牛支原體疫苗研究進(jìn)展

東 笑，陶 攀，王貴平,2，賈愛卿,2

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司 廣東省養(yǎng)豬與豬病防控技術(shù)研究企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 511400；2.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣州 511400）

牛支原體（Mycoplasmabovis,M.bovis）于1961年在美國首次被分離到[1]。感染牛支原體會(huì)引起支氣管肺炎、中耳炎、乳腺炎、生殖道疾病、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、角膜結(jié)膜炎等。牛支原體已經(jīng)被認(rèn)為是養(yǎng)牛生產(chǎn)的主要牛病原體之一[2]。2008年，我國首次從患有肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體[3]。隨后在14個(gè)省份的奶牛場中檢測到牛支原體存在，這表明牛支原體已經(jīng)在我國大范圍的傳播，因此防治牛支原體已經(jīng)迫在眉睫。由于牛支原體無細(xì)胞壁，可用于治療牛支原體感染的抗生素是有限的；并且大量報(bào)告表明，牛支原體對(duì)抗生素的耐藥性正在逐年上升[4]，這使得使用藥物防治牛支原體的成本不斷提高。因此，急迫需要通過接種疫苗的手段預(yù)防、控制，甚至凈化牛支原體。牛支原體疫苗的研究已經(jīng)進(jìn)行了很多年，從2017年到現(xiàn)在有三家單位研發(fā)的牛支原體疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，截止目前尚未完成注冊上市。本文主要對(duì)牛支原體的感染與免疫機(jī)制以及疫苗研究進(jìn)展（表1）進(jìn)行了綜述，以期為進(jìn)一步了解和研究牛支原體疫苗提供參考。

表1 牛支原體疫苗候選抗原Table1 Candidate antigen of Mycoplasma bovis vaccine

1 牛支原體的感染與免疫機(jī)制

1.1 牛支原體的感染機(jī) 制 黏附是支原體感染的首要步驟[5]。牛支原體能通過黏附素黏附于細(xì)胞表面。目前，研究表明P81、P68、P48等黏附相關(guān)膜蛋白，可變膜表面脂蛋白（virus-sized particles, Vsps）均與牛支原體黏附有關(guān)[6]；另外，α-烯醇酶、還原型輔酶Ⅰ氧化酶和亞甲基四氫葉酸RNA-（uracil-5-）-甲基轉(zhuǎn)移酶被鑒定為黏附素，它們可以與纖連蛋白和纖溶酶原結(jié)合，作為宿主細(xì)胞受體和細(xì)菌黏附之間的連接[7-8]，可能會(huì)促進(jìn)宿主的侵襲和牛支原體的傳播[9]。在牛支原體黏附宿主細(xì)胞過程中，會(huì)通過產(chǎn)生過氧化氫對(duì)宿主的細(xì)胞膜造成損傷[10]。對(duì)于牛支原體黏附后是否會(huì)入侵宿主細(xì)胞有相互矛盾的發(fā)現(xiàn)。一些研究評(píng)估顯示，牛支原體只黏附于細(xì)胞表面，不會(huì)轉(zhuǎn)移到支氣管上皮細(xì)胞內(nèi)[11]。與此相反，一些研究顯示牛支原體黏附于細(xì)胞表面，也可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并可以通過中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的吞噬作用遷移到中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中。V an等[12]研究表明，牛支原體Mb1株可以黏附并侵襲牛外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC），阻止其增殖。牛支原體是具有逃避和調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)能力的一類病原，在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)，牛支原體可以入侵任何類型的PBMC，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞分化和擴(kuò)散到任何宿主組織[12]。牛支原體入侵宿主細(xì)胞，并在胞內(nèi)持續(xù)存在，這有助于其逃避宿主的免疫應(yīng)答和抗生素的治療。逃避宿主機(jī)制包括抗原變異、抑制外周血單核細(xì)胞增殖、抗單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬作用、入侵紅細(xì)胞和上皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等[13]。

1.2 牛支原體的免疫機(jī)制 牛支原體可以誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生輔助性T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞，并以時(shí)間依賴的方式影響宿主產(chǎn)生IgM、IgG和IgA抗體。與IgG2相比，牛支原體誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的IgG1更占優(yōu)勢[14]。IgG1抗體具有低調(diào)理素效應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致體液免疫反應(yīng)不足和宿主中牛支原體的長期感染。牛支原體可通過直接激活淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，產(chǎn)生多種免疫調(diào)節(jié)產(chǎn)物。從宿主中消除牛支原體，細(xì)胞免疫反應(yīng)比體液反應(yīng)更成功[15]。通過接種疫苗可以增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)，以確保在疾病發(fā)作之前消除浸潤粘膜部位的牛支原體。由于牛支原體可以定植于上呼吸道和扁桃體粘膜，因此牛支原體通常會(huì)產(chǎn)生局部粘膜免疫，其特征是高血清IgG和IgA反應(yīng)[16]。這提示我們通過粘膜免疫防止牛支原體轉(zhuǎn)移到其他組織和關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生是必要的?？傊瑸榱祟A(yù)防牛支原體感染，全身抗體和局部粘膜部位的抗體都不可或缺。

2 牛支原體疫苗研究進(jìn)展

2.1 滅活疫苗 滅活疫苗是一種生產(chǎn)工藝簡單、免疫原性穩(wěn)定、使用較為安全的疫苗研發(fā)路線。滅活疫苗的研發(fā)相對(duì)比較簡單，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)主要包括病原的獲取、擴(kuò)繁、滅活等工藝的確定以及安全性和有效性評(píng)價(jià)等。目前，美國有兩種注冊的用于預(yù)防牛支原體感染的疫苗，分別為Mycomune@R和Pulmo-GuardTMMpB。Mycomune@R和Pulmo-GuardTMMpB制造商建議的免疫方式均為4周齡以上犢牛頸部皮下注射，然后在38 d和56 d進(jìn)行二免和三免。Soehnlena等[17]對(duì)這兩種疫苗預(yù)防牛支原體感染犢牛引起的呼吸系統(tǒng)疾病的效果進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明兩種疫苗都不能有效減少上呼吸道中牛支原體定植的數(shù)量，也不能減少牛支原體特異性病變的程度，免疫保護(hù)率分別為44%和小于1%。由此可見這兩種商 品化疫苗均不能很好的預(yù)防牛支原體引起的牛呼吸系統(tǒng)疾病。

除了美國的兩款商品化的牛支原體疫苗，還有一些處于研發(fā)驗(yàn)證階段的牛支原體滅活疫苗。Nicholas等[18]研究表明牛支原體86B/96株制備的滅活疫苗可產(chǎn)生強(qiáng)大的保護(hù)作用。他們從英國一牛場分離得到該菌株，使用皂苷作為佐劑制備成滅活疫苗，通過皮下接種到3～4周齡的犢牛中；3周后，使用噴霧途徑兩次攻入從匈牙利分離出的牛支原體強(qiáng)毒株5063株；攻毒后3周進(jìn)行解剖，期間觀察小牛的臨床癥狀和血清學(xué)反應(yīng)；結(jié)果顯示：接種組幾乎沒有臨床癥狀并且免疫6個(gè)月后的犢牛依舊可以檢測到高水平的體液免疫，未接種組出現(xiàn)肺部病變、直腸溫度顯著升高、體重增加顯著減少。楊銘偉等[19]研究表明牛支原體新疆分離株制備的滅活疫苗能夠產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)，并能抵抗牛支原體感染所致的肺臟病變。他們通過甲醛滅活并加入油佐劑乳化制備牛支原體滅活疫苗，隨后通過肌肉注射接種到10～15日齡的犢牛中，二免21 d使用相同菌株攻毒；通過分析抗體水平、臨床癥狀、病理變化等指標(biāo)表明制備的疫苗對(duì)牛支原體新疆分離株有較好的保護(hù)。Dudek等[20]證明牛支原體波蘭分離株KP795974制備的疫苗具有臨床保護(hù)作用；他們先將牛支原體皂苷混合成支原體-皂苷混合物，然后添加Emulsigen?佐劑制成雙佐劑疫苗，通過頸部皮下注射3～4周齡的犢牛進(jìn)行接種，3周后攻入同源菌株。通過臨床觀察、微生物學(xué)和免疫學(xué)測試表明，該疫苗減少了病理性肺損傷，阻止了病原入侵，產(chǎn)生了較高抗體水平并增強(qiáng)了IgA反應(yīng)[20]。北京生泰爾科技股份有限公司使用牛支原體CO株和新型603水佐劑制備滅活疫苗，為每頭牛經(jīng)頸部皮下接種疫苗，2.0 mL/頭，一免后21 d加強(qiáng)免疫一次。通過比較免疫組與安慰劑組在抗體水平、肺部病變、關(guān)節(jié)腫脹情況等方面的差異，從而認(rèn)為該疫苗有很好的保護(hù)效果且至少可以持續(xù)6個(gè)月。

2.2 弱毒活疫苗 弱毒活疫苗是通過自然篩選或人工致弱等手段獲得弱毒株后培養(yǎng)制備的疫苗。人工弱毒活疫苗又可以分為傳代致弱毒活疫苗與重組致弱毒活疫苗。與滅活苗相比，弱毒活苗具有的優(yōu)點(diǎn)是進(jìn)入機(jī)體后能呈現(xiàn)所有的相關(guān)抗原，無需多次免疫就能保持持久的免疫力，且生產(chǎn)費(fèi)用低廉。Zhang等[22]通過傳代致弱的方式，將牛支原體HB0101株（CCTCC＃M2010040）在41℃?zhèn)鞔?50代和180代使其產(chǎn)生變異而致弱，分別命名為P150和P180。為評(píng)估P150和P180菌株免疫后的保護(hù)作用，其將20頭5～6個(gè)月大的雌性牛分為P150組、P180組、陽性對(duì)照（PC）和陰性對(duì)照（NC）組共4組，每組5只。P150組和P180組分別在鼻腔滴入10 mL 109CFU P150和P180，免疫46 d后，連續(xù)3 d使用10 mL 1010CFU的HB0101指數(shù)期培養(yǎng)物對(duì)P150組、P180組和PC組進(jìn)行攻毒。根據(jù)病理學(xué)和肺部病理學(xué)評(píng)分，P150和P180免疫的保護(hù)率分別為87.7%和70.8%，說明P150和P180均具有較好保護(hù)作用，且P1 50更突出，更適合作為抗牛支原體感染的活疫苗候選株。

2.3 基因工程疫苗

2.3.1 亞單位疫苗 牛支原體亞單位疫苗的研究主要集中在牛支原體提取物及膜組分制備的傳統(tǒng)亞單位疫苗、3-磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）相關(guān)重組疫苗以及表面膜蛋白相關(guān)重組疫苗。分離提取細(xì)菌的莢膜多糖、類毒素、表面蛋白等成分可以制備傳統(tǒng)亞單位疫苗。Mulongo等[23]使用牛支原體總提取物以及膜組分作為抗原和含有未甲基化CpG基序的合成寡脫氧核苷酸（CpG ODN 2007）作為佐劑制備了兩種牛支原體傳統(tǒng)亞單位疫苗（總蛋白加膜蛋白組及膜蛋白組）。免疫實(shí)驗(yàn)表明，膜蛋白組僅IgG1滴度顯著增加，而總蛋白加膜蛋白組IgG1和IgG2滴度均顯著增加。但攻毒實(shí)驗(yàn)表明，總蛋白加膜蛋白組及膜蛋白組均不會(huì)誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)[23]。同時(shí)，該研究也說明CpG ODN 2007不會(huì)誘導(dǎo)平衡的Th1/Th2 抗體反應(yīng)。

作為潛在疫苗靶點(diǎn)受到關(guān)注的一種蛋白質(zhì)是保守的GAPDH蛋白。GAPDH不僅在葡萄糖代謝中起作用，還被證明可以結(jié)合細(xì)胞基質(zhì)，也被假定為毒力因子。GAPDH的這些特性表明該蛋白可作為保護(hù)性抗原。Prysliak等[24]使用牛支原體的GAPDH和一種宿主防御肽研制出了一種嵌合蛋白Gap-I，該蛋白保留了各個(gè)組分的特性，但通過免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Gap-I未能保護(hù)飼養(yǎng)場的牛，且還有損傷肺部的風(fēng)險(xiǎn)。也許對(duì)于牛支原體的GAPDH蛋白，需要評(píng)估抗原傳遞系統(tǒng)?？傊ＶгwGAPDH似乎不適合用于疫苗，因?yàn)槊庖叩膭?dòng)物無法抵御牛支原體的攻擊。

牛支原體具有3層膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)外2層為蛋白質(zhì)，中間層為糖脂和脂多糖構(gòu)成的脂質(zhì)層，這種膜結(jié)構(gòu)是抗原物質(zhì)的主要存儲(chǔ)場所。挑選表面膜蛋白作為疫苗靶標(biāo)有兩種思路：一種是選擇保守的蛋白質(zhì)，例如P81、P48；一種是免疫原性較高但高度可變的蛋白，例如可變表面蛋白（variantspecific surface proteins, Vsps）。張新竹等[25]將P81重組蛋白與弗氏佐劑混合制成疫苗對(duì)家兔進(jìn)行三次免疫，家兔可產(chǎn)生高水平抗體，免疫攻毒組兩只家兔在攻毒后體溫恒定，肺部病變較未免疫組輕，證明P81蛋白產(chǎn)生的抗體對(duì)家兔有較好的保護(hù)作用；但作者未在牛上開展免疫保護(hù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，不能證明P81蛋白在牛上也會(huì)出現(xiàn)保護(hù)[25]。研究顯示，直接感染牛支原體的牛比使用重組P48進(jìn)行免疫的牛的抗體水平更高，說明P48蛋白不能用作疫苗靶標(biāo)[26]。相對(duì)保守的牛支原體蛋白P26、HSP60、MilA、TrmFO、PdhA、PepA、Tuf、OppA、LppA、PepQ、O256、DeoB等都具有免疫反應(yīng)，但是否能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)作用還需進(jìn)一步驗(yàn)證[27-30]。Vsp家族由13種脂蛋白組成，它們可以通過基因重組產(chǎn)生高度的抗原變異[31]。在鑒定出的13種Vsps中，VspA、VspB和VspC具有最高的免疫原性[31]。表位作圖實(shí)驗(yàn)顯示，VspA、VspB、VspE和VspF蛋白出現(xiàn)在胚胎牛肺細(xì)胞黏附有相關(guān)的幾個(gè)區(qū)域；但是這些表位是線性的，因此它們可能不是理想的疫苗靶標(biāo)[31]。雖然高度可變的抗原具有較高的免疫原性，但從長遠(yuǎn)來看，高度抗原性變異可能會(huì)使疫苗無效。

2.3.2 DNA疫苗 DNA疫苗是指編碼的蛋白質(zhì)抗原基因通過克隆重組至真核表達(dá)質(zhì)粒，將純化的重組質(zhì)粒直接注射至體內(nèi)，使其抗原基因在機(jī)體細(xì)胞中表達(dá)出抗原，誘導(dǎo)體內(nèi)特定的細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，用于疾病預(yù)防或治療。目前還未見牛支原體DNA疫苗的相關(guān)報(bào)道，但是在其他支原體上已有大量報(bào)道。Wium等[32]開發(fā)并評(píng)估使用OppA蛋白作為抗原的針對(duì)鴕鳥支原體感染的DNA疫苗通過免疫實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)DNA疫苗能夠引發(fā)鴕鳥的免疫反應(yīng)?；跓嵝菘说鞍譖42的DNA疫苗在小鼠模型中誘導(dǎo)Th1和Th2免疫反應(yīng)，并且來自免疫小鼠的抗血清能夠在體外抑制豬肺炎支原體的生長[33]。LTB-P1C融合DNA疫苗在BALB/c小鼠模型中顯示可刺激針對(duì)肺炎支原體感染的免疫保護(hù)，病理炎癥較少[34]。這些研究的結(jié)果說明DNA疫苗可以被作為開發(fā)針對(duì)支原體感染的疫苗選擇。當(dāng)然，DNA疫苗在廣泛應(yīng)用之前，還需要克服靶基因選擇、免疫耐受性、注射DNA與動(dòng)物染色體的潛在整合以及體內(nèi)不受控制的表達(dá)等困難。

3 小結(jié)

牛支原體是引起牛呼吸道疾病綜合征的主要病原之一，也會(huì)引起奶牛的乳腺炎。由于牛支原體耐藥問題越來越嚴(yán)重，使得治療更加困難，飼養(yǎng)成本越來越高。另外，一直使用抗生素?zé)o法最終凈化牛支原體，也會(huì)造成耐藥性的公共安全問題。因此，迫切需要開發(fā)有效的疫苗來預(yù)防牛支原體感染。牛支原體疫苗包括滅活疫苗、減毒活疫苗和基因工程疫苗等多種類型。滅活疫苗存在使用一種分離株生產(chǎn)的疫苗可能無法對(duì)暴露于其他分離株的牛提供完全保護(hù)的問題。使用在所有牛支原體中都保守的重組蛋白可能是預(yù)防牛支原體感染更好的選擇。然而，使用傳統(tǒng)方法開發(fā)的牛支原體重組蛋白疫苗可能無法對(duì)牛產(chǎn)生最佳的保護(hù)作用。因此可能需要使用更先進(jìn)的方法，例如反向疫苗學(xué)，篩選具有保護(hù)性免疫反應(yīng)的候選抗原。

疫苗研制的一個(gè)重要環(huán)節(jié)就是疫苗評(píng)估，疫苗評(píng)估必須要做的工作是宿主動(dòng)物免疫攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)。因此為了能夠評(píng)估牛支 原體候選疫苗（無論是滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗還是DNA疫苗），呼吸道疾病和乳腺炎都需要可再現(xiàn)的攻毒模型。犢牛牛支原體氣溶膠挑戰(zhàn)模型對(duì)進(jìn)一步驗(yàn)證將是很有意義的[35]。除了可重復(fù)的攻毒模型，牛支原體 疫苗的開發(fā)過程中其他呼吸道病原體對(duì)牛支原體免疫效果的影響、Th-1和Th-2反應(yīng)的平衡、牛支原體的免疫逃避等問題也不可避免。另外，牛支原體感染與免疫機(jī)制的進(jìn)一步闡明也可能為更有效的疫苗開發(fā)提供便利。