòng)物飼料樣 品、食品生產(chǎn)區(qū)域環(huán)境樣品，其分離步驟為，用接種 環(huán)從RVS增菌液或MSRV瓊脂平板及MKTTn增菌液 中蘸取一環(huán)后，接種至XLD平板及另外一種選擇性 平板中，另外一種選擇性平板要與XLD瓊脂平板互 補(bǔ)且與XLD判別原理不同。XLD平板的培養(yǎng)條件為 34℃～38℃培養(yǎng)24 h±3 h。對(duì)于初級(jí)生產(chǎn)階段的樣 品，則用接種環(huán)取MSRV瓊脂平板上的菌落接種至 XLD平板及第二種選擇性平板。XLD平板的培養(yǎng)條 件也為34℃～38℃培養(yǎng)24 h±3 h。初級(jí)生產(chǎn)階段的 樣品在MSRV瓊脂平板初次培養(yǎng)未生長(zhǎng)菌落時(shí)，需 要再額外培養(yǎng)24 h±3 h。

FDA細(xì)菌分析學(xué)手冊(cè)第8版中規(guī)定，TTB與RV/SC 培養(yǎng)基中培養(yǎng)的增菌液都需要分別劃線接種到BS、XLD、HE三種瓊脂平板上后于35℃培養(yǎng)24 h±2 h。

2.5 鑒定

GB 4789.4—2016中規(guī)定，對(duì)于選擇性瓊脂平 板上生長(zhǎng)的典型和可疑菌落，需要進(jìn)行生化鑒定及 血清學(xué)鑒定，可以自主選做血清學(xué)分型。做生化鑒 定時(shí)，既可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的方法逐步開展，也 可以根據(jù)三糖鐵瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)結(jié)果選 擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng) 進(jìn)行鑒定。血清學(xué)鑒定時(shí)，要先檢查培養(yǎng)物有無(wú)自 凝性，再對(duì)無(wú)自凝現(xiàn)象的培養(yǎng)物進(jìn)行多價(jià)菌體抗原 及多價(jià)鞭毛抗原鑒定。

與GB 4789.4—2016中的規(guī)定相似，ISO 6579- 1：2017中也規(guī)定，對(duì)于選擇性瓊脂平板上生長(zhǎng)的典 型和可疑菌落，需要進(jìn)行生化鑒定及血清學(xué)鑒定， 可以自主選做血清學(xué)分型。進(jìn)行生化鑒定時(shí)既可以 按照ISO 6579-1：2017規(guī)定的方法進(jìn)行，也可以使用 經(jīng)驗(yàn)證的商業(yè)化的培養(yǎng)基或生化鑒定試劑盒。ISO 6579-1：2017規(guī)定的生化鑒定方法及判定方法較為 簡(jiǎn)單，三糖鐵瓊脂試驗(yàn)、尿素瓊脂試驗(yàn)、賴氨酸脫 羧酶試驗(yàn)屬于必做項(xiàng)目，如果這三項(xiàng)試驗(yàn)無(wú)法給 出明確的鑒定結(jié)果，可以再做另外兩項(xiàng)生化試驗(yàn)。 ISO 6579-1：2017還規(guī)定，進(jìn)行血清學(xué)鑒定時(shí)，要 先排除能夠引發(fā)自凝現(xiàn)象的菌株，再進(jìn)行多價(jià)O抗 原、Vi抗原及多價(jià)H抗原鑒定，其中Vi抗原鑒定屬 于選做項(xiàng)目。

FDA細(xì)菌分析學(xué)手冊(cè)第8版中規(guī)定，與對(duì)照菌 株培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行比對(duì)后，對(duì)于BS、XLD、HE三種瓊 脂平板上生長(zhǎng)的可疑性菌落，要先進(jìn)行三糖鐵瓊脂 試驗(yàn)及賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)，對(duì)于這兩種試驗(yàn)中被 推定為沙門氏菌的培養(yǎng)物再進(jìn)行進(jìn)一步生化鑒定 及血清學(xué)鑒定。此方法中生化鑒定方法比較繁瑣， 不再詳述。此標(biāo)準(zhǔn)中血清學(xué)鑒定方法主要包括三 種，即多價(jià)鞭毛血清學(xué)試驗(yàn)、Spicer-Edwards血清學(xué) 試驗(yàn)及血清學(xué)體細(xì)胞（O）試驗(yàn)。初步生化試驗(yàn)結(jié) 果及血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果中未表現(xiàn)出典型沙門氏菌反 應(yīng)的菌落需要進(jìn)一步用補(bǔ)充生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。值 得注意的是，在本方法中還指出，以下幾種方法是 公認(rèn)的通用的沙門氏菌的鑒定方法，包括上述三種 血清學(xué)試驗(yàn)方法、5種商業(yè)生化系統(tǒng)鑒定方法、實(shí) 時(shí)定量PCR方法、LAMP方法、ANSR 沙門氏菌確 定方法、布魯克飛行時(shí)間質(zhì)譜生物分型法。在本方 法中還規(guī)定，通過(guò)生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)方法鑒定 出沙門氏菌后，可送往特定實(shí)驗(yàn)室通過(guò)全基因組測(cè) 序、seqsero數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析或傳統(tǒng)血清學(xué)分型方法 進(jìn)行血清分型。

2.6 修訂次數(shù)

GB 4789.4—2016自2017年6月23日實(shí)施以來(lái)， 尚未進(jìn)行過(guò)修訂。ISO 6579-1：2017自2017年實(shí)施以 來(lái)，于2020年修訂過(guò)一次。FDA細(xì)菌分析學(xué)手冊(cè)第8 版自2000年11月14日正式定稿以來(lái)，到目前為止，已 經(jīng)進(jìn)行了28次修訂。

3 結(jié) 論

從中美歐三種沙門氏菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的分析中可 以看出，GB 4789.4—2016與ISO 6579-1：2017兩個(gè) 標(biāo)準(zhǔn)有諸多的相似之處，與FDA細(xì)菌分析學(xué)手冊(cè) 第8版的差異較大。這三種標(biāo)準(zhǔn)中，F(xiàn)DA細(xì)菌分析 學(xué)手冊(cè)第8版沙門氏菌的檢驗(yàn)方法令人感觸頗深， 具有3個(gè)極為明顯的特點(diǎn)。第一個(gè)特點(diǎn)是方法規(guī)定 最為細(xì)致，根據(jù)不同食品樣本的特點(diǎn)制定了不同的 前增菌方法，這樣可以最大程度地使樣品中的目標(biāo) 菌得以增殖，提高預(yù)增菌效率，減少漏檢；第二個(gè) 特點(diǎn)是對(duì)新技術(shù)的應(yīng)用最多，廣泛地將現(xiàn)代科學(xué) 技術(shù)的最新成果應(yīng)用于沙門氏菌的鑒定，明確了全 自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)、實(shí)時(shí)定量PCR方法、LAMP方 法、ANSR 沙門氏菌確定方法、飛行時(shí)間質(zhì)譜生物 分型法、全基因組測(cè)序等新型鑒定技術(shù)在沙門氏菌 鑒定中的作用；第三個(gè)特點(diǎn)是更新速度快，自2000 年11月14日正式定稿以來(lái)，到目前為止已經(jīng)進(jìn)行了 28次修訂。

GB 4789.4是國(guó)家基礎(chǔ)標(biāo)準(zhǔn)，使用者眾多，影響范圍廣，在國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)體系中有著非常重要的地位。

標(biāo)準(zhǔn)制定機(jī)構(gòu)應(yīng)及時(shí)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，使標(biāo)準(zhǔn)符合 用戶需求與時(shí)代發(fā)展。在標(biāo)準(zhǔn)的修訂過(guò)程中，建議 從以下三個(gè)方面努力，做好修訂工作。一是要加強(qiáng) 研究，完善標(biāo)準(zhǔn)細(xì)節(jié)。要對(duì)方法中涉及的培養(yǎng)基、 培養(yǎng)條件、試劑等開展詳細(xì)科學(xué)的研究，確定最優(yōu) 條件。二是要加大現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的應(yīng)用力度。近年 來(lái)，迅速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)在微生物檢測(cè)方面 具有鑒定速度快、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)，應(yīng)加大這些新 技術(shù)的運(yùn)用力度。三是要加快標(biāo)準(zhǔn)修訂速度。應(yīng)創(chuàng) 新體制機(jī)制，改善標(biāo)準(zhǔn)修訂流程，縮短標(biāo)準(zhǔn)修訂時(shí) 間。

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作者簡(jiǎn)介

丁衛(wèi)平，高級(jí)工程師，分子生物測(cè)定室主任，研究方向?yàn)槭?品檢驗(yàn)檢測(cè)。

張士財(cái)，工程師，食品檢驗(yàn)員，研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)檢測(cè)。

（責(zé)任編輯：袁文靜）