非洲豬瘟病毒增殖過(guò)程中主要蛋白研究進(jìn)展

趙旭陽(yáng)，樊 帥，靳家鑫，張 帥，路聞龍，朱瀟靜，王 芮，張改平，孫愛(ài)軍，莊國(guó)慶

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 國(guó)家動(dòng)物免疫學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心，鄭州 450046）

非洲豬瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）感染豬引起的非洲豬瘟（African swine fever, ASF），是一種急性、烈性、出血性、高度接觸性傳染病，急性感染常表現(xiàn)為高于41℃的發(fā)熱、厭食、精神沉郁等臨床癥狀，感染后4～15 d病死率接近100%，屬于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organization for Animal Health, WOAH）規(guī)定必須上報(bào)的A類動(dòng)物疫病。1921年，ASF首次報(bào)道于肯尼亞，傳入歐洲后在大部分國(guó)家均有發(fā)生、流行[1]。2018年8月，ASF疫情在我國(guó)首次報(bào)道并迅速蔓延，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)健康發(fā)展。盡管目前已通過(guò)多項(xiàng)生物安全措施減少了ASF的發(fā)生，但仍缺少有效抑制或者阻斷病毒復(fù)制傳播的手段[2]。綜述ASFV主要編碼蛋白在其侵入和復(fù)制過(guò)程的作用和機(jī)理，并進(jìn)一步討論其在ASF疫苗和藥物研發(fā)中的指導(dǎo)作用，對(duì)防控ASF發(fā)生發(fā)展，確保生豬產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展有重要意義。

1 ASFV 病原學(xué)

ASFV是雙股線性DNA病毒，基因組大小為170～193 kb，由一個(gè)約125 kb的保守中心區(qū)和兩個(gè)可變末端組成，包含150～167個(gè)緊密排列的開(kāi)放閱讀框（ open reading frames, ORFS），編碼超過(guò)150種結(jié)構(gòu)和非結(jié)構(gòu)蛋白。其中位于可變區(qū)的多基因家族（ multi gene f amilies, MGFS）基因決定了ASFV的基因多樣性，與ASFV的毒力強(qiáng)弱以及免疫逃逸密切相關(guān)[3]。ASFV的基因表達(dá)與復(fù)制協(xié)調(diào)運(yùn)轉(zhuǎn)，保障病毒復(fù)制的順利進(jìn)行。隨后，ASFV在核周微管組織中心（microtubule organizing center, MTOC）處稱為“病毒工廠”的區(qū)域進(jìn)行組裝，經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜以“出芽”的方式釋放到細(xì)胞外[4]。

2 核質(zhì)大DNA 病毒

核質(zhì)大DN A病毒（Nucleocytoplasmic large DNA viruses, NCLDVs）是一類有相同遠(yuǎn)古起源的DNA病毒，包括非洲豬瘟病毒科、痘病毒科、虹彩病毒科等在內(nèi)的多個(gè)病毒家族。大部分NCLDVs由DNA及其結(jié)合蛋白構(gòu)成核心，外包一層或多層脂質(zhì)膜并具有二十面體衣殼，衣殼蛋白均存在類似雙層“果凍卷”（jelly-roll, JR）的折疊結(jié)構(gòu)，與殼粒形成有關(guān)[5]；絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶和酪氨酸-絲氨酸 蛋白磷酸酶在幾乎所有NCLDVs中都有同源性，可能在病毒顆粒裝配過(guò)程中起調(diào)節(jié)作用[6]；SMT4樣蛋 白酶通過(guò)類泛素化修飾（SUMOylation）在NCLDVs顆粒成熟中發(fā)揮作用[7]。NCLDVs在 DNA復(fù)制機(jī)制上也具有一定的相似性，所依賴的ATP酶在序列上高度保守[8]，其究竟由共同祖先進(jìn)化還是在相同或相似宿主中復(fù)制導(dǎo)致，仍需進(jìn)一步研究。

3 ASFV 的結(jié)構(gòu)與組成

ASFV具有二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，內(nèi)部是含有DNA的類核（nucleoid）及蛋白質(zhì)核心殼（core shell），向 外依次為脂質(zhì)內(nèi)膜（inner envelope）和蛋白質(zhì)衣殼（capsid），成熟的ASFV還有脂質(zhì)外囊膜（outer envelope）包裹，直徑為260～300 nm[9]（圖1）。ASFV基因組兩端的可變區(qū)域形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，通過(guò)共價(jià)鍵將雙股DNA連接在一起。ASFV編碼的蛋白根據(jù)功能可分為參與病毒形態(tài)發(fā)生（24%）、參與病毒基因轉(zhuǎn)錄（19%）、維持基因組完整性（6%）、介導(dǎo)病毒入侵（4%）、逃避宿主免疫防御（3%）和功能未知蛋白（34%）[10]。

圖1 ASFV 的主要結(jié)構(gòu)與已知功能蛋白Fig.1 ASFV major structure and functional proteins

3.1 類核 ASFV類 核主要包括蛋白結(jié)合的病毒基因組以及一些參與復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的酶或相關(guān)因子，它們共同組成直徑約80 nm的電 子致密結(jié)構(gòu)[4]。目前發(fā)現(xiàn)參與病毒類核結(jié)構(gòu)的病毒蛋白主要有p10和A104R，均為DNA結(jié)合蛋白，與細(xì)菌擬核中含有的組蛋白功能相似[11]；參與病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的酶或相關(guān)因子包括RNA聚合酶亞基（NP1450L、EP1242L、H359L、D205R、C147L、D339L）、加帽酶（NP868R）、polyA聚合酶（C475L）、甲基轉(zhuǎn)移酶（EP424R）和早期轉(zhuǎn)錄因子（D1133L、Q706L、G1340L、B962L）等[9]。

3.2 核心殼 ASFV核心殼是包裹在類核外部的一層蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，厚約30 nm，主要源于病毒前體蛋 白pp220和pp62[4]。在病毒S273R蛋白酶作用下，pp220被水解為p150、p37、p34、p14和p5，pp62被水解為p35、p15和p8[12]，這些產(chǎn)物約占病毒總蛋白的32%，在核心殼組裝過(guò)程中起到重要作用。

3.3 內(nèi)膜 ASFV內(nèi)膜是一層類脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，主要成分源自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum, ER）。參與構(gòu)成內(nèi)膜的病毒蛋白主要包括p54、p17、p12、E248R、E199L、p12、p22等[13]。p17和p54是一種定位于內(nèi)膜上的跨膜蛋白，在ER上不斷積聚導(dǎo)致膜塌陷并轉(zhuǎn)入病毒工廠，在病毒內(nèi)膜前體的形成中發(fā)揮重要作用[14]。

3.4 衣殼 ASFV衣殼直徑約260 nm，其二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)主要由12個(gè)五重對(duì)稱體（pentasymmetrons）和20個(gè)三重對(duì)稱體（trisymmetron），共計(jì)2760個(gè)偽六邊形殼粒（pseudo-hexagonal capsomers）和12個(gè)五鄰體蛋白（penton protein）組成，每個(gè)五重對(duì)稱體含30個(gè)殼粒和5個(gè)五鄰體蛋白，每個(gè)三重對(duì)稱體含120個(gè)殼粒，殼粒間距為7.4～8.1 nm[15]。晚期蛋白p72是殼粒的主要組成成分，約占病毒顆粒總蛋白的32%，在病毒識(shí)別、結(jié)合和進(jìn)入宿主細(xì)胞過(guò)程中起重要作用。

3.5 外囊膜 ASFV顆粒以“出芽”的方式從宿主細(xì)胞排出，并獲得1層非二十面體對(duì)稱的外囊膜。有無(wú)外囊膜的ASF V均具有感染性，說(shuō)明其在感染過(guò)程中是非必需的[15]。外囊膜上特征性蛋白CD2v（EP402R）是一種包含信號(hào)肽、免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)的糖蛋白，具有與T淋巴細(xì)胞表面受體CD2相似的序列特征，能夠使ASFV更容易吸附在被感染細(xì)胞表面[9]。

4 ASFV 的進(jìn)入與復(fù)制

ASFV通過(guò)內(nèi)體-溶酶體途徑（endosomelysosome pathway）進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在此過(guò)程中脫去衣殼，病毒內(nèi)膜與晚期內(nèi)體（late endosome）膜融合將病毒核心釋放到胞質(zhì)；病毒核心通過(guò)微管轉(zhuǎn)至核周“病毒工廠”，利用自身編碼的酶和相關(guān)因子進(jìn)行早期轉(zhuǎn)錄，表達(dá)病毒復(fù)制早期蛋白[16]；ASFV侵入宿主細(xì)胞4 h內(nèi)，病毒基因組DNA復(fù)制在細(xì)胞核中啟動(dòng)，侵入6 h后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)復(fù)制階段[17]；隨后，病毒核心在“病毒工廠”裝配形成，由二十面體衣殼包裹后通過(guò)微管轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)膜出芽釋放[4]（圖2）。

圖2 ASFV 的進(jìn)入和增殖Fig.2 ASFV entry and propagation

4.1 ASFV進(jìn)入

4.1.1 ASFV進(jìn)入過(guò)程 ASFV主要通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的受體依賴性內(nèi)吞（clathrin-mediated receptordependent endocytosis）途徑進(jìn)入宿主細(xì)胞，也可經(jīng)由巨胞飲（macropinocytosis）進(jìn)入，兩種方式并無(wú)明確界限，巨胞飲過(guò)程中肌動(dòng)蛋白的重組和膜突起也能夠輔助網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用[18]。有研究表明作為巨噬細(xì)胞成熟標(biāo)志的CD163可能與ASFV侵入相關(guān)[19]，但Franzoni等[20]發(fā)現(xiàn)ASFV感染并未影響CD163表達(dá)，其是否作為受體介導(dǎo)ASFV感染仍需進(jìn)一步論證。在適宜的溫度、pH和能量供應(yīng)下，有無(wú)外囊膜的ASFV顆粒均可通過(guò)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，并伴隨內(nèi)體的酸化脫去衣殼。在膽固醇協(xié)助下病毒內(nèi)膜與內(nèi)體膜發(fā)生融合，病毒核心被釋放至胞漿并通過(guò)微管轉(zhuǎn)運(yùn)至MTOC，啟動(dòng)早期基因的表達(dá)和基因組復(fù)制[16]。另外，ASFV還能通過(guò)膜融合等非內(nèi)體途徑進(jìn)入細(xì)胞，但該途徑進(jìn)入的病毒并不具備感染能力。

4.1.2 進(jìn)入相關(guān)蛋白 ASFV編碼蛋白可能在病毒侵入、脫殼、轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程中發(fā)揮作用。結(jié)構(gòu)蛋白p54能夠與胞質(zhì)動(dòng)力蛋白LC8結(jié)合，介導(dǎo)病毒向核周區(qū)域運(yùn)輸[9]。E248R是一種存在于成熟病毒顆粒內(nèi)膜上的跨膜蛋白，在ASFV感染過(guò)程中參與內(nèi)體膜融合及核衣殼遞送[21]。另外，針對(duì)ASFV結(jié)構(gòu)蛋白p30、p54、p72的特異性抗體能在一定程度上抑制病毒的吸附[9]，表明這些病毒蛋白在病毒侵入過(guò)程中也發(fā)揮了作用。

4.2 ASFV復(fù)制

4.2.1 ASFV復(fù)制過(guò)程 ASFV核心通過(guò)微管轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核周圍后，在自身編碼的酶和細(xì)胞因子作用下進(jìn)行早期mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯，并利用DNA聚合酶polB、polX等進(jìn)行基因組復(fù)制。在感染4 h內(nèi)，病毒在宿主細(xì)胞核中啟動(dòng)早期復(fù)制并形成小型復(fù)制中間體[22]；感染6 h后，復(fù)制中間體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中組成大復(fù)制中間體，在細(xì)胞質(zhì)的“病毒工廠”中進(jìn)一步復(fù)制[17]。ASFV感染早期表達(dá)的蛋白會(huì)促進(jìn)病毒基因組DNA復(fù)制，而當(dāng)復(fù)制進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)階段，病毒基因的轉(zhuǎn)錄模式也發(fā)生相應(yīng)轉(zhuǎn)變，主要進(jìn)行中、晚期蛋白的表達(dá)和修飾。目前，ASFV轉(zhuǎn)錄與復(fù)制不同階段的調(diào)控機(jī)制尚不明晰，其可能是未來(lái)開(kāi)發(fā)阻斷ASFV復(fù)制藥物的關(guān)鍵。

4.2.2 復(fù)制相關(guān)蛋白 在ASFV感染早期，核心殼蛋白p37介導(dǎo)復(fù)制過(guò)程中的DNA核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，其與病毒基因組一同進(jìn)入宿主細(xì)胞核，完成DNA復(fù)制后再一同轉(zhuǎn)移至“病毒工廠”[23]。在細(xì)胞核復(fù)制階段，C962R基因編碼的DNA引物酶在基因組的一端或兩端引入單鏈間隙，暴露的3'-OH充當(dāng)DNA聚合酶的引物啟動(dòng)復(fù)制，其中新生鏈和模板鏈的末端自我互補(bǔ)產(chǎn)生“頭對(duì)頭連接體”并折疊成自啟動(dòng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)[17]；在細(xì)胞質(zhì)復(fù)制階段，ASFV使用自身編碼的一套DNA合成酶系統(tǒng)保證復(fù)制的順利進(jìn)行：G1211R、E301R和F1055L基因分別編碼類DNA聚合酶、類增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）蛋白和螺旋酶參與病毒復(fù)制起始，其中G1211R將DNA聚合酶結(jié)合在DNA分子上[24]，E301R融合于DNA聚合酶催化區(qū)域，參與構(gòu)成病毒DNA復(fù)制復(fù)合物的滑動(dòng)結(jié)構(gòu)[17,25]，F(xiàn)1055L可特異性識(shí)別病毒復(fù)制起點(diǎn)協(xié)助C962R啟動(dòng)復(fù)制[26]。此外，F(xiàn)778R、F334L和A240L基因分別編碼核糖核苷酸還原酶的大、小亞基和胸苷激酶，為細(xì)胞質(zhì)階段的復(fù)制提供原料[27-28]。在復(fù)制過(guò)程中，P1192R、EP364R、和D345L基因分別編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、類ERCC4核酸酶和類λ核酸外切酶，P1192R解析病毒基因組復(fù)制中間體并參與病毒核酸的結(jié)構(gòu)修飾[10]，EP364R和D345L負(fù)責(zé)把聚合基因組中間體分解成單位長(zhǎng)度[17]，共同促進(jìn)大復(fù)制中間體形成成熟的交聯(lián)DNA。最后，組蛋白樣蛋白A104R與成熟的復(fù)制產(chǎn)物結(jié)合并一起組裝到子代病毒顆粒中，其與E199L合作保持DNA的超螺旋活性[29-30]。

堿基切除修復(fù)（base excision repair, BER）系統(tǒng)可修復(fù)因水解或活性氧氧化造成的DNA損傷而保證病毒基因組復(fù)制的準(zhǔn)確性。NP419L基因編碼一種低保真度DNA連接酶，能高效封閉3'端錯(cuò)配缺口（如C∶T缺口）導(dǎo)致的遺傳突變，也參與催化岡崎片段連接[6,31]。O174L基因編碼的pol X是目前已知最小、也是保真性最低的DNA聚合酶，可介導(dǎo)單堿基缺失修復(fù)，也能在小片段DNA損傷修復(fù)中發(fā)揮作用[17]；E296R基因編碼AP核酸內(nèi)切酶，在BER機(jī)制中發(fā)揮3'→5'外切酶活性和3'雙酯酶活性，參與維持基因組的高保真性[27]。E165R基因編碼一種dUTP酶，能降低dUTP濃度以減小脫氧尿苷錯(cuò)誤摻入病毒DNA的幾率，是ASFV正確復(fù)制所必需的[32]。此外，上述ERCC4樣核酸酶（EP364R）、類λ核酸外切酶（D345L）和PCNA樣蛋白（E301R）等也共同參與了ASFV的BER機(jī)制。ASFV通過(guò)復(fù)雜的DNA合成和修復(fù)機(jī)制抵御宿主細(xì)胞的免疫清除，保障自身的復(fù)制。深入解析其中各個(gè)編碼蛋白的作用原理，有助于闡明ASFV增殖和免疫逃逸機(jī)制，對(duì)于抗病毒藥物研發(fā)具有深遠(yuǎn)意義。

4.3 ASFV裝配

4.3.1 ASFV裝配過(guò)程 ASFV的裝配從ER開(kāi)始，在核周MTOC區(qū)域的“病毒工廠”中進(jìn)行。“病毒工廠”由ASFV誘導(dǎo)宿主細(xì)胞的波形蛋白纖維絲（vimentin filament）形成籠狀結(jié)構(gòu)搭建而成，內(nèi)部缺乏細(xì)胞器，周圍聚集著較多的線粒體和伴侶蛋白[33]。ASFV誘導(dǎo)伴侶鈣蛋白酶和鈣網(wǎng)蛋白的上調(diào)以增加ER的折疊能力，大量表達(dá)的早期病毒蛋白p54、p17等誘導(dǎo)ER膜塌陷成平行排列的小彎曲或開(kāi)放結(jié)構(gòu)，隨后轉(zhuǎn)入“病毒工廠”成為電子致密的病毒內(nèi)膜前體[13]；p72蛋白以三聚體形式構(gòu)成殼粒并在病毒內(nèi)膜前體凸面處以六邊形排列，通過(guò)次要衣殼蛋白和p17等內(nèi)膜蛋白的協(xié)助錨定在內(nèi)膜，搭建出二十面體衣殼；與此同時(shí)，多聚蛋白pp220和pp62及其水解產(chǎn)物也以2個(gè)10 nm球狀亞基在內(nèi)膜前體的凹面下規(guī)則排列形成核心殼，內(nèi)膜的成熟與衣殼的正確裝配是核心殼組裝的關(guān)鍵[4,34]；在衣殼形成的同時(shí)，病毒基因組DNA和核蛋白體也被核心殼包裝、濃縮，形成中心電子致密的類核，從二十面體的1個(gè)頂點(diǎn)處裝配進(jìn)入衣殼[35]。需要注意的是，二十面體的組裝與類核的包裝相互 獨(dú)立，裝配出現(xiàn)錯(cuò)誤會(huì)導(dǎo)致“空”二十面體顆粒單獨(dú)釋放[36]。

4.3.2 裝配相關(guān)蛋白 裝配的初始階段，病毒內(nèi)膜蛋白p54和p17誘導(dǎo)ER膜塌陷形成內(nèi)膜前體，它們的缺失會(huì)顯著影響pp220和pp62的定位，進(jìn)而阻礙病毒內(nèi)膜前體的成熟及衣殼、核心殼的正確組裝[4]。結(jié)構(gòu)蛋白p72在細(xì)胞質(zhì)中聚集并組裝成殼粒，非結(jié)構(gòu)蛋白B602L作為分子伴侶參與其折疊和多聚過(guò)程[37]；內(nèi)膜前體上的p49結(jié)合并招募?xì)ち＃谖遴忬w蛋白H240R周圍聚集形成五鄰體核心，M1249L蛋白則與2個(gè)殼粒對(duì)結(jié)合以連接2個(gè)五鄰體核心，作為“骨架”搭建出二十面體框架，決定了衣殼的大小[15]；最后，三聚p72殼粒逐步填充框架，在p17等內(nèi)膜蛋白的協(xié)助下錨定形成三重對(duì)稱體，完成衣殼組裝[4]。衣殼裝配的同時(shí)，SUMO樣半胱氨酸蛋白酶S273R水解 加工pp220和pp62并在病毒內(nèi)膜前體的凹面處組裝成核心殼，抑制S273R的表達(dá)會(huì)形成非中心電子致密的類核和不規(guī)則厚度的衣殼，導(dǎo)致缺陷型二十面體顆粒的組裝[4,38]。另外，抑制病毒衣殼蛋白p72表達(dá)也影響前體蛋白pp220和pp62的翻譯后加工過(guò)程，未加工完成的前體蛋白組裝成“拉鏈狀”異常結(jié)構(gòu)，使得病毒顆粒因缺乏核心殼而不具備感染性[12]。鑒于ASFV編碼蛋白p17、p49、p54、H240R、S273R等在病毒裝配過(guò)程中的關(guān)鍵作用，針對(duì)這些蛋白研發(fā)基因缺失或亞單位疫苗，篩選有效的中和抗體或?qū)⒂兄诳刂艫SF疫情。

4.4 ASFV釋放

4.4.1 ASFV釋放過(guò)程 ASFV裝配完成后，再次經(jīng)由微管蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜，以“出芽”的方式釋放到細(xì)胞外[39]。在這一過(guò)程中，組裝成熟的病毒顆粒招募常規(guī)驅(qū)動(dòng)蛋白（conventional kinesin）到“病毒工廠”，ASFV顆粒被識(shí)別為“貨物”從核周組裝區(qū)域順行運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)膜[40]；隨后，病毒顆粒誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白聚合，在質(zhì)膜的內(nèi)表面形成特征性的肌動(dòng)蛋白尾部（actin tail）推動(dòng)其離開(kāi)宿主細(xì)胞表面[41]。病毒感染晚期引起的細(xì)胞溶解可能是病毒釋放的另一種機(jī)制，通過(guò)該途徑釋放的病毒顆粒沒(méi)有外囊膜包被[4]。微管在ASFV的侵入和釋放過(guò)程中都發(fā)揮了重要作用，而且ASFV感染能夠?qū)е挛⒐艿鞍滓阴；岣咂浞€(wěn)定性。因此，微管解聚類藥物能在一定程度上控制ASFV感染，可作為抗ASFV藥物研發(fā)的方向之一。

4.4.2 釋放相關(guān)蛋白 ASFV顆粒的順行運(yùn)輸由微管介導(dǎo)。在此過(guò)程中，衣殼蛋白E120R和p72相互作用招募大量驅(qū)動(dòng)蛋白，E120R與驅(qū)動(dòng)蛋白輕鏈C端的6個(gè)四肽重復(fù)序列（tetratricopeptide-repeat, TPR）結(jié)合從而驅(qū)動(dòng)病毒顆粒向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)[40]。抑制E120R的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)病毒顆粒保留在“病毒工廠”而無(wú)法向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，因此E120R是病毒釋放和傳播所必需的。CD2v（EP402R）蛋白位于胞外病毒顆粒的 外囊膜，在細(xì)胞內(nèi)則主要以89 kDa糖基化形式的全長(zhǎng)蛋白，以及63 kDa的N端糖基化片段和26 kDa的C端非糖基化片段出現(xiàn)[42]。C端非糖基化片段與全長(zhǎng)蛋白更多存在于核周病毒工廠區(qū)域的膜成分中，具有富含脯氨酸的PPPKPC重復(fù)序列，能夠與肌動(dòng)蛋白結(jié)合銜接蛋白SH3P7相互作用，參與囊泡運(yùn)輸和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；而N端胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域的糖基化片段在細(xì)胞質(zhì)中的分布更為分散，其依靠Ig-V結(jié)構(gòu)域可與具有CD2配體的豬紅細(xì)胞相結(jié)合[43]。在感染后期，CD2v蛋白大量定位于高爾基復(fù)合體膜以及與高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)相容的胞內(nèi)囊泡上，可能通過(guò)與網(wǎng)格蛋白銜接蛋白AP-1結(jié)合來(lái)影響經(jīng)高爾基體的細(xì)胞運(yùn)輸，進(jìn)而促進(jìn)病毒的包裝和釋放[44]。

5 討論

ASF是全球備受關(guān)注的重大動(dòng)物疫病，至今為止仍缺乏有效的防控手段。ASFV具有基因組大、編碼基因多、編碼蛋白多樣，免疫逃逸機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn)，但隨著病毒蛋白功能和形態(tài)形成機(jī)制的逐漸明晰，在ASF疫苗和新藥開(kāi)發(fā)、疫病防控等方面也取得了一定進(jìn)展。Quetglas等[45]發(fā)現(xiàn)，膽固醇在病毒內(nèi)化過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此他汀類降膽固醇藥物可有效抑制ASFV的體內(nèi)感染；絲氨酸蛋白酶可能在病毒組裝中發(fā)揮作用，Galindo等[46]發(fā)現(xiàn)其抑制劑也可用于對(duì)抗ASFV感染；驅(qū)動(dòng)蛋白介導(dǎo)的微管轉(zhuǎn)運(yùn)在病毒侵入和排出過(guò)程中均十分重要，Hernaez等[47]表明微管解聚藥物及動(dòng)力蛋白抑制劑也能夠有效抑制ASFV感染。可以預(yù)見(jiàn)的是，隨著對(duì)ASFV形態(tài)形成機(jī)制的進(jìn)一步了解，將會(huì)有更多針對(duì)病毒-宿主互作的抗病毒藥物投入研發(fā)和生產(chǎn)實(shí)踐。

ASFV編碼蛋白眾多，大多數(shù)功能未知，嚴(yán)重阻礙了病毒感染和復(fù)制分子機(jī)制的解析。不過(guò)隨著冷凍電鏡等蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)的成熟，目前已經(jīng)解析了部分ASFV編碼的復(fù)制相關(guān)蛋白晶體結(jié)構(gòu)信息：Liu等[48]通過(guò)測(cè)定apo-A104R和A104R-DNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，揭示了A104R-DNA相互作用的分子基礎(chǔ)，并發(fā)現(xiàn)二苯乙烯衍生物SD1和SD4可以破壞A104R-DNA結(jié)合從而抑制ASFV在豬巨噬細(xì)胞中的復(fù)制，這為ASFV治療藥物的研發(fā)提供了新思路；在另外一些研究中，Li等[49-51]解析了ASFV dUTPase E165R的結(jié)構(gòu)信息，鑒定了其活性中心（Motif II、III）及關(guān)鍵作用位點(diǎn)（S72、D91、Q120、F154），并篩選出了能特異性抑制E165R的小分子藥物；在此基礎(chǔ)上，Zhang等[52]成功制備了E165R關(guān)鍵結(jié)構(gòu)區(qū)域（Motif V）的單克隆抗體，為設(shè)計(jì)研發(fā)特異性靶向E165R的抗體藥物打下了良好基礎(chǔ)。

6 展望

目前，我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)已進(jìn)入“后ASF疫情時(shí)代”。隨著生物安全法的頒布實(shí)施，國(guó)內(nèi)關(guān)于ASF防控的各項(xiàng)生物安全措施會(huì)更加嚴(yán)格，這有助于疫情的進(jìn)一步控制。但與此同時(shí)，我國(guó)作為生豬養(yǎng)殖和消費(fèi)大國(guó)，跨區(qū)域的生豬相關(guān)產(chǎn)業(yè)鏈的調(diào)配活動(dòng)不可避免，仍存在ASF疫情擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)。因此，繼續(xù)加深對(duì)ASFV感染和增殖過(guò)程的認(rèn)知，深入解析ASFV形態(tài)的形成機(jī)制十分必要。本文對(duì)ASFV編碼蛋白在其形態(tài)形成過(guò)程中的作用和機(jī)制進(jìn)行全面闡述，希望有助于抑制或阻斷病毒復(fù)制的藥物研發(fā)和疫苗新靶點(diǎn)確認(rèn)，為ASF防控提供幫助。