熱激同源蛋白Hsc70 在病毒侵染過(guò)程中的機(jī)制研究

孫雙雙，李 俊，王文潔，柴文琦，周廣舟

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，鄭州 450001）

熱激蛋白（heat shock proteins, HSPs）是一類高度同源的分子伴侶蛋白，可在細(xì)胞應(yīng)對(duì)溫度變化、紫外線輻射、藥物處理和病原侵染等多種生理和壓力誘導(dǎo)下起到保護(hù)作用。HSPs蛋白一般都含有N末端的ATP結(jié)合區(qū)（nucleotide binding domain,NBD）、底物結(jié)合區(qū)（substrate binding domain,SBD）和C末端區(qū)域。其中分子量為70 kDa左右的HSPs家族成員非常保守，幾乎存在于所有生物中[1-2]。而HSP70的同源蛋白Hsc70（Heat-shock cognate protein 70），結(jié)構(gòu)非常接近HSP70家族成員，同源性也較高，在細(xì)胞內(nèi)多呈組成型表達(dá)模式，并在蛋白質(zhì)的重折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)泛素化降解等不同的蛋白質(zhì)量控制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，Hsc70還在病原感染特別是在病毒的侵染過(guò)程中參與介導(dǎo)吸附、內(nèi)吞、侵入、脫殼、轉(zhuǎn)錄和翻譯、病毒的組裝和出芽等多個(gè)復(fù)制循環(huán)進(jìn)程[3-4]，對(duì)病毒的基因組復(fù)制、病毒大分子合成和子代病毒裝配等產(chǎn)生重要影響。深入研究Hsc70蛋白在病毒侵染過(guò)程中的作用及其分子機(jī)制將有利于厘清不同病毒與宿主互作關(guān)系，且對(duì)開(kāi)發(fā)基于Hsc70靶點(diǎn)的抗病毒防控技術(shù)及藥物等方面都具有重要意義。本文將對(duì)近年來(lái)Hsc70蛋白在病毒復(fù)制循環(huán)不同階段發(fā)揮的作用等研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，以期為未來(lái)深入探討Hsc70在病毒侵染過(guò)程中的作用機(jī)制研究提供更多資料。

1 Hsc70 在病毒感染不同階段的作用分析

病毒侵入宿主細(xì)胞大致分為吸附、侵入、脫殼、病毒大分子合成、裝配及釋放等過(guò)程。在感染起始階段，病毒通過(guò)與細(xì)胞表面受體的結(jié)合吸附到受染細(xì)胞上，進(jìn)而通過(guò)融合、胞飲和內(nèi)吞等多種途徑穿過(guò)胞膜進(jìn)入胞漿。病毒還需要通過(guò)脫殼釋放出核酸組分，進(jìn)一步完成生物大分子的合成，包括病毒自身基因組復(fù)制、蛋白質(zhì)合成等，為最終的子代病毒裝配和釋放做好準(zhǔn)備。不同科的病毒完成這些步驟過(guò)程各異，有囊膜和無(wú)囊膜病毒之間或DNA病毒與RNA病毒之間均存在不同的路徑，其間需要不同的病毒結(jié)構(gòu)（非結(jié)構(gòu)）蛋白、宿主細(xì)胞相關(guān)蛋白和miRNAs等的參與，展示了極大的復(fù)雜性。而近些年的研究表明，Hsc70蛋白在不同科病毒感染宿主細(xì)胞過(guò)程中，在感染的不同階段都有可能發(fā)揮重要作用，對(duì)宿主的抗病毒免疫也有一定影響。

1.1 Hsc70參與病毒侵入過(guò)程 吸附和侵入是病毒進(jìn)行感染的前端重要步驟，這其中依賴于病毒自身的衣殼蛋白和細(xì)胞表面上的一些受體蛋白等的參與。盡管Hsc70主要分布在胞質(zhì)，并在胞質(zhì)和胞核之間穿梭參與多種生物反應(yīng)過(guò)程，但近年來(lái)的研究顯示Hsc70也可以被錨定在胞膜并可以作為一些病毒侵入過(guò)程中的受體[5]。登革病毒DENV感染C6/36細(xì)胞后，Hsc70會(huì)高度表達(dá)在細(xì)胞表面并經(jīng)歷重定位后同病毒包膜糖蛋白E互作，參與病毒的侵入。用Hsc70抗體孵育能有效阻斷DENV的吸附進(jìn)而抑制病毒的感染[6]。

此外，Hsc70蛋白也參與輪狀病毒的侵入過(guò)程[7-8]。研究表明輪狀病毒感染上皮細(xì)胞為一個(gè)多步驟過(guò)程，需要至少唾液酸、神經(jīng)節(jié)苷脂、整合素和Hsc70等的參與[9]。盡管其不同分離株通過(guò)不同的內(nèi)吞途徑侵入細(xì)胞，但該過(guò)程均需Hsc70的參與，如感染MA104細(xì)胞時(shí)預(yù)先用抗Hsc70抗體處理能抑制輪狀病毒的感染，輪狀病毒刺突蛋白VP4被切割為VP5和VP8亞片段并促進(jìn)病毒的侵入過(guò)程，這其中細(xì)胞內(nèi)Hsc70能結(jié)合到VP5片段上，作為病毒吸附后的細(xì)胞受體參與輪狀病毒感染。但進(jìn)一步地研究顯示，Hsc70蛋白的ATP結(jié)合區(qū)對(duì)輪狀病毒的感染卻起著負(fù)調(diào)控作用，與作為細(xì)胞受體的功能一起協(xié)同影響著病毒的侵入。在ATP存在的情況下，可溶性Hsc70能降低純化輪狀病毒的侵染性60%以上，提示Hsc70的ATP酶活性會(huì)部分抑制該病毒侵染力[10]。未來(lái)更多這方面的研究可能會(huì)有助于理解Hsc70在病毒侵入過(guò)程中的作用。

1.2 Hsc70參與病毒胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和解聚 病毒完成吸附之后會(huì)通過(guò)多種方式跨過(guò)細(xì)胞膜并脫殼實(shí)現(xiàn)基因組的內(nèi)化過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)Hsc70會(huì)參與到網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的病毒核酸內(nèi)吞過(guò)程中，其水解ATP的活性有助于網(wǎng)格蛋白的組裝和解聚循環(huán)[11]，進(jìn)而影響到多種包膜病毒的核衣殼解聚，如日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）[12]。該病毒是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用起始侵染的。當(dāng)使用敲除Hsc70后的JEV感染C6/36細(xì)胞時(shí)，該病毒只能吸附到細(xì)胞表面而不能進(jìn)一步被內(nèi)吞形成酸化的內(nèi)體，也不能釋放病毒RNA以便在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上翻譯，該過(guò)程提示Hsc70通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)吞參與到JEV的感染[13]。

除了包膜病毒之外，Hsc70還會(huì)影響一些無(wú)包膜病毒粒子的轉(zhuǎn)運(yùn)。猴病毒SV40通過(guò)小窩蛋白內(nèi)化并聚集在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，SV40病毒進(jìn)一步利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)合蛋白招募小四肽重復(fù)序列蛋白α（small glutaminerich tetratricopeptide repeat-containing protein alpha,SGTA）、Hsc70、Hsp105和Bag2等蛋白形成一個(gè)胞質(zhì)復(fù)合體，介導(dǎo)病毒由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)[14]。其中SGTA蛋白調(diào)節(jié)Hsc70同SV40的直接相互作用，而HSP105和Bag2激發(fā)SV40和Hsc70的解聚，從而完成病毒在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的轉(zhuǎn)位。除了協(xié)助SV40病毒的轉(zhuǎn)運(yùn)之外，對(duì)流感病毒的研究也顯示，Hsc70能與病毒NS2競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合到M1蛋白上，參與病毒核衣殼蛋白復(fù)合體（viral ribonucleprotein, vRNP）的核輸出，并在其復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15]。

除了參與病毒細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)外，Hsc70還參與一些病毒的脫殼過(guò)程。如對(duì)動(dòng)物呼腸孤病毒的研究顯示，病毒內(nèi)化入內(nèi)體后會(huì)逐步解聚暴露出核心組件為后續(xù)轉(zhuǎn)錄做準(zhǔn)備，這其中Hsc70會(huì)協(xié)助病毒衣殼蛋白μ1的δ片段的清除，進(jìn)而釋放具有轉(zhuǎn)錄活性的核心入胞質(zhì)，特異性Hsc70抗體會(huì)阻斷這一過(guò)程[16]。近年來(lái)，在一些植物病毒中也有類似的研究發(fā)現(xiàn)[17]。對(duì)黃瓜壞死病病毒（Cucumber necrosis virus, CNV）的研究表明，用重組Hsc70-2蛋白同CNV顆粒共孵育后會(huì)導(dǎo)致病毒衣殼構(gòu)象變化或部分解聚，在昆諾藜植株上產(chǎn)生大量病灶，提示Hsc70在該病毒感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

1.3 Hsc70調(diào)節(jié)病毒基因組復(fù)制 病毒需要依賴宿主細(xì)胞機(jī)器完成自身的基因組復(fù)制，目前已有研究顯示Hsc70蛋白可與病毒蛋白或基因組相互作用并幫助病毒在胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。如在MHV68鼠γ皰疹病毒感染的成纖維細(xì)胞系3T12上，鼠潛伏期相關(guān)核抗原蛋白（latency-associated nuclear antigen, LANA）能直接與Hsc70互作并招募后者到胞核，幫助形成病毒復(fù)制復(fù)合體進(jìn)而促進(jìn)病毒DNA復(fù)制和病毒晚期蛋白表達(dá)[18]。對(duì)人乙肝病毒（Hepatitis B virus, HBV）感染HepG2.2.15細(xì)胞的研究也顯示，下調(diào)細(xì)胞Hsc70蛋白表達(dá)會(huì)顯著降低病毒DNA復(fù)制水平超60%[19]，因此很多研究將Hsc70作為開(kāi)發(fā)潛在的抗HBV病毒藥物的理論靶點(diǎn)[20]。此外，在鴨肝病毒（Duck hepatitis B virus, DHBV）和腸病毒EV-71等感染宿主過(guò)程中，Hsc70也被發(fā)現(xiàn)參與病毒復(fù)制和組裝過(guò)程中[21-22]。最近，Mao等[23]對(duì)1株家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV）的研究也顯示，HSP/Hsc70在病毒的基因組復(fù)制、病毒擴(kuò)增和出芽等多個(gè)早期侵染時(shí)段發(fā)揮關(guān)鍵作用，也會(huì)對(duì)病毒蛋白的豐度產(chǎn)生一定影響，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其脫乙?；芡ㄟ^(guò)蛋白酶體介導(dǎo)的核輸入方式促進(jìn)BmNPV病毒的擴(kuò)增[24]。

除了同其他蛋白的互作之外，研究顯示Hsc70還可以與非編碼RNA（non-coding RNA, ncRNA）結(jié)合正向調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制，目前已在人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）、登革病毒（Dengue virus, DENV）和西尼羅河病毒（West Nile virus, WNV）等病毒的復(fù)制過(guò)程中得到證實(shí)[25-27]。近來(lái)對(duì)狂犬病病毒（Rabies virus, RABV）的研究也顯示，該病毒轉(zhuǎn)錄的一個(gè)稱為前導(dǎo)（leader RNA, leRNA）的小ncRNA能在病毒感染SK-N-SH細(xì)胞時(shí)干擾病毒基因組RNA和核衣殼的相互作用，達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的，而Hsc70通過(guò)下調(diào)leRNA來(lái)逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程[28]。此外，對(duì)埃博拉病毒（Ebola virus, EBOV）研究也表明，當(dāng)病毒感染HEK293T細(xì)胞時(shí)，其基因組非編碼區(qū)部分motif能同Hsc70相互作用，形成類似“鍋柄”樣結(jié)構(gòu)并利于病毒復(fù)制[29]。

除了上述正向調(diào)節(jié)之外，Hsc70對(duì)一些病毒的復(fù)制也會(huì)有負(fù)向效應(yīng)。Hsc70/HSP70能通過(guò)提供ATP裝載小RNA雙鏈體進(jìn)入精氨酸蛋白的方式參與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex,RISC）組裝。在DENV感染的Huh7細(xì)胞里，下調(diào)Hsc70抑制了miRNA介導(dǎo)的宿主RNA誘導(dǎo)的反應(yīng)，促進(jìn)了病毒基因組RNA的富集，展示了Hsc70蛋白在限制病毒復(fù)制方面的能力[30]。然而，DENV病毒編碼的一個(gè)RNA誘導(dǎo)抑制因子蛋白NS3，能同Hsc70蛋白互作后抑制miRNAs裝載到Ⅰ型精氨酸蛋白Ago1中，進(jìn)而利于病毒的復(fù)制。而最近，Li等[31]對(duì)鯉春彈狀病毒（spring viremia of carp virus, SVCV）的感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其糖蛋白G會(huì)在E3泛素連接酶MARCH8介導(dǎo)下進(jìn)行泛素化，而該過(guò)程需要Hsc70的參與，與G蛋白和MARCH8形成復(fù)合體，并最終引發(fā)G蛋白的溶酶體降解，進(jìn)而導(dǎo)致病毒復(fù)制的下降。這其中Hsc70起到類似“腳手架”的作用，從而參與病毒的復(fù)制過(guò)程。

1.4 Hsc70參與病毒的形態(tài)發(fā)生 病毒通常招募宿主因子和自身的結(jié)構(gòu)或非結(jié)構(gòu)蛋白等相互作用，共同參與子代病毒粒子的裝配和出芽等過(guò)程，Hsc70蛋白作為分子伴侶家族的成員經(jīng)常涉及其中。如對(duì)人丙肝病毒（Hepatitis C virus, HCV）的研究顯示，在感染Huh7.5細(xì)胞后，Hsc70能與HCV病毒核心和結(jié)構(gòu)蛋白E2共定位在細(xì)胞脂滴周圍，而該部位正是HCV組裝和釋放的重要位點(diǎn)。當(dāng)用RNA干擾沉默Hsc70之后能顯著降低病毒RNA的釋放，但對(duì)病毒的復(fù)制水平?jīng)]有影響，提示Hsc70是通過(guò)參與病毒的組裝或出芽等形式調(diào)控HCV侵染性的[32]。Peng等[33]利用一個(gè)Hsc70抑制劑IMB-DM122，干擾了Hsc70的衣殼化達(dá)到降低HCV侵染性的目的。而且，Hsc70別構(gòu)抑制劑能阻斷HCV在胞內(nèi)的裝配，但對(duì)侵入、復(fù)制和翻譯等過(guò)程沒(méi)有影響[34]。

此外，在人HBV和乳頭瘤病毒（Human papilloma virus, HPV）的研究上也取得了類似進(jìn)展[35-36]。如對(duì)非包膜病毒HPV的兩個(gè)衣殼蛋白L1和L2研究發(fā)現(xiàn)，L2可以通過(guò)招募L1蛋白到胞核并形成PML小體參與病毒組裝。而Hsc70可以在胞質(zhì)內(nèi)同L2蛋白C末端相互作用形成復(fù)合體，然后被轉(zhuǎn)位到PML小體內(nèi)。若敲除Hsc70后則阻斷了L2的核定位，進(jìn)而影響病毒的裝配，展示了Hsc70在L2蛋白整合入病毒衣殼過(guò)程中的必不可少的作用。

最近，Liang等[37]對(duì)感染水稻的呼腸孤病毒——南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)由該病毒非結(jié)構(gòu)蛋白P7-1構(gòu)成的含病毒小管侵染其宿主白背飛虱過(guò)程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解因子DNAJB12和它的胞質(zhì)伴侶分子Hsc70能被SRBSDV病毒激活并協(xié)助P7-1小管結(jié)構(gòu)從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向胞質(zhì)輸出。在此過(guò)程中，病毒和Hsc70均能直接結(jié)合到DNAJB12蛋白的J結(jié)構(gòu)域上。DNAJB12-Hsc70復(fù)合體被招募到P7-1小管內(nèi)，敲除兩者中的任一個(gè)都會(huì)顯著抑制P7-1小管結(jié)構(gòu)的組裝，并導(dǎo)致病毒在宿主中的有效傳播。這些結(jié)果再次展示了Hsc70在病毒裝配和傳染過(guò)程中的重要作用。

2 Hsc70 參與的宿主保護(hù)性免疫反應(yīng)

宿主機(jī)體可通過(guò)一系列精確的免疫應(yīng)答對(duì)外界入侵的病毒病原進(jìn)行消滅和清除，這其中涉及細(xì)胞天然免疫和適應(yīng)性免疫等抗病毒反應(yīng)過(guò)程，反過(guò)來(lái)一些病毒又會(huì)進(jìn)化出不同的免疫逃逸策略應(yīng)對(duì)宿主的免疫應(yīng)答。目前對(duì)Hsc70的研究發(fā)現(xiàn)其均能參與這些反應(yīng)過(guò)程中，并在宿主的保護(hù)性免疫中發(fā)揮重要功能。

如目前研究比較多的病毒感染后激起的細(xì)胞凋亡和自噬等程序性反應(yīng)途徑，Hsc70就被鑒定為是細(xì)胞線粒體自噬（chaperone-mediated autophagy,CMA）過(guò)程中的決定性組分，其能特異性選擇目標(biāo)蛋白并轉(zhuǎn)運(yùn)底物給受體—溶酶體相關(guān)蛋白（lysosomal associated membrane protein type 2A,LAMP2A），啟動(dòng)降解過(guò)程[38]。HCV感染誘導(dǎo)細(xì)胞的脂滴聚集，長(zhǎng)時(shí)間共培養(yǎng)游離脂肪酸和HCV能激活Huh7.5細(xì)胞的（chaperone-mediated autophagy,CMA）過(guò)程并下調(diào)Ⅰ型干擾素受體（IFN gamma to the interferon receptor, IFNAR1），破壞IFNα誘導(dǎo)的JAK-STAT抗病毒信號(hào)通路途徑[39]。IFNAR1在溶酶體膜上通過(guò)Hsc70和LAMP2A的相互作用被選擇性降解，Hsc70通過(guò)介導(dǎo)自噬抑制宿主的抗HCV免疫[40]。也有研究顯示HCV的NS5A蛋白能同Hsc70互作并招募Hsc70至肝細(xì)胞核因子1α（hepatocyte nuclear factor 1alpha, HNF-1α），進(jìn)而激起HNF-α的溶酶體降解，利于病毒的致病過(guò)程[41]。最近，對(duì)人類腺病毒的研究也顯示，其E1A原癌基因能通過(guò)拮抗Hsc70和IRF3的磷酸化抑制宿主的抗病毒反應(yīng)[42]。

除了上述的宿主抗病毒天然免疫之外，Hsc70還通過(guò)抗原呈遞系統(tǒng)參與宿主的適應(yīng)性免疫過(guò)程。Hsc70能呈遞抗原到CD4+T細(xì)胞，具有調(diào)節(jié)T和B細(xì)胞活化及后續(xù)的漿細(xì)胞分泌抗體的潛力[43]。對(duì)人HSV-2的研究就表明，基于Hsc70的HSV-2多肽疫苗能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的CD4+和CD8+T細(xì)胞免疫，表明Hsc70有助于CD4+T細(xì)胞識(shí)別抗原并加強(qiáng)宿主抗病毒免疫的能力，相關(guān)研究結(jié)果已用于臨床Ⅰ期試驗(yàn)[44]。

3 討論與展望

Hsc70是一個(gè)組成型表達(dá)的分子伴侶蛋白，在細(xì)胞內(nèi)參與多種不同的細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程。而在病毒感染的宿主細(xì)胞內(nèi)，Hsc70能被有包膜或無(wú)包膜病毒的DNA或RNA病毒利用，并在感染的不同階段發(fā)揮相應(yīng)功能。反過(guò)來(lái)，宿主也會(huì)利用Hsc70作為一個(gè)有效的靶點(diǎn)通過(guò)細(xì)胞天然免疫和適應(yīng)性免疫等多種途徑清除外源病毒。因此，深入研究Hsc70蛋白在不同病毒感染宿主過(guò)程中的作用及分子機(jī)制，將對(duì)厘清病毒與宿主相互作用關(guān)系及開(kāi)發(fā)基于Hsc70的抗病毒藥物及防控技術(shù)都有重要意義。

熱激蛋白及其同源家族成員多在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊及應(yīng)對(duì)外界壓力條件下起到修飾和保護(hù)作用。但有趣的是目前的大部分研究表明，在病毒感染時(shí)Hsc70蛋白多被病毒征用于不同階段的自身復(fù)制循環(huán)，從而在病毒對(duì)宿主細(xì)胞的侵染過(guò)程中起到正向調(diào)控作用。鑒于此，科學(xué)家以Hsc70為作用靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)了多種具有抗病毒潛力的抑制劑或小分子化合物等。HCV感染時(shí)，一些酪氨酸類似物如DCB-3503、外消旋亮氨酸等處理后，這些小分子能特異性結(jié)合到Hsc70蛋白N端的NBD結(jié)構(gòu)區(qū)并刺激胞內(nèi)ATP水解，最終能抑制病毒的翻譯過(guò)程[45]。傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus,IBDV）屬雙股 RNA 病毒科[46]，目前廣泛商品化使用的Hsc70抑制劑，VER-155008，作為一種ATP結(jié)構(gòu)類似物，將其處理IBDV感染的細(xì)胞后也能較好的抑制病毒的復(fù)制[47]。近來(lái)，針對(duì)Hsc70靶點(diǎn)的抗豬流行性腹瀉病毒（冠狀病毒科成員）（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）復(fù)制的化學(xué)小分子篩選和鑒定研究也獲得了一定進(jìn)展[48]。當(dāng)然，目前這方面的研究仍然有限，開(kāi)發(fā)基于Hsc70的具有更高抑制效果、更寬抗病毒譜和具有實(shí)際臨床應(yīng)用價(jià)值的化合物將是今后的研究重點(diǎn)。

盡管目前人們對(duì)Hsc70蛋白的功能有了越來(lái)越多的認(rèn)識(shí)，但畢竟早期只是把它作為胞內(nèi)的分子伴侶蛋白進(jìn)行研究，對(duì)其在病毒侵染過(guò)程中的功能探索并不全面。鑒于不同的病毒科成員在感染宿主過(guò)程中會(huì)有不同的路徑，會(huì)涉及不同的細(xì)胞通路途徑，有不同的細(xì)胞因子和病毒結(jié)構(gòu)（非結(jié)構(gòu)）蛋白的參與，深入闡明Hsc70蛋白在各類病毒感染進(jìn)程（吸附、侵入、擴(kuò)增和釋放等）中的作用及分子機(jī)制將對(duì)開(kāi)發(fā)針對(duì)Hsc70靶點(diǎn)的抗病毒策略至關(guān)重要。