肺泡類器官在慢性阻塞性肺疾病中的應用及研究進展

樊霏霏 楊明夏

肺是一個復雜的器官,由高度分支的氣道和肺泡兩部分組成,參與重要的生理過程,其細胞及組織的復雜性保證了肺的免疫防御和氣體交換功能[1]。肺泡主要由肺泡Ⅰ型上皮細胞(alveolar type Ⅰ cells,ATⅠ)和肺泡Ⅱ型上皮細胞(alveolar type Ⅱ cells,ATⅡ)構成。ATⅠ參與構成氣-血屏障,ATⅡ的主要功能是分泌表面活性物質(zhì),降低肺泡表面張力,以維持肺泡的正常形態(tài)[2]。肺的發(fā)育過程十分復雜,任何階段的發(fā)育失敗或缺陷都可能導致疾病甚至死亡[3]。在肺發(fā)育成熟后,內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定時,細胞的更新率很低,呼吸道祖細胞處于靜止狀態(tài),在面對各種損傷性刺激時祖細胞可增殖分化以應對環(huán)境的變化[4],這種能力引起了研究者的關注,為肺部疾病的研究及治療提供了新思路。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以持續(xù)存在的氣流受限為特征的慢性疾病,可進一步發(fā)展為肺心病和呼吸衰竭,氣流受限呈進行性發(fā)展[5],與氣道對有毒顆?；驓怏w的炎性反應增強有關[6]。慢阻肺的致殘率和病死率逐年上升,根據(jù)2022年的慢性阻塞性肺疾病全球倡議指南,慢阻肺是目前全球三大死亡原因之一,是未來慢性病的主要經(jīng)濟負擔[7]。慢阻肺具有進行性、不可逆的特征,患者長期咳嗽、喘息,可逐漸演變?yōu)榉涡牟?最后累及全身各個系統(tǒng)[8]。臨床上的治療方法主要包括非藥物治療、藥物治療、氧療等來改善患者的生活質(zhì)量[9]。然而,這些治療方式并不能解決根本問題,肺泡類器官的出現(xiàn)為慢阻肺的精準治療提供了新思路。本文對肺泡類器官近年來的發(fā)展及其在慢阻肺相關研究中的應用進行總結,為今后的研究提供理論依據(jù)。

一、類器官

類器官來源于干細胞,是指細胞在體外通過3D培養(yǎng)生長形成的高度模擬體內(nèi)生理病理狀態(tài)的組織培養(yǎng)物,可分化為特定的器官結構[10]。以胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)、誘導多能干細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)和組織特異性干細胞在特定三維空間中構建出的類器官最常被用于體外的研究[11]。目前已經(jīng)有包括肝臟、腎臟、乳腺、前列腺和腫瘤等多種人體組織和器官成功構建了類器官[12-14],這些類器官具有與原始器官相似的組織結構和生理功能,近年來逐漸用于疾病建模[15]、再生醫(yī)學[16]和發(fā)育過程[17]的研究,也可以作為藥物篩選[18]的工具,并為不可逆病變或損傷的替代治療[19]提供了可能。

二、肺泡類器官的構建及優(yōu)越性

人類肺臟由氣管、支氣管和細支氣管構成氣道,進行氣體交換的肺泡由Ⅰ型肺泡上皮細胞和Ⅱ型肺泡上皮細胞以及血管系統(tǒng)構成。肺泡類器官培養(yǎng)的基礎源自于Ⅱ型肺泡上皮細胞具有多能干細胞特性[20]。在慢阻肺的發(fā)展過程中,肺泡結構會發(fā)生不同程度的病變,ATⅡ能增殖、分化修復受損的ATⅠ,維持肺泡上皮細胞正常結構和功能[21]。肺泡類器官是指肺干細胞在3D培養(yǎng)下形成的類似于肺泡結構的組織培養(yǎng)物,表達肺泡上皮細胞標志物并包含部分肺間充質(zhì)細胞[22]。目前肺泡類器官已應用于多種肺泡病變的疾病并取得研究進展[23-25]。肺泡類器官培養(yǎng)體系除了包含具有干細胞特性的Ⅱ型肺泡上皮細胞,還需要添加其他共培養(yǎng)的細胞及細胞因子。目前肺泡類器官的培養(yǎng)常在DMEM/F12等基礎培養(yǎng)基中添加有利于干細胞增殖分化的細胞因子如成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)等[26],研究者需要根據(jù)培養(yǎng)目的確定細胞因子的種類和用量。此外,類器官3D結構的形成嚴重依賴于細胞外基質(zhì),目前最為廣泛使用的是基質(zhì)膠,這種基質(zhì)通?；瘜W成分定義不清,并且可調(diào)性和可重復性有限[27],近期發(fā)現(xiàn)的一種基質(zhì)透明質(zhì)酸水凝膠,其物理和生化性質(zhì)可精確調(diào)整,并且可以有效改善肺泡類器官的不均一性[28],為肺泡類器官發(fā)育成熟提供了更多的可能。近期有文獻報道運用支架材料有望解決肺類器官結構大小不一的問題[29],進一步完善類器官的培養(yǎng)體系是亟待解決的問題。

在進行疾病研究時,研究者以往常常通過體外培養(yǎng)細胞并施加一定的刺激或構建動物模型模擬人體來展開研究,但體外培養(yǎng)環(huán)境和人體內(nèi)環(huán)境存在差異,且不能準確反應各因素在組織和器官水平上對疾病的影響。構建動物疾病模型可以在一定程度上模擬疾病作用于人體的癥狀和機制,但動物與人的器官結構上存在差異[30]。構建類器官疾病模型可以彌補上述不足,來源細胞可通過多種方式從人體分離獲取,如AT2細胞可以通過流式細胞熒光分選技術(fluorescence activated cell sorting,FACS)或磁珠分選技術(magnetic bead sorting,MACS)經(jīng)過單克隆抗體HTII280進行分離[31],可快速高效培養(yǎng)出大量的類器官疾病模型。與構建完整的肺部類器官相比,肺泡類器官肺泡的結構更為精細,更加適用于慢阻肺、肺纖維化等肺泡病變的肺部疾病,且在特異性藥物篩選方面具有優(yōu)勢。肺泡類器官幫助我們進一步了解人體肺泡結構及發(fā)育過程中的變化,而肺泡重建是我們研究肺再生中的重要一步,研究各個危險因素作用于肺泡造成的損傷有助于我們發(fā)現(xiàn)疾病治療的潛在靶點,因此,肺泡類器官作為新型疾病模型在肺泡病變的疾病研究中具有優(yōu)越性。

三、肺泡類器官在慢阻肺相關機制研究中的應用

慢性阻塞性肺疾病的特征是慢性氣道炎癥、氣道重塑以及肺泡組織的損傷,即肺氣腫[32]。慢阻肺的發(fā)生發(fā)展與各種遺傳因素和環(huán)境因素有關,吸煙是最主要的危險因素之一[33]。長期暴露于香煙煙霧(cigarette smoke,CS)會導致肺出現(xiàn)慢性炎癥、氧化應激失衡和上皮細胞受損,肺不能修復這些損傷,從而導致肺氣腫,受損的肺組織修復,特別是受損的肺泡上皮細胞修復過程進一步促進了肺氣腫的發(fā)展和進展[34],但其機制尚不清楚。

研究者常用香煙煙霧以及香煙提取物(cigarette smoke extract,CSE)刺激構建慢阻肺疾病模型。已有研究證實,COPD患者發(fā)生肺氣腫時肺上皮細胞中Wnt/β-catenin信號通路表達受到抑制[35],一項研究使用GSK-3β抑制劑氯化鋰激活Wnt/β-catenin信號通路,可使肺氣腫逆轉[36],更為重要的是,該抑制劑可使COPD患者來源的肺泡類器官中的肺泡上皮細胞激活[37]。另一項研究在體外3D原代培養(yǎng)AT2細胞并構建肺泡類器官,研究香煙煙霧對WNT信號下游的特異性受體卷曲蛋白-4(FZD4)、Wnt/β-catenin信號通路和肺彈性成分的影響,通過上調(diào)和下調(diào)FZD4的表達研究FZD4的表達對肺泡上皮細胞傷口愈合、修復及彈性成分表達的影響,該研究顯示香煙煙霧可下調(diào)FZD4,從而降低Wnt/β-catenin信號通路的表達,阻止COPD中的肺泡組織修復[38]。這些數(shù)據(jù)表明,通過靶向作用于肺組織中的Wnt受體促進Wnt信號通路的表達,可能會改善肺泡上皮細胞功能,從而為COPD患者的組織修復提供了一種潛在的方法。NgBlichfeldt等[39]人的研究發(fā)現(xiàn)慢阻肺疾病患者WNT5A、WNT5B表達增加、FZD4表達降低與肺間質(zhì)成纖維細胞分化為肌成纖維細胞有關,肌成纖維細胞不僅能抑制Wnt信號通路,還能下調(diào)HGF、FGF7的表達,兩者協(xié)同進一步加重上皮損害。因此,一些研究者將治療靶點聚焦于激活Wnt信號通路。一項研究合成非選擇性Rho卷曲螺旋形成相關蛋白激酶抑制劑,發(fā)現(xiàn)能有效逆轉上述情況,促進肺泡類器官的形成[40]。目前還沒有針對慢阻肺發(fā)病機制的治療方法,因此發(fā)現(xiàn)新的治療靶點對誘導慢阻肺患者肺損傷修復十分重要,肺泡類器官的發(fā)展為相關研究提供了新平臺。

一項研究將小鼠長期暴露于CS構建慢阻肺模型,分離細胞培養(yǎng)肺泡類器官來探索序列相似成員13A家族(family with sequence similarity 13 member A,FAM13A)基因的表達對慢阻肺的作用。結果顯示暴露于香煙煙霧時FAM13A表達缺失,AT2細胞中WNT通路激活,相比于FAM13A表達增加的小鼠肺細胞發(fā)育出更多肺泡類器官[41]。Lin等[42]通過體外 培養(yǎng)小鼠原代AT2細胞構建肺泡類器官,并給予不同濃度CSE刺激,發(fā)現(xiàn)在達到毒性濃度之前,增加CSE的濃度可促進ATⅡ增殖分化,并抵抗凋亡,促進類器官的形成?？諝馕廴臼锹璺蔚闹匾ｋU因素,一些研究者構建肺泡類器官并引入污染氣體研究其對肺泡的損傷機制。一項研究在肺泡類器官的培養(yǎng)基中加入PM2.5引起肺泡損傷,研究發(fā)現(xiàn)AT2增殖能力增強但修復能力受損,且ATⅠ與ATⅡ細胞數(shù)量的比值明顯下降,結果表明抑制了ATⅡ細胞轉分化[43]。使用柴油廢氣處理肺泡類器官2周,發(fā)現(xiàn)類器官明顯減少,并與Wnt信號通路抑制有關[44]。隨著慢阻肺病情進展,患者肺泡上皮細胞的修復功能進行性損傷促進了肺氣腫的發(fā)生發(fā)展,利用肺泡類器官研究肺泡上皮細胞的發(fā)生發(fā)展及轉分化機制為肺再生的進一步發(fā)展帶來了希望。

四、慢阻肺治療藥物的篩選

藥物治療是慢阻肺治療中極為重要的一環(huán),在傳統(tǒng)的藥物實驗中,研究者大多在體外培養(yǎng)細胞系或動物模型中,但這兩種模型都具有局限性。而類器官在藥物篩查及研究方面具備高特異性的特點[45],與其他模型相比具有獨特的組織同源性,能更真實反映疾病狀態(tài)并檢測藥物效應。NgBlichfeldt[46]等人在體外原代培養(yǎng)小鼠和人的肺泡上皮細胞并構建肺泡類器官,研究維甲酸對肺部疾病的作用機制,維甲酸在臨床上廣泛應用于肺部疾病,但治療效果并不理想。這項研究發(fā)現(xiàn),維甲酸抑制劑能激活YAP信號通路及上皮-間質(zhì)細胞間的FGF信號通路,上調(diào)AT2,而激活維甲酸相關通路能促進AT2分化為AT1,這一研究提示暫時性抑制維甲酸信號通路可能促進肺泡上皮細胞的修復。另一項研究構建肺泡類器官進行藥物篩選發(fā)現(xiàn)氨來占諾可作為Wnt/β-catenin通路激活劑促進肺泡類器官生成,同時可改善肺氣腫小鼠的肺功能[47],對臨床用藥的發(fā)展具有指導意義。根據(jù)美國食品藥品監(jiān)督管理局的數(shù)據(jù)顯示,有高達90%的藥物經(jīng)動物實驗檢測被認為安全有效后在臨床試驗中失敗,其原因主要是具有毒性或未實現(xiàn)預期的效果[48]。因此,構建能夠直接預測人類反應的模型十分重要,可更為準確的評估藥效及毒性。在體外構建人類肺泡類器官,可彌補細胞模型和動物模型的缺陷,為快速有效篩選慢性阻塞性肺疾病的治療藥物提供新思路。

五、肺泡類器官在慢阻肺中的應用前景

類器官是構建疾病模型及研究器官再生的有利工具,相比與傳統(tǒng)的細胞模型和動物模型具有優(yōu)越性,可以減少動物在疾病研究中的使用。肺泡類器官在慢阻肺發(fā)病機制研究、尋找新的治療靶點及藥物篩選等方面具有巨大的應用潛力,但也具有局限性。目前構建的人肺泡類器官包含多種肺泡上皮細胞,缺乏血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞及免疫細胞,未重視微環(huán)境對其發(fā)生發(fā)展的影響[49],不能完全模擬肺臟,該模型體外培養(yǎng)需要較長的時間,且細胞并未完全分化,需要在體內(nèi)進一步生長、分化。另外,肺泡類器官目前尚無標準化培養(yǎng)方案,使用化學成分不明的細胞外基質(zhì)會影響細胞的生長發(fā)育,最新的研究發(fā)現(xiàn)添加其他種類的外源性細胞可提高類器官模型的準確性[50],未來仍需進一步探索。

類器官的發(fā)展極大推動了疾病的研究,隨著類器官培養(yǎng)技術的完善,研究者可以構建更為準確的人類器官模型,也可以對正常狀態(tài)的類器官施加刺激,模擬致病因素對器官結構、功能的影響。肺泡類器官為疾病在肺泡結構層面的病理生理變化、發(fā)病機制和相關信號通路提供了新的研究方法,有助于針對各疾病的相應靶點篩選有效藥物從而進一步推進臨床試驗研究。隨著各種類器官的培養(yǎng)技術不斷標準化,這種模型將被更多的運用在基礎研究中,未來技術成熟后,可對不同患者提取病變部位的干細胞,培養(yǎng)對應的類器官而后制定個性化治療方案,為研究個體對治療的反應和個性化用藥開辟新途徑。