基于脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路探討侯氏黑散治療腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究

楊毅 李若冰 黃麗娜 王博 蔣希成*

本文引用： 楊? 毅， 李若冰， 黃麗娜， 王? 博， 蔣希成. 基于脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路探討侯氏黑散治療腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究[J]. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)， 2024， 44（4）： 675-688.

〔摘要〕 目的 利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證分析《金匱要略》侯氏黑散治療腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）的成分、靶點(diǎn)及信號(hào)通路，并通過(guò)脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路研究其作用機(jī)制。方法 在TCMIP、GeneCards和OMIM疾病數(shù)據(jù)庫(kù)獲取侯氏黑散與CIRI的交集靶點(diǎn)，使用STRING網(wǎng)站構(gòu)建交集靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape軟件篩選核心靶點(diǎn)和成分并構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。使用R語(yǔ)言進(jìn)行GO和KEGG富集分析，使用AutoDock Vina驗(yàn)證成分與靶點(diǎn)的對(duì)接能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中將60只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、西藥組和侯氏黑散低、中、高劑量組。用線栓法制備大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）大鼠模型，造模7 d后通過(guò)改良神經(jīng)功能評(píng)分（modifiedneurological severity score，mNSS）評(píng)估神經(jīng)功能，TTC染色檢測(cè)腦梗死體積，HE染色觀察腦組織病理變化，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（how density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglycerides，TG）含量，ELISA檢測(cè)血清白介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，免疫組織化學(xué)和RT-qPCR檢測(cè)腦組織中HSP90AA1、NF-κB1、SRC的蛋白及mRNA表達(dá)水平。結(jié)果 從侯氏黑散中篩選得到508種有效成分及549個(gè)藥物靶標(biāo)，1 592個(gè)CIRI疾病靶點(diǎn)，交集靶點(diǎn)共153個(gè)，核心靶點(diǎn)為HSP90AA1、SRC、NF-κB1，與棕櫚酸、三磷酸腺苷、穿貝海綿甾醇、腺苷等核心成分均具有較強(qiáng)的結(jié)合力。GO富集分析的生物過(guò)程主要涉及對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、位置維護(hù)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等，KEGG通路分析主要富集在脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、cAMP信號(hào)通路、花生四烯酸代謝等。與模型組相比，侯氏黑散各劑量組mNSS評(píng)分、腦梗死率、血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量、腦組織HSP90AA1蛋白表達(dá)水平和HSP90AA1、NF-κB1和SRC mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05，P<0.01）;侯氏黑散高劑量組LDL-C、TC、TG水平降低（P<0.05，P<0.01），HDL-C水平增高（P<0.05）;侯氏黑散中劑量組TG水平降低（P<0.01）;西藥組和侯氏黑散中、高劑量組NF-κB1和SRC蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05，P<0.01）。與侯氏黑散低劑量組相比，侯氏黑散中、高劑量組mNSS評(píng)分、腦梗死率，血清TG水平，血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量，腦組織中NF-κB1 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.01）;侯氏黑散高劑量組腦組織HSP90AA1、NF-κB1和SRC蛋白表達(dá)水平和HSP90AA1、NF-κB1 mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05，P<0.01）。與侯氏黑散中劑量組相比，侯氏黑散高劑量組mNSS評(píng)分、腦梗死率，血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量，腦組織HSP90AA1蛋白表達(dá)水平和NF-κB1 mRNA表達(dá)水平降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 侯氏黑散以多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療CIRI，其中抑制核心靶點(diǎn)HSP90AA1、NF-κB1、SRC的mRNA和蛋白表達(dá)，調(diào)控脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路是侯氏黑散治療CIRI的重要機(jī)制。

〔關(guān)鍵詞〕 侯氏黑散;腦缺血再灌注損傷;脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2024.04.025

Mechanism of Hou's Black Powder in treating cerebral ischemia reperfusion injury based on lipid and atherosclerosis pathways

YANG Yi， LI Ruobing， HUANG Lina， WANG Bo， JIANG Xicheng*

Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin， Heilongjiang 150040， China

〔Abstract〕 Objective To verify and analyze the ingredients， targets， and signaling pathways of Hou's Black Powder （HBP） from Jin Gui Yao Lve （Essentials from the Golden Cabinet） in treating cerebral ischemia reperfusion injury （CIRI） by network pharmacology and animal experiments， and to investigate its mechanism of action through lipid and atherosclerosis pathways. Methods The intersection targets of HBP and CIRI were obtained from TCM Integrated Pharmacology Research Platform （TCMIP） V2.0， GeneCards， and OMIM disease databases， and their protein-protein interaction （PPI） network was constructed using the STRING website. Cytoscape was used to screen the core targets and ingredients and to construct an ingredient-target network. R language was used for GO and KEGG enrichment analyses， and AutoDock Vina was employed to verify the docking ability between ingredients and targets. In animal experiments， sixty SPF-grade SD rats were randomized into sham-operated group， model group， western medicine group， and low-， medium-， and high-dose HBP groups. A MCAO/R rat model was prepared by suture-occluded method. Seven days after modeling， the rat neurological function was evaluated by modified neurological severity score （mNSS）. The volume of cerebral infarction was determined by TTC staining and the pathological changes of the brain tissue were observed by HE staining. The serum content of low density lipoprotein cholesterol （LDL-C）， high density lipoprotein cholesterol （HDL-C）， total cholesterol （TC）， and triglycerides （TG） was measured by fully automatic biochemical analyzer. The serum levels of interleukin 1β （IL-1β）， interleukin-6 （IL-6）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were examined by ELISA. The protein and mRNA expressions of HSP90AA1， NF-κB1， and SRC in the brain tissue were measured by immunohistochemistry and RT-qPCR. Results A total of 508 active ingredients， 549 drug targets and 1，592 CIRI disease targets were screened from HBP. A total of 153 intersection targets were found， with HSP90AA1， SRC， and NF-κB1 identified as the core targets. These core targets exhibited a strong binding affinity with core ingredients such as palmitic acid， adenosine triphosphate， clionasterol， and adenosine. The biological processes of GO enrichment analysis mainly involved the response to exogenous stimuli， location maintenance， and inflammatory response regulation. KEGG pathway analysis was primarily enriched in lipid and atherosclerosis pathways， cAMP signal pathway， and arachidonic acid metabolism. Compared with the model group， the mNSS score， cerebral infarction rate， serum content of IL-1β， IL-6， and TNF-α， as well as HSP90AA1 protein expression level and mRNA expression levels of HSP0AA1， NF-κB1， and SRC in the brain issue of each dose HBP group decreased （P<0.05， P<0.01）; the levels of LDL-C， TC， and TG decreased in high-dose HBP group （P<0.05， P<0.01）， while the HDL-C level increased （P<0.05）; the TG level in medium-dose HBP group decreased （P<0.01）; the protein expression levels of NF-κB1 and SRC decreased in western medicine group and medium- and high-dose HBP groups （P<0.05， P<0.01）. Compared with low-dose HBP group， the mNSS scores， cerebral infarction rates， serum levels of TG， serum content of IL-1β， IL-6， and TNF-α， and mRNA expression levels of NF-κB1 in the brain tissue of the medium- and high-dose HBP groups decreased significantly （P<0.01）; the protein expression levels of HSP90AA1， NF-κB1， and SRC and the mRNA expression levels of HSP90AA1 and NF-κB1 in the brain tissue of high-dose HBP group decreased （P<0.05， P<0.01）. Compared with medium-dose HBP group， the high-dose HBP group showed reduced mNSS score， cerebral infarction rate， and serum content of IL-1β， IL-6， and TNF-α， as well as decreased expression levels of HSP90AA1 protein and NF-κB1 mRNA in the brain tissue （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Hou's Black Powder treats CIRI with a multi-ingredient， multi-target and multi-pathway approach. A key mechanism of its therapeutic effect involves suppressing the mRNA and protein expressions of the core targets HSP90AA1， NF-κB1， and SRC， as well as regulating the lipid and atherosclerosis pathways.

〔Keywords〕 Hou's Black Powder; cerebral ischemia reperfusion injury; lipid and atherosclerosis pathways; network pharmacology; animal experiment

腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）是由于大腦中供血?jiǎng)用}發(fā)生梗阻，血管復(fù)通后血液再灌注而導(dǎo)致的繼發(fā)性腦組織損傷。CIRI是一種常見(jiàn)的腦血管疾病，具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點(diǎn)[1]。有50%～70%的患者在發(fā)病治療后伴隨嚴(yán)重的后遺癥，如癱瘓、失語(yǔ)等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是以管腔內(nèi)皮下脂質(zhì)沉積和血管炎為特征的炎性病理狀態(tài)，當(dāng)管腔沉積形成的不穩(wěn)定斑塊脫落后堵塞腦部動(dòng)脈，或腦AS致使管腔狹窄甚至閉塞，會(huì)引發(fā)腦血管疾病[2]，降低脂質(zhì)和AS風(fēng)險(xiǎn)對(duì)CIRI的發(fā)生，從而起到預(yù)防作用[3]。

CIRI屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)病”范疇，病機(jī)以氣血虧虛為本，復(fù)感受外邪，以致痰瘀互結(jié)，阻滯經(jīng)絡(luò)。侯氏黑散首見(jiàn)于《金匱要略·中風(fēng)歷節(jié)病脈證第五》，謂其“治大風(fēng)，四肢煩重，心中惡寒不足者”，全方共14味藥，其中菊花與防風(fēng)可祛內(nèi)外之風(fēng)，桂枝、細(xì)辛可助氣血流行而無(wú)瘀滯，白術(shù)、茯苓、人參和干姜可助脾胃化生氣血，川芎、當(dāng)歸行血補(bǔ)血，黃芩助菊花清風(fēng)中郁熱，桔梗、牡蠣、礬石清熱化痰除濕。全方寒熱并用，補(bǔ)泄同施，具有補(bǔ)益氣血、活血通絡(luò)、祛風(fēng)化痰之功效。其方證內(nèi)涵與中風(fēng)的病因病機(jī)均相符合，可謂中風(fēng)治療“第一方”[4]?，F(xiàn)代研究證實(shí)，侯氏黑散對(duì)于多證型的缺血性腦中風(fēng)后神經(jīng)及血管的修復(fù)具有顯著的臨床療效[5-7]，具有藥理研究?jī)r(jià)值。

由于侯氏黑散組方復(fù)雜，成分繁多，因此，侯氏黑散治療CIRI的作用機(jī)制未完全明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為近年來(lái)針對(duì)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)的熱門(mén)研究，能夠從分子水平闡釋中藥藥物的成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)聯(lián)性。故本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，歸納侯氏黑散治療CIRI的核心成分及靶點(diǎn)，通過(guò)脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路探討其作用機(jī)理，為臨床治療提供參考。

1 材料

1.1? 數(shù)據(jù)庫(kù)

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中使用的數(shù)據(jù)庫(kù)，詳見(jiàn)表1。

1.2? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級(jí)成年雄性SD大鼠（260±20） g來(lái)源于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（黑）2018-003。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，統(tǒng)一飼喂標(biāo)準(zhǔn)大鼠維持飼料及純凈水，控制室溫20～26 ℃，濕度60%±5%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合相關(guān)倫理規(guī)定，并通過(guò)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理號(hào)：2023051603。

1.3? 主要試劑

兔抗HSP90AA1抗體、兔抗NF-κB1抗體（成都正能生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：251634、263819）;兔抗SRC抗體（沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司，批號(hào)：R091824）;蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒、2%氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色劑（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20230113、20221221）;兔二步法試劑盒（北京中杉金橋生物生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：2252D0725）;白介素-1β（interleukin 1β，IL1-β）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：230218、221024、230605）;TRIzol試劑（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)：5301247）;TB Green[R][○] Premix Ex TaqTM II （Tli RNaseH Plus）試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)：AN90399A）。

1.4? 主要設(shè)備

石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司，型號(hào)：EG1150）;石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司，型號(hào)：RM2135）;光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司，型號(hào)：CX41）;全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Beckman Coulter公司，型號(hào)：AU680）;超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：NanoDrop 2000）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：PIKOREAL96）。

2 方法

2.1? 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1? 侯氏黑散化學(xué)成分及靶點(diǎn)? 利用TCMIP數(shù)據(jù)庫(kù)分別收集菊花、白術(shù)、細(xì)辛、防風(fēng)、茯苓、桔梗、干姜、牡蠣、人參、黃芩、礬石、當(dāng)歸、川芎、桂枝的化學(xué)成分及其靶點(diǎn)（相似性分?jǐn)?shù)≥0.8），去重后獲得中藥成分和靶點(diǎn)。

2.1.2? CIRI靶點(diǎn)收集? 以“cerebral ischemia reperfusion injury”為關(guān)鍵詞在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，其中GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)定score≥75百分位數(shù)，檢索結(jié)果合并去重后作為CIRI疾病靶點(diǎn)。

2.1.3? 核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)、成分收集? TCMIP V2.0平臺(tái)得到的藥物靶點(diǎn)與CIRI疾病靶點(diǎn)取交集得到交集靶點(diǎn)，輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為“Homo sapiens”，互作閾值≥0.9，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape 3.9.0軟件分析PPI網(wǎng)絡(luò)的相關(guān)數(shù)據(jù)，利用Cytohubba插件的最大團(tuán)中心性（maximum clique centrality，MCC）、最大鄰居組件（maximum neighborhood component，MNC）、發(fā)散性（radaility）、邊緣滲透組件（edge percolated component，EPC）、連接度（degree）、緊密度（closeness）算法得到與CIRI相關(guān)的TOP 10靶點(diǎn)，取6種算法的交集為核心靶點(diǎn);構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)并通過(guò)Analyze Network進(jìn)行拓?fù)浞治?，選擇中介中心性（betweenness centrality，BC）、度中心性（degree centrality，DC）和緊密中心性（closeness centrality，CC）三個(gè)指標(biāo)均大于各自中位數(shù)的成分，再將DC值排名前十位者作為核心成分[8]。

2.1.4? GO基因功能和KEGG通路富集分析? 使用R軟件中“org. Hs. eg. db”“clusterProfiler”“DOSE”“enrichplot”“stringi”“ggplot2”等對(duì)交集靶蛋白進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析，設(shè)置P<0.05。GO富集分析包括生物過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三個(gè)模塊，以P值由小到大排序，各部分展示前10位條目。KEGG富集分析根據(jù)P值由小到大展示排名前20位通路。

2.1.5? 分子對(duì)接? PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)得到核心成分的“sdf”格式結(jié)構(gòu)，經(jīng)OpenBabel GUI轉(zhuǎn)化為“mol2”格式。RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)檢索蛋白晶體結(jié)構(gòu)，保存為“pdb”格式，應(yīng)用AutoDock Vina 1.2.5軟件進(jìn)行分子對(duì)接。R軟件展示對(duì)節(jié)能熱圖，根據(jù)對(duì)節(jié)能評(píng)價(jià)活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的對(duì)接結(jié)果。

2.2? 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.2.1? 動(dòng)物造模方法? 大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion， MCAO/R）模型：采用改良線栓法首先構(gòu)建MCAO模型[9]，10%水合氯醛按3 mL/kg體重腹腔注射麻醉，分離大鼠右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，頸總動(dòng)脈插線栓，入頸內(nèi)動(dòng)脈，進(jìn)栓深度18～20 mm，縫合刀口，進(jìn)栓2 h后將線栓拔出10 mm建立MCAO/R模型[10]。采用Zealonga五分制評(píng)分法[11]進(jìn)行評(píng)測(cè)大鼠癥狀和體征，將評(píng)分為1～3分的大鼠判定為MCAO/R造模成功，納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，剔除0分和4分大鼠。假手術(shù)模型：上述方法分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈后即縫合，以Zealonga五分制評(píng)分法評(píng)分，0分視為造模成功，納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2? 動(dòng)物分組及給藥? 60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為假手術(shù)組、模型組、西藥組和侯氏黑散低、中、高劑量組，每組10只大鼠。假手術(shù)組為假手術(shù)模型，其余組為MCAO/R模型。侯氏黑散由菊花40 g，白術(shù)10 g，細(xì)辛3 g，茯苓3 g，牡蠣3 g，桔梗8 g，防風(fēng)10 g，人參3 g，礬石3 g，黃芩5 g，當(dāng)歸3 g，干姜3 g，川芎3 g，桂枝3 g（批號(hào)分別為210301、210155、211001、211205、210401、210601、210603、211203、211005、210201、210111、211223、210131、211121）組成，藥物飲片由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。飲片煎煮兩次后藥液合并濃縮至相當(dāng)于生藥量2 g/mL的濃縮液，經(jīng)成人用量換算[12]后侯氏黑散低、中、高劑量組大鼠每日劑量分別為8.4 g/kg、16.8 g/kg、33.6 g/kg。西藥組使用銀杏葉提取物片（金納多，Dr.Willmar Schwabe GmbH & Co.KG公司，批號(hào)：0850521，規(guī)格：40 mg/片），經(jīng)成人用量換算[12]后大鼠每日劑量為28 mg/kg。假手術(shù)組、模型組大鼠每日灌胃蒸餾水10 mL/kg。各組大鼠于造模完成后開(kāi)始灌胃，每日定時(shí)灌胃1次，直至造模7 d后取材。取材時(shí)將10%水合氯醛按3 mL/kg體重腹腔注射麻醉，暴露腹腔后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血。取血結(jié)束后做TTC檢測(cè)的大鼠立即斷頭取腦后按相關(guān)流程染色，做RT-qPCR檢測(cè)的大鼠快速斷頭取腦，經(jīng)液氮速凍后存放于-80 ℃冰箱。做HE染色、免疫組織化學(xué)檢測(cè)的大鼠在近心端夾閉腹主動(dòng)脈，剪開(kāi)胸腔暴露心臟，由心尖處灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，后斷頭取腦，存放于4%多聚甲醛中繼續(xù)固定。

2.2.3? 改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分（modified neurological severity score，mNSS）? 采用mNSS評(píng)測(cè)各組大鼠神經(jīng)功能[13]，造模當(dāng)天術(shù)后3 h至取材日每日定時(shí)評(píng)估。mNSS分值區(qū)間為0～18分，分?jǐn)?shù)越高則提示神經(jīng)功能損傷程度越重。

2.2.4? TTC染色? 大鼠取腦后以2 mm厚度切冠狀面，于37 ℃水浴鍋中用2% TTC溶液避光染色30 min，4%多聚甲醛固定后拍照，經(jīng)Image J軟件計(jì)算梗死區(qū)占腦切片面積比率，即腦梗死率（%）=腦梗死面積/全腦面積×100%。

2.2.5? 血脂檢測(cè)? 大鼠腹腔麻醉后腹主動(dòng)脈取血，在4 ℃、3 500 r/min（離心半徑8 cm）的低溫離心機(jī)中離心15 min后取血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)，利用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（how density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglycerides，TG）含量。

2.2.6? ELISA檢測(cè)? 血清提取方法同2.2.5，按試劑盒說(shuō)明書(shū)，ELISA檢測(cè)血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

2.2.7? HE染色? 大鼠取腦后制成石蠟包塊，切制5 mm的石蠟切片，置于65 ℃烘箱2 h，脫蠟復(fù)水后按HE試劑說(shuō)明書(shū)染色并封片，于顯微鏡下觀察組織形態(tài)。

2.2.8? 免疫組織化學(xué)檢測(cè)? 石蠟切片制備同2.2.7，經(jīng)脫蠟復(fù)水、3% H2O2去酶、抗原修復(fù)、山羊血清封閉、一抗孵育過(guò)夜（HSP90AA1、NF-κB1和SRC均按1∶200比例稀釋）、二抗孵育、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、梯度脫水和封片等流程，在顯微鏡下采集棕色陽(yáng)性表達(dá)部位。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度（average optical density，AOD）。

2.2.9? RT-qPCR檢測(cè)? 稱取100 mg液氮凍存的腦組織，TRIzol試劑提取RNA后根據(jù)微量分光光度計(jì)測(cè)量取1 μg RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再通過(guò)熒光定量PCR得到Ct值，熒光定量PCR設(shè)置參數(shù)：95 ℃ 30 s預(yù)變性，循環(huán)1次;95 ℃ 5 s變性，60 ℃ 30 s退火，循環(huán)40次;采用2-△△CT法計(jì)算其表達(dá)量。由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)并提供HSP90AA1、NF-κB1和SRC引物。各指標(biāo)引物序列詳見(jiàn)表2。

2.2.10? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析? 采用SPSS 25.0分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料采用“x±s”表示，符合正態(tài)性和方差齊性時(shí)采用單因素方差分析。不符合正態(tài)性或方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? CIRI及侯氏黑散成分靶標(biāo)預(yù)測(cè)

在TCMIP V2.0平臺(tái)中，共得到侯氏黑散有效成分508種，預(yù)測(cè)靶標(biāo)549個(gè)。在GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果合并去重后，共得到疾病靶點(diǎn)1 592個(gè)。

3.2? 侯氏黑散與CIRI的交集靶點(diǎn)

將侯氏黑散與CIRI的靶標(biāo)映射取交集，共得153個(gè)治療CIRI的交集靶點(diǎn)。詳見(jiàn)圖1。

3.3? 侯氏黑散治療CIRI的PPI網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件重新構(gòu)建得到侯氏黑散治療CIRI的PPI網(wǎng)絡(luò)，詳見(jiàn)圖2。該網(wǎng)絡(luò)含有111個(gè)節(jié)點(diǎn)，444條邊，節(jié)點(diǎn)平均連接度4.362，節(jié)點(diǎn)的大小和顏色與其degree值成正比。通過(guò)CytoHubba插件下的6種不同算法得到Top 10 靶點(diǎn)，詳見(jiàn)圖3。6種算法結(jié)果取交集，得到3個(gè)核心靶點(diǎn)，即：HSP90AA1、SRC、NF-κB1。

3.4? 侯氏黑散治療CIRI的核心成分

核心成分篩選標(biāo)準(zhǔn)為同時(shí)大于DC、BC和CC的中位數(shù)，按DC值由大到小取前10位成分。詳見(jiàn)表3。

3.5? GO和KEGG富集分析

GO富集分析共得到條目2 237條，其中BP條目1 926條，主要涉及對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、位置維護(hù)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、脂肪酸代謝過(guò)程、對(duì)低氧的反應(yīng)等;CC條目130條，包括膜筏、膜微區(qū)、樹(shù)突棘等;MF條目181條，包括鐵離子結(jié)合、四吡咯結(jié)合、血紅素結(jié)合等，詳見(jiàn)圖4。KEGG富集分析得到通路180條，包括脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、cAMP信號(hào)通路、花生四烯酸代謝等，詳見(jiàn)圖5。按P值排名首位是脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路，通路圖詳見(jiàn)圖6，核心靶點(diǎn)HSP90AA1、SRC、NF-κB1均富集在通路中。

3.6? 分子對(duì)接

將核心成分分別與核心靶點(diǎn)蛋白HSP90AA1（PDB ID：1YC1）、SRC（PDB ID：1O43）、NF-κB1（PDB ID：7RG5）進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接分值<-5.0 kcal/mol表示有較好的結(jié)合活性，對(duì)接分值越低，分子構(gòu)象越穩(wěn)定，結(jié)合能力熱圖詳見(jiàn)圖7。選取對(duì)接分值<-5.0 kcal/mol的5組活性成分與靶蛋白，通過(guò)PyMOL軟件進(jìn)行3D展示，圖中展示了HSP90AA1、SRC和NF-κB1與其核心成分的對(duì)接部位，詳見(jiàn)圖8。分子對(duì)接結(jié)果顯示，HSP90AA1和Campesterol、NF-κB1和Poriferasterol、HSP90AA1和Clionasterol、SRC和Campesterol、SRC和Poriferasterol等均具有較強(qiáng)的結(jié)合力。

3.7? 侯氏黑散對(duì)各組大鼠mNSS評(píng)分影響

與造模日相比，其余各組術(shù)后第7天的mNSS評(píng)分降低（P<0.05，P<0.01）。與假手術(shù)組相比，模型組、西藥組和侯氏黑散低、中、高劑量組mNSS評(píng)分明顯升高（P<0.01）;與模型組相比，西藥組和侯氏黑散低、中、高劑量組mNSS評(píng)分明顯降低（P<0.01）;與西藥組相比，侯氏黑散低、中劑量組mNSS評(píng)分升高（P<0.05，P<0.01）;與侯氏黑散低劑量組相比，侯氏黑散中、高劑量組mNSS評(píng)分明顯降低（P<0.01）;與侯氏黑散中劑量組相比，侯氏黑散高劑量組mNSS評(píng)分降低（P<0.05）。詳見(jiàn)表4。

3.8? 侯氏黑散對(duì)各組大鼠腦梗死率影響

除假手術(shù)組正常外，其余各組均表現(xiàn)不同程度梗死，詳見(jiàn)圖9。與假手術(shù)組相比，其余各組梗死率明顯增高（P<0.01）;與模型組相比，西藥組和侯氏黑散低、中、高劑量組腦梗死率降低（P<0.05，P<0.01）;與西藥組相比，侯氏黑散低、中劑量組腦梗死率明顯增高（P<0.01）;與侯氏黑散低劑量組相比，侯氏黑散中、高劑量組腦梗死率明顯降低（P<0.01）;與侯氏黑散中劑量組相比，侯氏黑散高劑量組腦梗死率降低（P<0.05）。詳見(jiàn)圖10。

3.9? 侯氏黑散對(duì)各組大鼠脂質(zhì)代謝水平影響

與假手術(shù)組相比，模型組和侯氏黑散低、中劑量組LDL-C、TC、TG水平明顯增高（P<0.01），HDL-C水平明顯降低（P<0.01）;侯氏黑散高劑量組TC、TG水平明顯增高（P<0.01），HDL-C水平明顯降低（P<0.01）。與模型組相比，西藥組和侯氏黑散高劑量組LDL-C、TC、TG水平降低（P<0.05，P<0.01），HDL-C水平升高（P<0.05，P<0.01）;侯氏黑散中劑量組TG水平明顯降低（P<0.01）。與西藥組相比，侯氏黑散低劑量組LDL-C、TC、TG水平增高（P<0.01），HDL-C水平降低（P<0.05）;侯氏黑散中劑量組LDL-C、TC水平明顯增高（P<0.01），HDL-C水平降低（P<0.05）;侯氏黑散高劑量組TC水平明顯增高（P<0.01）。與侯氏黑散低劑量組相比，侯氏黑散中、高劑量組TG水平明顯降低（P<0.01）。詳見(jiàn)表5。

3.10? 侯氏黑散對(duì)各組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α影響

與假手術(shù)組相比，其余各組血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量增高（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，西藥組和侯氏黑散低、中、高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α含量明顯降低（P<0.01）;與西藥組相比，侯氏黑散低、中、高劑量組IL-1β、IL-6和TNF-α含量增高（P<0.05，P<0.01）;與侯氏黑散低劑量組相比，侯氏黑散中、高劑量組IL-1β、IL-6和TNF-α含量明顯降低（P<0.01）;與侯氏黑散中劑量組相比，高劑量組IL-1β、IL-6和TNF-α含量明顯降低（P<0.01）。詳見(jiàn)表6。

3.11? 侯氏黑散對(duì)各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷影響

假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，排列有序，核仁清晰;模型組腦缺血區(qū)部位出現(xiàn)大面積空腔，神經(jīng)細(xì)胞排列明顯不規(guī)律且稀疏，細(xì)胞核縮小，部分細(xì)胞壞死;與模型組比較，西藥組、侯氏黑散低、中、高劑量組的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性及核萎縮表現(xiàn)均有改善，說(shuō)明神經(jīng)細(xì)胞損傷程度均有緩解，其中西藥組損傷程度最輕，侯氏黑散低劑量組至高劑量組損傷程度呈遞減趨勢(shì)。詳見(jiàn)圖11。（圖中箭頭標(biāo)注為細(xì)胞核固縮及壞死病變區(qū)域）。

3.12? 侯氏黑散對(duì)各組大鼠HSP90AA1、NF-κB1和SRC蛋白表達(dá)影響

與假手術(shù)組相比，模型組和侯氏黑散低、中、高劑量組的HSP90AA1表達(dá)增高（P<0.05，P<0.01），模型組和侯氏黑散低、中劑量組NF-κB1和SRC表達(dá)增高（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，西藥組和侯氏黑散低、中、高劑量組HSP90AA1表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01），西藥組、侯氏黑散中、高劑量組NF-κB1和SRC表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01）;與西藥組相比，侯氏黑散低、中、高劑量組HSP90AA1表達(dá)增高（P<0.05，P<0.01），侯氏黑散低劑量組NF-κB1和SRC表達(dá)顯著增高（P<0.01，P<0.01）;與侯氏黑散低劑量組相比，侯氏黑散高劑量組HSP90AA1、NF-κB1和SRC表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01）;與侯氏黑散中劑量組相比，侯氏黑散高劑量組HSP90AA1表達(dá)降低（P<0.05）。詳見(jiàn)圖12、圖13。

3.13? 侯氏黑散對(duì)各組大鼠HSP90AA1、NF-κB1和SRC mRNA表達(dá)影響

與假手術(shù)組相比，模型組和侯氏黑散低、中、高劑量組的HSP90AA1 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01），模型組和侯氏黑散低、中劑量組的NF-κB1 mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.01），模型組、西藥組和侯氏黑散低、中、高劑量組SRC mRNA表達(dá)升高（P<0.05，P<0.01）;與模型組相比，西藥組和侯氏黑散低、中、高劑量組的HSP90AA1、NF-κB1和SRC mRNA表達(dá)降低（P<0.05，P<0.01）;與西藥組相比，侯氏黑散低、中劑量組HSP90AA1、NF-κB1和SRC mRNA表達(dá)升高（P<0.05，P<0.01）;與侯氏黑散低劑量組相比，侯氏黑散高劑量組HSP90AA1 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01），侯氏黑散中、高劑量組NF-κB1 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01）。與侯氏黑散中劑量組相比，侯氏黑散高劑量組NF-κB1 mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.01）。詳見(jiàn)圖14。

4 討論

本研究通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘得到侯氏黑散508種化學(xué)成分，與CIRI交集靶點(diǎn)153個(gè)，其中棕櫚酸、三磷酸腺苷、亞油酸等為核心成分，HSP90AA1、NF-κB1和SRC為核心靶點(diǎn)。交集靶點(diǎn)的GO功能分析生物過(guò)程主要涉及對(duì)外源性刺激的反應(yīng)、位置維護(hù)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)等，KEGG通路分析主要集中在脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、cAMP信號(hào)通路、花生四烯酸代謝等方面。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，侯氏黑散給藥7 d后可顯著改善各組大鼠mNSS評(píng)分、腦梗死率及神經(jīng)細(xì)胞形態(tài);侯氏黑散低、中、高劑量組均可降低大鼠血清LDL-C、TG和TC含量，并提高HDL-C含量，降低各組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α含量，降低各組大鼠腦組織HSP90AA1、NF-κB1和SRC的mRNA和蛋白表達(dá)水平，以高劑量組結(jié)果最為顯著。研究結(jié)果表明，HSP90AA1、NF-κB1和SRC是侯氏黑散治療CIRI的有效靶點(diǎn)。

侯氏黑散作為治療CIRI的經(jīng)典方劑，其作用機(jī)制主要包括促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)與損傷、降低總膽固醇和甘油三酯等。相關(guān)研究證實(shí)，侯氏黑散能夠下調(diào)淀粉樣前體蛋白表達(dá)，抑制β-淀粉樣蛋白產(chǎn)生的神經(jīng)毒性[14]，提高生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)蛋白、突觸素、微管相關(guān)蛋白-2等神經(jīng)再生因子表達(dá)[15]，同時(shí)調(diào)節(jié)脂質(zhì)水平后改善血液狀態(tài)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)和AS通路是其主要作用途徑之一，而AS的主要誘因包括脂質(zhì)積累、炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮功能障礙等。侯氏黑散核心成分能夠圍繞這一通路及其誘因發(fā)揮治療作用。棕櫚酸是人體循環(huán)血液中含量最多的游離脂肪酸之一，其病理高濃度狀態(tài)會(huì)減少內(nèi)皮一氧化氮（nitric oxide，NO）釋放，抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶的磷酸化激活，損傷血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)AS生成[17]。三磷酸腺苷是分布人體全身的內(nèi)源性核苷，當(dāng)激活血管內(nèi)皮的三磷酸腺苷受體后可以促進(jìn)NO釋放，從而改善微循環(huán)和內(nèi)皮功能。亞油酸屬于不飽和脂肪酸，能夠刺激平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，如IL-6、IL-1β和TNF-α等[18]，并提高對(duì)LDL的敏感性，影響正常的血脂代謝，進(jìn)而加重AS進(jìn)展[19]。

侯氏黑散核心靶點(diǎn)HSP90AA1、NF-κB1、SRC均富集于脂質(zhì)和AS通路。研究發(fā)現(xiàn)，AS患者的硬化斑塊中HSP90AA1表達(dá)增加，并與斑塊不穩(wěn)定性有關(guān)[20];同時(shí)血清中HSP90AA1水平升高能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，被認(rèn)為是AS免疫機(jī)制的自身抗原[21]。HSP90AA1抑制劑能夠抑制炎性因子核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）表達(dá)，并通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞遷移而減緩AS斑塊形成[22]。AS的發(fā)生發(fā)展與炎癥因子關(guān)系密切，而炎性介質(zhì)又作為NF-κB的靶基因受其調(diào)控[23]。NF-κB作為真核細(xì)胞內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，以p50和p65組成的二聚體為存在形式[24]，在激活狀態(tài)下，NF-κB從細(xì)胞質(zhì)移至細(xì)胞核，并誘導(dǎo)IL-6、IL-1β和TNF-α等炎性因子釋放[25]，抑制NF-κB活化是抗炎治療的關(guān)鍵步驟[26]。類固醇受體輔激活因子（steroid receptor coactivator，Src）參與腦神經(jīng)元的增殖和分裂等生理過(guò)程[27]，腦缺血發(fā)生后Src被激活[28]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B、p38絲裂原激活的蛋白激酶等信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)等過(guò)程關(guān)系密切[29-31]，而Src蛋白激酶能夠通過(guò)上述通路導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙，破壞其本身的屏障功能[32]。Src也作用于巨噬細(xì)胞的脂質(zhì)吞噬、炎癥反應(yīng)和凋亡過(guò)程[33]。在血管平滑肌細(xì)胞中，Src也可以誘導(dǎo)其發(fā)生遷移和增殖，影響其局部黏著復(fù)合物形成，促使發(fā)生炎癥反應(yīng)[34]。由此可見(jiàn)，HSP90AA1、NF-κB1和SRC均可影響AS形成的各個(gè)過(guò)程，對(duì)AS具有重要調(diào)節(jié)作用。

5 結(jié)論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討了《金匱要略》中侯氏黑散治療CIRI的作用機(jī)制，充分體現(xiàn)了侯氏黑散通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)揮其整體治療CIRI的優(yōu)勢(shì)，并驗(yàn)證了其可能主要通過(guò)作用于HSP90AA1、NF-κB1、SRC核心靶點(diǎn)調(diào)控脂質(zhì)和AS過(guò)程，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)CIRI的治療作用，為臨床治療研究提供了一定的參考和指導(dǎo)價(jià)值。

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〔基金項(xiàng)目〕國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82174261，81673865）;黑龍江省自然科學(xué)基金聯(lián)合引導(dǎo)項(xiàng)目（LH2021H084）;黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)新藥臨床前研究基金項(xiàng)目（2019XY01）。

〔通信作者〕*蔣希成，男，博士，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：jiangxicheng5303@163.com。