通腦飲治療急性腦梗死的臨床療效及作用機(jī)制研究：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)

張林，高錦，吳明華，王廣梅

1.210000 江蘇省南京市，南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

2.210000 江蘇省南京市，南京中醫(yī)藥大學(xué)

3.210000 江蘇省南京市，南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江蘇省中醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

4.210000 江蘇省南京市，南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科

腦卒中是全球最嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題［1-2］，其中70%為腦梗死。目前，腦梗死最直接和有效的治療手段是采用靜脈溶栓、動(dòng)脈溶栓、機(jī)械取栓等手段迅速開(kāi)通閉塞血管，促進(jìn)血運(yùn)重建，挽救半暗帶區(qū)瀕死的神經(jīng)元［3］。但是，血運(yùn)重建后的缺血-再灌注損傷則會(huì)加重腦損害，治療缺血-再灌注損傷的藥物有自由基清除劑、阿片受體阻斷劑、興奮性氨基酸受體阻斷劑等神經(jīng)保護(hù)劑，但還沒(méi)有足夠的臨床證據(jù)支持廣泛運(yùn)用這些藥物［4］。

通腦飲能顯著改善急性腦梗死患者的神經(jīng)功能缺損癥狀，提高日常生活自理能力，在一定程度上降低致殘率，改善急性腦梗死患者的腦血流，改善血液供應(yīng)［5-6］。此外，其可以在急性腦梗死早期更大程度上發(fā)揮與抗血小板藥物的協(xié)同作用，顯著抑制血小板聚集，并改善血小板相關(guān)參數(shù)［7］。

通腦飲包含川芎、鉤藤、天南星、紅景天、九節(jié)菖蒲、天麻、僵蠶、水蛭。多藥配伍被認(rèn)為是中醫(yī)理論的精髓，然而，由于所涉及的成分復(fù)雜和目標(biāo)眾多，使用傳統(tǒng)方法充分闡明其機(jī)制具有挑戰(zhàn)性。因此，有必要從系統(tǒng)層面揭示通腦飲治療腦梗死的潛在機(jī)制?！吨嗅t(yī)藥振興發(fā)展重大工程實(shí)施方案》指出：支撐開(kāi)展中醫(yī)藥交叉學(xué)科研究，充分利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)說(shuō)明白中醫(yī)藥療效，講清楚中醫(yī)藥作用原理。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門(mén)基于系統(tǒng)生物學(xué)理論、生物系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)分析和多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)選擇的新學(xué)科。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)信號(hào)通路的多渠道調(diào)節(jié)，提高藥物的治療效果，減少不良反應(yīng)，從而提高新藥臨床試驗(yàn)的成功率，節(jié)約藥物研發(fā)成本。隨著系統(tǒng)生物學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷創(chuàng)新和發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已被確認(rèn)為有效和系統(tǒng)地闡明中藥的物質(zhì)組成和分子機(jī)制的可行選擇［7-8］。此外，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法已用于研究“復(fù)合蛋白/基因疾病”途徑，該途徑能夠從網(wǎng)絡(luò)角度描述生物系統(tǒng)、藥物和疾病之間的復(fù)雜性，與中醫(yī)藥共享類似的整體哲學(xué)［9］。應(yīng)用系統(tǒng)生物學(xué)方法研究中藥的藥理作用、作用機(jī)制和安全性，對(duì)現(xiàn)代中藥研究和發(fā)展具有重要意義。因此，一種稱為中醫(yī)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的新的跨學(xué)科方法被提出，其開(kāi)創(chuàng)了一種新的研究范式，將中醫(yī)從基于經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)變?yōu)檠C醫(yī)學(xué)。張伯禮院士帶頭的構(gòu)建“經(jīng)典文獻(xiàn)-組分篩選-藥理評(píng)價(jià)-臨床驗(yàn)證”技術(shù)流程將會(huì)為中醫(yī)現(xiàn)代化提供一個(gè)合適的技術(shù)平臺(tái)。此外，隨著分子生物學(xué)和基因組技術(shù)的最新進(jìn)展，越來(lái)越多的數(shù)據(jù)可用［10］。例如，TCMSP［11］、STRING［12］、OMIM［13］、DisGeNET［14-15］等。分子對(duì)接是一種通過(guò)受體的特性以及受體和藥物分子相互作用的方式設(shè)計(jì)藥物的方法，其是一種理論模擬方法，主要研究分子（如配體和受體）之間的相互作用，并預(yù)測(cè)它們的結(jié)合模式和親和力。

本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)通腦飲治療腦梗死的潛在機(jī)制。工作流程見(jiàn)圖1。

圖1 工作流程圖Figure 1 Work flow chart

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年1月—2020年6月江蘇省中醫(yī)院收治的199例腦梗死患者。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，將患者分為對(duì)照組（97例）和試驗(yàn)組（102例）。本研究經(jīng)江蘇省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理編號(hào)：2017NL-012-01）。在進(jìn)入小組之前，患者及其家屬被告知所有研究?jī)?nèi)容和相關(guān)權(quán)益，并充分了解，并在自愿參與的前提下簽署知情同意書(shū)。治療期間，對(duì)照組有1例不配合治療，最終有效病例為對(duì)照組96例，試驗(yàn)組102例。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《中國(guó)急性缺血性腦卒中診治指南2018》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［16］且48 h內(nèi)通過(guò)顱腦CT和磁共振檢查，確診為腦梗死；（2）通過(guò)頸動(dòng)脈彩色多普勒檢測(cè)，確定頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（CA-IMT）至少為1.2 mm；（3）自愿參加，依從性較好，并能堅(jiān)持隨訪。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）頸動(dòng)脈超聲示管腔斑塊導(dǎo)致血流嚴(yán)重堵塞；（2）合并嚴(yán)重心肺功能不全、心律嚴(yán)重失常者；（3）肝腎功能嚴(yán)重失調(diào)者；（4）重癥感染者及惡性腫瘤感染者；（5）冠狀動(dòng)脈急性癥候群；（6）過(guò)敏體質(zhì)或者藥物過(guò)敏者；（7）妊娠或哺乳的婦女。

1.2.3 剔除、脫落及終止標(biāo)準(zhǔn)：（1）對(duì)本研究使用的藥物有嚴(yán)重不良反應(yīng)者；（2）不遵醫(yī)囑或治療過(guò)程中因各種原因未完成療程或治療不全者；（3）治療期間發(fā)生嚴(yán)重疾病不能繼續(xù)治療者；（4）數(shù)據(jù)處理時(shí)發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)缺失的患者。

1.3 治療方法

入院后，兩組均接受穩(wěn)定型腦梗死的標(biāo)準(zhǔn)化治療，包括抗血小板聚集，口服拜阿司匹林片0.1 g，1次/d；氯吡格雷75 mg，1次/d，單用或兩藥聯(lián)用；抗動(dòng)脈硬化、穩(wěn)定斑塊（阿托伐他汀鈣片20 mg，1次/d或瑞舒伐他汀10 g，1次/d）、清除氧自由基等。試驗(yàn)組在對(duì)照組基礎(chǔ)上加用通腦飲治療［天南星10 g、川芎10 g、天麻10 g、鉤藤（后下）30 g、紅景天15 g、水蛭5 g、僵蠶10 g、九節(jié)菖蒲10 g］，水煎服，1副/d，服用2周。

1.4 觀察指標(biāo)

兩組均接受2周的治療，入院時(shí)和治療2周時(shí)評(píng)估美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評(píng)分和改良Rankin量表（mRS）評(píng)分。NIHSS用于評(píng)估腦卒中引起的功能損害程度，由11項(xiàng)測(cè)試組成，得分為0～42分。得分越高表示腦卒中越嚴(yán)重，與腦卒中造成的腦損傷呈正相關(guān)［17］。mRS用于測(cè)量腦卒中后患者神經(jīng)功能的恢復(fù)情況，分值為0～5分，分值越低，恢復(fù)狀態(tài)越好［18］。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.5.1 通腦飲化學(xué)成分篩選及成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)：從TCMSP和文獻(xiàn)中篩選通腦飲的化學(xué)成分（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）［19］。TCMSP是一個(gè)中草藥系統(tǒng)藥理平臺(tái)，可以得到藥物、靶標(biāo)和疾病之間的關(guān)系。根據(jù)通腦飲中的各種化合物的藥代動(dòng)力學(xué)吸收、分布、代謝和排泄，即ADME過(guò)程，對(duì)其進(jìn)行篩選。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)詳細(xì)描述了每種成分的ADME參數(shù)，包括口服生物利用度（OB）、藥物相似性（DL）、血-腦脊液屏障（BBB）等。OB表示藥物成分的口服可用性，DL表示成分和已知藥物之間的相似性。選擇滿足OB≥30%和DL≥0.18要求的成分來(lái)尋找該處方的有效成分。

1.5.2 預(yù)測(cè)所選化合物的靶蛋白：將所有活性成分輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以獲得其已知靶點(diǎn)，并使用Cytoscape 3.8.2工具繪制化合物和靶蛋白的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5.3 尋找與疾病相關(guān)的目標(biāo)：以“腦梗塞”為關(guān)鍵詞，OMIM（http://www.omim.prg/）和GeneCards（http://www.genecards.org/）用于搜索和篩選用于后續(xù)研究的已知疾病靶標(biāo)，并丟棄搜索結(jié)果中重復(fù)的靶標(biāo)。UniProt知識(shí)庫(kù)［20-21］（http://www.uniprot.org/）用于獲取標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)的名稱，并將該生物體選為“智人”。

1.5.4 通腦飲和腦梗死的常見(jiàn)靶點(diǎn)和關(guān)鍵靶點(diǎn)的研究：使用在線工具繪制Venn圖，Venn圖用于展示不同群組之間的聯(lián)系，在本研究中可以獲得靶點(diǎn)藥物與疾病的共同靶點(diǎn)。將獲得的交叉靶標(biāo)用作藥物效應(yīng)靶標(biāo)，并使用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建藥物效應(yīng)靶標(biāo)組分相互作用網(wǎng)絡(luò)。分析網(wǎng)絡(luò)以獲得其Degree值，Degree值反映靶點(diǎn)的關(guān)鍵程度，Degree值越高，藥物和靶點(diǎn)越重要，最終獲得關(guān)鍵藥物效果目標(biāo)。

1.5.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建：使用STRING（檢索相互作用基因/蛋白質(zhì)的搜索工具）數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)包含已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）。通過(guò)該數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建通腦飲在腦梗死中潛在靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.5.6 富集度分析：為了確定主要樞紐靶基因參與的生物過(guò)程和信號(hào)通路，使用注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)（David）進(jìn)行通路富集分析。將腦梗死中通腦飲的靶基因輸入到David基因本體（GO）生物過(guò)程分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路分析中。P≤0.01的GO生物過(guò)程和P≤0.01的KEGG途徑被認(rèn)為具有顯著富集性。

1.5.7 分子對(duì)接：為了確定通腦飲治療腦梗死的主要活性成分，對(duì)蛋白質(zhì)分子雄激素受體（androgen receptor，AR）的小分子進(jìn)行分子對(duì)接操作。首先從Pub Chem數(shù)據(jù)庫(kù)下載SDF格式的活性成分，然后利用Chem 3D進(jìn)行能量最小化計(jì)算將文件轉(zhuǎn)換為MOL2格式；通過(guò)RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載靶蛋白的PDB結(jié)構(gòu)文件，使用Auto Dock Tools軟件去除雜原子、計(jì)算電荷等；最后運(yùn)行Auto Dock Vina進(jìn)行分子對(duì)接，通過(guò)CB-Docl（http://clab.labshare.cn/cb-dock）將結(jié)果可視化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。計(jì)數(shù)資料和等級(jí)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，組內(nèi)治療前后比較采用配對(duì)秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床試驗(yàn)結(jié)果

治療前，兩組NIHSS和mRS評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，試驗(yàn)組NIHSS、mRS評(píng)分均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；兩組治療后NIHSS、mRS評(píng)分均低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組患者治療前后NIHSS、mRS評(píng)分比較［M（P25，P75），分］Table 1 Comparison of NIHSS and mRS scores before and after treatment between the two groups of patients

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 不同數(shù)據(jù)庫(kù)中通腦飲和CI的靶點(diǎn)識(shí)別：數(shù)據(jù)庫(kù)檢索篩選出通腦飲中的活性成分（表2），并使用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建了活性成分靶標(biāo)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖2）。通過(guò)關(guān)鍵詞搜索，在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得腦梗死的相關(guān)靶點(diǎn)。Venn圖構(gòu)建了活性成分靶標(biāo)和疾病靶標(biāo)的交集（圖3）。共有134個(gè)交叉靶點(diǎn)用于后續(xù)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析。

表2 通腦飲中的有效成分Table 2 Active ingredients in Tongnao Decoction

圖3 通腦飲治療腦梗死的靶點(diǎn)Venn圖Figure 3 Target Venn map of Tongnao Decoction in the treatment of cerebral infarction

2.2.2 尋找關(guān)鍵目標(biāo)并建立PPI網(wǎng)絡(luò)：將獲得的交叉靶標(biāo)用作藥物效應(yīng)靶標(biāo)，使用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建藥物效應(yīng)靶標(biāo)組分相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖4）。分析網(wǎng)絡(luò)以獲取其“度”值。具有Degree值的前20個(gè)藥效學(xué)靶點(diǎn)包括雌激素受體（ESR1）、AR、環(huán)氧合酶2（PTGS2）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）等（表3）。構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖展示各靶點(diǎn)之間的關(guān)系（圖5）。

表3 通腦飲治療腦梗死的關(guān)鍵靶點(diǎn)Table 3 Key targets of Tongnao Decoction in the treatment of cerebral infarction

圖4 通腦飲治療腦梗死的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 Target network map of Tongnao Decoction in the treatment of cerebral infarction

圖5 通腦飲治療腦梗死的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 5 Protein interaction network of Tongnao Decoction in the treatment of cerebral infarction

2.2.3 GO和KEGG的富集分析：根據(jù)P值，GO分析的BP的重要項(xiàng)目是細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞定位的調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)、化學(xué)刺激的細(xì)胞反應(yīng)、刺激的反應(yīng)，生物合成過(guò)程的正調(diào)節(jié)、信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)、血壓的調(diào)節(jié)、運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)，活性氧代謝過(guò)程的正調(diào)節(jié)等（圖6）。初步推斷通腦飲與腦梗死治療中的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。

圖6 GO生物過(guò)程富集分析Figure 6 GO biological process enrichment analysis

根據(jù)P值，KEGG分析共篩選出20條通路，包括前列腺癌癥、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、白介素（IL）-17信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路等（圖7）。

圖7 KEGG富集分析Figure 7 KEGG enrichment analysis

2.2.4 分子對(duì)接：得到3個(gè)活性成分與AR靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果，其中，AR與β谷甾醇結(jié)合最穩(wěn)定，得分為-10.1 kJ/mol，AR與山柰酚的對(duì)接組合得分為-7.5 kJ/mol，AR與胡蘿卜素的對(duì)接組合得分為-7.02 kJ/mol。對(duì)接三維視圖見(jiàn)圖8。

圖8 分子對(duì)接結(jié)果Figure 8 Molecular docking result

3 討論

3.1 概述

腦梗死主要是由向大腦供血?jiǎng)用}的動(dòng)脈粥樣硬化和血栓形成引起的，使管腔狹窄甚至閉塞，導(dǎo)致局灶性急性腦功能不全；也有異常物體（固體、液體和氣體）沿著血液循環(huán)進(jìn)入大腦動(dòng)脈或供應(yīng)大腦血液循環(huán)的頸動(dòng)脈，導(dǎo)致血流受阻或血流突然減少，導(dǎo)致相應(yīng)優(yōu)勢(shì)區(qū)域的腦組織軟化和受損。在本研究中，通腦飲被用于治療腦梗死。然而，用傳統(tǒng)方法闡明通腦飲治療腦梗死的復(fù)雜機(jī)制具有挑戰(zhàn)性。因此，將基于大數(shù)據(jù)生物信息學(xué)的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合到中醫(yī)藥治療疾病的分子機(jī)制研究中是至關(guān)重要的［22-23］。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討通腦飲治療CI的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。

目前西醫(yī)治療腦梗死的藥物很多，但是存在呼吸困難、胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)［24-26］。中藥具有多靶點(diǎn)、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)了121個(gè)藥物和疾病的共同靶點(diǎn)，這些靶點(diǎn)可能是治療腦梗死時(shí)該處方的靶點(diǎn)?；谕?fù)浞治?，本研究進(jìn)一步從121個(gè)后續(xù)研究的共同靶點(diǎn)中找到了23個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，包括ESR1、AR、DPP-4、PTGS2、CDK2等。其中，HSP90是一種普遍存在的分子伴侶［27］。HSP90抑制劑具有顯著的抗炎作用［28-29］。本研究GO分析、臨床試驗(yàn)和其他現(xiàn)代研究的結(jié)合證實(shí)了炎癥在腦梗死中的重要作用。KEGG富集分析顯示了IL-17（腦梗死中的信號(hào)通路）的重要地位。HSP90在這些通路中起著至關(guān)重要的作用。

本研究主要關(guān)注AR基因作為子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。分子對(duì)接是在小分子和編碼蛋白質(zhì)之間進(jìn)行的。在分子對(duì)接后，發(fā)現(xiàn)3種分子與AR直接相互作用：β谷甾醇、山柰酚和胡蘿卜素。預(yù)計(jì)進(jìn)一步的研究將評(píng)估這些分子之間的協(xié)同作用。

3.2 臨床意義

本研究使用NIHSS評(píng)分和mRS評(píng)分評(píng)價(jià)入院和出院時(shí)使用通腦飲和未使用通腦飲患者的狀況。結(jié)果顯示，治療后，試驗(yàn)組NIHSS評(píng)分和mRS評(píng)分均低于對(duì)照組。在一般西藥治療的基礎(chǔ)上，加上江蘇省中醫(yī)院協(xié)定方通腦飲可以顯著改善患者生活質(zhì)量。

3.3 局限性

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中確定的關(guān)鍵靶點(diǎn)和/或途徑尚未在臨床試驗(yàn)中得到驗(yàn)證，但本研究的臨床結(jié)果可以顯著比較使用通腦飲前后NHISS和mRS評(píng)分的改善，并證明通腦飲可以有效減少腦梗死的功能損害，對(duì)神經(jīng)有一定的恢復(fù)作用，并且可以有效抑制炎癥。然而，本研究尚未能夠探索具體機(jī)制，也沒(méi)有進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，即使結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的結(jié)果，仍然不能完全理解通腦飲的確切治療機(jī)制，未來(lái)將會(huì)針對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和臨床試驗(yàn)，探討通腦飲治療腦梗死的機(jī)制。結(jié)果表明通腦飲可能通過(guò)HSP90發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)的作用。此外，IL-17、催乳素、PI3KAkt信號(hào)通路也可能是潛在的機(jī)制。本研究證明了在西醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)上加上通腦飲，可以顯著改善腦梗死患者相關(guān)癥狀，通腦飲可以被認(rèn)為是腦梗死的補(bǔ)充或替代療法。此外，希望計(jì)算機(jī)生物學(xué)能夠?yàn)橹嗅t(yī)藥的現(xiàn)代研究提供一種途徑。

作者貢獻(xiàn)：吳明華提出研究思路，設(shè)計(jì)研究方案，研究命題的提出、設(shè)計(jì)；張林負(fù)責(zé)進(jìn)行試驗(yàn)或調(diào)查、調(diào)查對(duì)象的選取、樣本的采集、指標(biāo)化驗(yàn)與檢測(cè)等；張林、高錦負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、采集、清洗和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析、繪制圖表等；高錦負(fù)責(zé)論文起草；王廣梅負(fù)責(zé)最終版本修訂，對(duì)論文負(fù)責(zé)。

本文無(wú)利益沖突。