基于蛋白組學(xué)分析不同解凍方式下牛肉的品質(zhì)變化機(jī)制

林穎 鄺金艷 王麗 閆子康 李宗軍

摘 要：低頻電場解凍（low-frequency electric field thawing，LFEFT）與常溫解凍（room temperature thawing，RTT）會導(dǎo)致牛肉pH值、顏色、總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、質(zhì)構(gòu)特性和持水力等方面顯著不同，從分子水平解析LFEFT對牛肉品質(zhì)影響的可能機(jī)制，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對2 種解凍方式牛肉進(jìn)行分析。結(jié)果表明：LFEFT組與RTT組之間有551 個(gè)差異豐度蛋白（differentially abundant proteins，DAPs），其中14 種DAPs與牛肉品質(zhì)特性（pH值、色澤、TVB-N含量、質(zhì)構(gòu)和持水力）呈顯著相關(guān)；生物信息學(xué)分析表明，DAPs主要參與蛋白結(jié)合、代謝酶和蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)等生物功能。LFEFT既可以提高生產(chǎn)效率，又保證了牛肉品質(zhì)。

關(guān)鍵詞：低頻電場解凍；常溫解凍；牛肉；肉品質(zhì)；蛋白組學(xué)

Proteomics-Based Analysis of the Quality Change Mechanism of Frozen Beef under Different Thawing Methods

LIN Ying， KUANG Jinyan， WANG Li， YAN Zikang， LI Zongjun*

（College of Food Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China）

Abstract： Low-frequency electric field thawing （LFEFT） and room temperature thawing （RTT） lead to significant differences in the pH， color， volatile base nitrogen （TVB-N） content， textural properties and water-holding capacity of beef. In order to elucidate a possible mechanism for the effect of LFEFT on the quality of beef at the molecular level， the current study conducted a proteomic analysis of frozen beef thawed by LFEFT or RTT. The results showed that there were 551 differentially abundant proteins （DAPs） between the LFEFT and RTT groups. Among these， 14 were significantly correlated with quality traits （pH， color， TVB-N content， texture and water-holding capacity）. Bioinformatics analysis showed that DAPs were mainly involved in biological functions such as protein binding， metabolic enzymes and protein turnover. In summary， LFEFT can improve production efficiency while ensuring beef quality.

Keywords： low-frequency electric field thawing; room temperature thawing; beef; meat quality; proteomics

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240220-040

中圖分類號：TS251.1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號：1001-8123（2024）02-0009-08

引文格式：

林穎， 鄺金艷， 王麗， 等. 基于蛋白組學(xué)分析不同解凍方式下牛肉的品質(zhì)變化機(jī)制[J]. 肉類研究， 2024， 38（2）： 9-16. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240220-040.? ? http：//www.rlyj.net.cn

LIN Ying， KUANG Jinyan， WANG Li， et al. Proteomics-based analysis of the quality change mechanism of frozen beef under different thawing methods[J]. Meat Research， 2024， 38（2）： 9-16. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240220-040.? ? http：//www.rlyj.net.cn

牛肉是人類飲食結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)的重要來源[1]。過去10 年中，我國牛肉消費(fèi)量增長55%，占全球消費(fèi)量的11%，使我國成為世界上牛肉進(jìn)口增長最快的國家[2]。冷凍是保存肉類和肉制品的重要且方便的方法，在肉類工業(yè)中起至關(guān)重要的作用[3]。解凍是冷凍食品的最后一道工序[4]。解凍技術(shù)使用不當(dāng)會引起肉的物理、化學(xué)和質(zhì)構(gòu)特性變化，損害肉的品質(zhì)[5]。傳統(tǒng)的解凍技術(shù)，如常溫解凍（room temperature thawing，RTT），解凍時(shí)間長，肉的持水力下降，總揮發(fā)性鹽基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量高，蛋白質(zhì)降解嚴(yán)重，影響其品質(zhì)。針對傳統(tǒng)解凍的不足，目前國內(nèi)外學(xué)者對多種新型解凍技術(shù)進(jìn)行了研究，如微波解凍[6]、射頻解凍[7]等。微波解凍加熱效率快、解凍時(shí)間短，但在解凍較大的樣品時(shí)，存在局部過熱、樣品滲透性差和解凍不完全等問題。射頻解凍具有能量利用率高、解凍快等優(yōu)點(diǎn)，但是食品的介電特性、物料狀態(tài)等因素會影響該解凍方式的解凍效果，進(jìn)而影響食品感官品質(zhì)。因此，亟待探尋一種可改善牛肉解凍品質(zhì)、降低其脂質(zhì)和蛋白氧化程度的解凍技術(shù)，提高牛肉產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。低頻電場解凍（low-frequency electric field thawing，LFEFT）作為一種新型解凍技術(shù)，解凍效率高，肉類新鮮度保持較好，汁液損失率低，具有改善肉類解凍品質(zhì)的效果，在肉制品解凍領(lǐng)域具有較高的研究熱度。

蛋白質(zhì)組學(xué)作為生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，是在分子水平上探索肌肉蛋白質(zhì)與品質(zhì)特性間關(guān)系以及在蛋白質(zhì)水平揭示影響品質(zhì)性狀的生化過程和機(jī)制的有影響力的工具[8]。

蛋白質(zhì)作為肌肉的重要組成部分，其變化能夠引起肉品質(zhì)的改變。目前蛋白組學(xué)在國內(nèi)外肉類宰前應(yīng)激、宰后老化過程及品種鑒定中已有一定的應(yīng)用。趙娟紅[9]采用同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)定量分析豬肉貯藏過程中的蛋白變化規(guī)律，將不同貯藏溫度條件下的豬肉差異蛋白與品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)肌球結(jié)合蛋白C、肌鈣蛋白I、原肌球蛋白α1鏈等與pH值、TVB-N含量和色澤呈顯著相關(guān)。Malheiros等[10]利用雙向電泳結(jié)合噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測定內(nèi)洛爾公牛的蛋白質(zhì)組，確定熱休克蛋白、抗氧化蛋白及骨骼肌的代謝和結(jié)構(gòu)蛋白與牛的嫩度相關(guān)。Morzel等[11]提出，肌肉主要由大量的水分和蛋白質(zhì)組成，肉品科學(xué)與功能蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究密不可分。Fuente-Garcia等[12]評估牛屠宰前應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)組生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)有5 條蛋白條帶在正常肉和干硬肉之間具有顯著差異（P＜0.05），肌動蛋白、磷酸葡萄糖變位酶1、α-晶狀體蛋白B、熱休克蛋白β6和熱休克蛋白β1作為應(yīng)激病癥的生物標(biāo)志物。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)同樣已經(jīng)被應(yīng)用于檢測與牛肉顏色穩(wěn)定性相關(guān)的分子機(jī)制，胴體宰后溫度和pH值的下降均會導(dǎo)致顏色穩(wěn)定性的變化[13]。Zhang Yimin等[14]分析牛胸長肌宰后早期與能量代謝相關(guān)酶的變化，24 種代謝相關(guān)酶和熱休克蛋白在宰后不同時(shí)間采集的樣品中發(fā)生了變化。

蛋白組學(xué)在肉類領(lǐng)域具有一定的研究和應(yīng)用，但是關(guān)于新型解凍技術(shù)對比傳統(tǒng)解凍技術(shù)所引起肉類品質(zhì)差異的研究較少。本研究對LFEFT和RTT牛肉進(jìn)行差異蛋白組學(xué)研究，篩選差異蛋白，探究其功能和解凍機(jī)制，為提高冷凍肉品質(zhì)提供理論依據(jù)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳洲新鮮谷飼牛肉塊（后腿肉）購自沃爾瑪（湖南）商業(yè)零售有限公司。

濃硫酸、濃鹽酸、氯化鈉、甲基紅、亞甲基藍(lán)、乙醇、氧化鎂、硼酸、三氯乙酸、戊二醛、丙酮（均為分析純） 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NH4HCO3? ?美國Sigma公司；TMT標(biāo)記試劑盒、PierceTM肽段分級試劑盒 美國Thermo Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

低頻電場裝置 呼和浩特綠碧電子科技有限公司；3-18R型冷凍離心機(jī) 湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；NR200型色差儀 深圳三恩時(shí)科技有限公司；PHS-3E型pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TVT-6700型食品物性測試儀 英國Stable Micro Systems公司；Q-Exacitve HF-X型質(zhì)譜儀、Easy-nLC 1200型色譜系統(tǒng)、Trap column C18反相色譜柱（100 μm×20 mm，5 μm）? ?美國Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

購買牛肉后1 h內(nèi)將其放入裝有冰袋的保溫袋中運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室，去除外部可見脂肪和結(jié)締組織后切成質(zhì)量500 g、10 cm×8 cm×3 cm的塊狀，隨后放置于－20 ℃冰箱中凍結(jié)備用。

1.3.2 解凍方法

RTT：將密封袋包裝的肉樣放置在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行解凍，以肉塊中心溫度達(dá)到4 ℃為解凍終點(diǎn)。

LFEFT：將肉樣放置于低頻解凍設(shè)備，將溫度設(shè)置為4 ℃后開始解凍，以肉塊中心溫度達(dá)到4 ℃為解凍終點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)使用的低頻電場裝置由電壓發(fā)電機(jī)（交流電220 V、50 Hz）和平板電極（580 mm×280 mm）組成。由于板電極垂直放置，牛肉沒有直接接觸板電極，與板電極平行。低頻電場裝置和肉樣放置如圖1所示，電壓發(fā)電機(jī)輸出電壓為4 000 V，電流為0.2 mA，放電距離為290 mm。在LFEFT組，低頻電場裝置應(yīng)用于解凍的整個(gè)過程。

采用不同方式解凍后，收集肉塊中心部分（約5 g），每組樣品分別含3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本，立即在液氮中冷凍，保存于－80 ℃，用于蛋白組學(xué)分析，其余部分用于肉質(zhì)指標(biāo)測定。

1.3.3 肉質(zhì)指標(biāo)測定

1.3.3.1 pH值

參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品pH值的測定》。

1.3.3.2 色度

參照張莉等[15]的方法，將肉樣取出后用吸水紙擦干其表面的水分并置于實(shí)驗(yàn)臺表面，同時(shí)對色差儀進(jìn)行校準(zhǔn)，校準(zhǔn)完畢測定樣品的亮度值（L*）、紅度值（a*）及黃度值（b*），每個(gè)樣品隨機(jī)選取6 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測定，結(jié)果取平均值。

1.3.3.3 質(zhì)構(gòu)特性

取解凍后的牛肉，切為2.0 cm×2.0 cm×1.0 cm，使用P36R平底柱形探頭，設(shè)置參數(shù)為：回程距離25 mm，形變量50%，測前速率2 mm/s，測試速率1 mm/s，2 次測量間隔5 s，探針自動觸發(fā)。每組樣品平行測定3 次。測定樣品的硬度、彈性和咀嚼性。

1.3.3.4 TVB-N含量

參照GB 5009.228—2016《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》。

1.3.3.5 汁液損失率

離心損失率：參照馬翼飛等[16]的方法，稱取解凍后的牛肉2 g，用濾紙包好后，4 ℃、5 000 r/min條件下離心25 min，去掉濾紙后，測定離心后牛肉的質(zhì)量，離心損失率按式（1）計(jì)算：

式中：m1為實(shí)驗(yàn)前肉樣質(zhì)量/g；m2為離心后肉樣質(zhì)量/g。

滴水損失率：參照雷露等[17]的方法，將解凍后的肉樣修剪成20 mm×30 mm×50 mm的肉塊，用細(xì)鐵絲掛住，套上保鮮袋（肉樣與保鮮袋不接觸），懸掛于4 ℃冰箱中，24 h后測定肉塊質(zhì)量，滴水損失率按式（2）

計(jì)算：

式中：m3為實(shí)驗(yàn)前肉樣質(zhì)量/g；m4為24 h后肉樣質(zhì)量/g。

總損失率按式（3）計(jì)算：

1.3.4 蛋白樣品制備

將樣品置于4 ℃復(fù)融，每個(gè)樣品中分別加入200 ?L蛋白裂解液（含4 g/100 mL十二烷基磺酸鈉、100 mmol/L

二硫蘇糖醇、150 mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液），冰浴超聲2 min。4 ℃、16 000×g離心20 min，取上清，采用二喹啉甲酸試劑盒進(jìn)行蛋白定量。每個(gè)樣品各取300 μg蛋白進(jìn)行溶液內(nèi)酶解，步驟如下：每個(gè)樣品中分別加入適量1 mol/L二硫蘇糖醇至終濃度10 mmol/L，沸水浴5 min，冷卻至室溫；加入適量800 mmol/L吲哚乙酸至終濃度50 mmol/L，600 r/min振蕩1 min，避光室溫放置30 min；加入6 倍體積冷丙酮試劑，置于－20 ℃孵育過夜，沉淀蛋白；16 000×g離心30 min，去除上清液，保留蛋白沉淀；加入適量丙酮試劑清洗蛋白沉淀，重復(fù)2 次；將蛋白沉淀樣品置于通風(fēng)櫥風(fēng)干，去除有機(jī)試劑；加入150 ?L 0.04 μg/μL胰酶緩沖液，600 r/min振蕩1 min，37 ℃孵育酶解16～18 h；加入100 μL 0.1 g/100 mL三氯乙酸溶液，酶解后的肽段使用C18色譜柱脫鹽，真空凍干后用0.1 g/100 mL三氯乙酸溶液復(fù)溶，脫鹽處理，進(jìn)行肽段定量。

1.3.5 TMT肽段標(biāo)記與肽段分級

每個(gè)樣品分別取100 μg肽段進(jìn)行標(biāo)記。將每組標(biāo)記后的肽段等量混合，干燥后的肽段使用High-pH反相色譜柱進(jìn)行分級分離，最終將樣品收集合并為10 個(gè)組分，每個(gè)組分的肽段干燥后用0.1%甲酸復(fù)溶，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析。

1.3.6 LC-MS/MS分析

每個(gè)樣品取適量肽段使用納升流速色譜系統(tǒng)進(jìn)行色譜分離。緩沖液：A液為0.1%甲酸溶液，B液為體積分?jǐn)?shù)95%乙腈溶液（含0.1%甲酸）。色譜柱以100%的A液平衡。樣品進(jìn)樣到Trap column C18色譜柱（100 ?m×20 mm，5 ?m）后經(jīng)過C18色譜分析柱（75 ?m×150 mm，3 ?m）進(jìn)行梯度分離，流速為300 nL/min。液相分離梯度如下：0～2 min，2%～8% B；2～42 min，8%～30% B；42～49 min，30%～45% B；49～50 min，45%～100% B；50～60 min，100% B。肽段分離后進(jìn)行數(shù)據(jù)依賴采集（data-dependent acquisition，DDA）質(zhì)譜分析。

1.3.7 數(shù)據(jù)庫搜索和分析

采用Proteome Discoverer 2.4軟件分析數(shù)據(jù)，根據(jù)DDA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)解析和蛋白質(zhì)鑒定，從而獲得蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果、功能注釋和相對定量等數(shù)據(jù)。肽和蛋白質(zhì)鑒定的錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率設(shè)為1%。采用TMT報(bào)告離子強(qiáng)度進(jìn)行定量。

1.3.8 生物信息學(xué)分析

使用Perseus軟件、Microsoft Excel和R統(tǒng)計(jì)計(jì)算軟件對生物信息學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。以蛋白表達(dá)差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.2或＜0.83且P＜0.05為臨界值，篩選出差異豐度蛋白（differentially abundant proteins，DAPs）。根據(jù)表達(dá)水平對DAPs進(jìn)行分層聚類。序列注釋信息來自UniProtKB/Swiss-Prot、京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和基因本體論（gene ontology，GO）。此外，利用STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

肌肉質(zhì)量數(shù)據(jù)通過SPSS Statistics 26.0軟件和Duncan多重范圍進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性定義為P＜0.05。使用R語言工具包（RVersion 4.1.2）對圖像進(jìn)行分析，并對肌肉品質(zhì)特征與蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析、火山圖繪制和層次聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同解凍方式下牛肉的品質(zhì)特性

由表1可知，RTT組牛肉pH值顯著低于LFEFT組牛肉（P＜0.05），其原因是解凍方式誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致氫離子的釋放[18]和肉中水分的損失。低頻電場通過減少牛肉的收縮而潛在地減少能量代謝，從而延緩pH值的降低。在色澤方面，RTT組L*和a*均顯著低于LFEFT組，是由于冷凍-解凍處理后會損耗肉中的水分，導(dǎo)致L*降低，a*的降低是由于在解凍過程中肌紅蛋白氧化生成高鐵肌紅蛋白。RTT組牛肉b*顯著高于LFEFT組，原因是肌肉中的蛋白質(zhì)發(fā)生氧化，導(dǎo)致黃色色素積累。牛肉在電場環(huán)境下解凍b*較低，說明肌肉中的蛋白質(zhì)氧化程度較低。這進(jìn)一步表明LFEFT可以改善肉品色澤。與RTT組牛肉相比，LFEFT處理后的牛肉硬度、彈性和咀嚼性均有所提高，這與李翰卿等[19]的研究一致，電場解凍時(shí)間短，樣品內(nèi)外同時(shí)解凍，溫差小使肉樣的肌肉纖維結(jié)構(gòu)緊密，肌肉質(zhì)構(gòu)特性保持較好。而TVB-N產(chǎn)生是由于肉品在腐敗過程中，微生物的分解會使蛋白質(zhì)產(chǎn)生氮及胺類等揮發(fā)性堿性含氮物質(zhì)[20]。LFEFT處理后的牛肉TVB-N含量顯著低于RTT組，新鮮度較高，這與王麗等[21]研究結(jié)果一致。這表明LFEFT能夠減少牛肉蛋白質(zhì)分解，有效延長其貨架期。LFEFT處理后的牛肉離心損失率和滴水損失率均顯著低于RTT組，這與Zhang Yaming等[22]的研究結(jié)果一致。由于LFEFT速率快，對牛肉的蛋白質(zhì)變性程度影響較小，冰晶生長速率較均勻，從而導(dǎo)致解凍過程中對細(xì)胞的刺穿更少，肌肉的組織結(jié)構(gòu)保持更好，汁液損失減少[23]，牛肉持水力較高。且在解凍過程中，隨著冰晶的融化，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)親水膠質(zhì)體吸收水分，使水分逐漸向細(xì)胞內(nèi)滲透和擴(kuò)散的現(xiàn)象，電場解凍速率大，因此冰晶解凍的汁液全部向細(xì)胞內(nèi)滲透而不至外溢流失。

2.2 蛋白質(zhì)鑒定和定量

經(jīng)數(shù)據(jù)篩選，共檢出15 507 條多肽和11 338 條獨(dú)特多肽，與2 333 個(gè)蛋白匹配，如圖2所示，大多數(shù)蛋白的肽段數(shù)量≤3，占55.29%。如圖3所示，篩選的蛋白序列覆蓋率較高，46.4%的蛋白序列覆蓋率超過10%，22.9%的蛋白序列覆蓋率超過20%。

2.3 DAPs的比較

如圖4所示，在LFEFT與RTT組的比較中，共有551 個(gè)DAPs。火山圖直觀顯示了DAPs的變化，其中藍(lán)色為上調(diào)蛋白，紅色為下調(diào)蛋白。采用分層聚類熱圖可視化區(qū)分蛋白質(zhì)子集和DAPs，觀察2 個(gè)處理組樣本的差異，有助于蛋白質(zhì)的量化。如圖5所示，實(shí)驗(yàn)具有可重復(fù)性，且不同處理組間存在顯著差異。

2.4 DAPs的GO和KEGG富集分析

GO富集包含3 個(gè)重要的生物功能本體：生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。如圖6所示，通過對551 個(gè)DAPs進(jìn)行序列比對，GO條目匹配到526 個(gè)DAPs，共分為40 類，23 個(gè)注釋到BP，2 個(gè)注釋到MF，15 個(gè)注釋到CC。BP以細(xì)胞過程和代謝過程最為顯著，CC主要富集在細(xì)胞解剖結(jié)構(gòu)和含蛋白質(zhì)的復(fù)合物等組分中，MF主要富集在結(jié)合力和催化活性2 個(gè)方面。就GO結(jié)果而言，這些DAPs最有可能被識別出是因?yàn)樗鼈兪艿嚼鋬鲞^程中產(chǎn)生冰晶的影響，破壞肌肉的完整性，導(dǎo)致解凍損失，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)損失，并改變?nèi)庵械鞍踪|(zhì)的功能特性。

利用KEGG數(shù)據(jù)庫對LFEFT和RTT處理后的牛肉進(jìn)行差異蛋白代謝通路分析，共富集到263 條代謝通路，其中顯著富集（P＜0.05）的有58 條，排名前20的通路如圖7所示。LFEFT與RTT組牛肉的DAPs主要參與代謝途徑、氧化磷酸化、氨基酸生物合成、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)、碳代謝、糖酵解和產(chǎn)熱。肉類在冷凍和解凍過程中會導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解，影響肉質(zhì)。蛋白質(zhì)降解過程中，當(dāng)肽鍵斷裂時(shí)產(chǎn)生氨基酸，這些氨基酸進(jìn)一步脫氨基形成碳骨架，參與碳代謝。氨基酸碳骨架氧化的主要途徑是TCA循環(huán)，其中丙酮酸被代謝。此外，在解凍過程中，能量主要通過糖酵解代謝產(chǎn)生，從而參與產(chǎn)熱。

2.5 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

PPI網(wǎng)絡(luò)中，節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，連接線代表蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)。如圖8所示，還原型輔酶I（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）脫氫酶[泛醌]1α亞復(fù)合物亞基8（P42029）、線粒體（NDUFB8）、ATP合酶亞基δ（ATP5F1D）、細(xì)胞色素b-c1（P00129）、羥酰輔酶A脫氫酶（Q2KJC5）、肌球蛋白重鏈（F1MM07）、蘋果酸脫氫酶（Q32LG3）等與其他蛋白質(zhì)的相互作用評分高于0.99，表明這些蛋白質(zhì)的相互作用對解凍牛肉的質(zhì)量至關(guān)重要。

2.6 DAPs與牛肉品質(zhì)特性的相關(guān)性

如圖9所示，各DAPs與多個(gè)肌肉品質(zhì)指標(biāo)均呈顯著相關(guān)，表明這些DAPs可作為評價(jià)LFEFT對牛肉品質(zhì)影響的潛在生化指標(biāo)。

NADH脫氫酶（P42029）位于線粒體內(nèi)膜，催化NADH向輔酶Q的電子傳遞，是線粒體氧化磷酸化的開始，是厭氧代謝中電子由NADH或還原型黃素二核苷酸傳遞合成ATP的主要途徑。NADH脫氫酶（P42029）與pH值呈高度顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001）。LEFET組NADH脫氫酶（P42029）表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致電子轉(zhuǎn)移活性降低，終止速率加快，后期生化反應(yīng)ATP產(chǎn)生減少。而RTT組ATP消耗更快，因此進(jìn)行更多的無氧呼吸，產(chǎn)生更多乳酸，pH值下降[24]。L-乳酸脫氫酶（B0JYN3）將（S）-乳酸和氧化型輔酶I轉(zhuǎn)化為丙酮酸和NADH，可能對糖酵解過程有抑制作用[25]。由相關(guān)性分析結(jié)果可知，L-乳酸脫氫酶（B0JYN3）與pH值呈高度顯著正相關(guān)（P＜0.001），說明與RTT組相比，LFEFT組牛肉的糖酵解速率減慢，從而延緩了pH值的降低。

PDZ結(jié)構(gòu)域是一種由80～100 個(gè)氨基酸殘基組成的保守序列，是一種介于二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間的結(jié)構(gòu)[26]。LIM蛋白在機(jī)體的生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[27]。PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域蛋白1（A6H7E3）與TVB-N含量呈高度顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001），說明PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域蛋白1的豐度越高，TVB-N含量越少，牛肉的新鮮度越高。LFEFT組的PDZ和LIM結(jié)構(gòu)域蛋白1（A6H7E3）的豐度高于RTT組，說明LFEFT牛肉品質(zhì)較好。

在與色澤的相關(guān)性分析中，細(xì)胞色素C（P62894）與L*呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與b*呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。細(xì)胞色素C（P62894）是生物氧化過程中一個(gè)非常重要的電子傳遞體，在線粒體嵴上與其他氧化酶排列成呼吸鏈，參與細(xì)胞呼吸過程[28]。LFEFT組中細(xì)胞色素C（P62894）的豐度高于RTT組，說明采用LFEFT更有利于維持牛肉色澤的穩(wěn)定性。超氧化物歧化酶也是和肉色相關(guān)的一種抗氧化蛋白，它可以破壞在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生且對生物系統(tǒng)有毒的自由基，維持牛肉品質(zhì)的穩(wěn)定，與RTT組相比，LFEFT組超氧化物歧化酶（E1BHL1）上調(diào)，與L*呈高度顯著正相關(guān)（P＜0.001），與a*呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與b*呈高度顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001）。說明低頻電場有助于防止解凍引起的牛肉變色。

在與質(zhì)構(gòu)特性的相關(guān)性分析中，肌球蛋白重鏈（F1MM07）、肌鈣蛋白（P63315）與質(zhì)構(gòu)特性（硬度、彈性和咀嚼性）呈高度顯著正相關(guān)（P＜0.001）。肌球蛋白重鏈?zhǔn)羌∏虻鞍椎幕窘M成單位，在保證肌細(xì)胞發(fā)揮正常作用中具有重要作用。Lan Weiqing等[29]指出，不適當(dāng)?shù)慕鈨隹赡軙斐杉∏虻鞍字劓溄到?。本研究結(jié)果表明：LFEFT組牛肉中肌球蛋白重鏈（F1MM07）上調(diào)，說明相比于RTT，LFEFT對牛肉的硬度、彈性和咀嚼性具有更小的影響。肌鈣蛋白是橫紋肌特定的蛋白質(zhì)，在肌肉收縮和舒張過程中起重要調(diào)節(jié)作用[9]。RTT組牛肉中肌鈣蛋白（P63315）下調(diào)，說明LFEFT對牛肉的彈性和咀嚼性影響更小。

核糖體可以將遺傳密碼翻譯成氨基酸序列，并從氨基酸單體構(gòu)建蛋白質(zhì)聚合物。核糖體相關(guān)蛋白在LFEFT組中全部上調(diào)，進(jìn)一步證明低頻電場能有效維持肌肉組織細(xì)胞的完整性。此外，核糖體參與許多生物過程，包括mRNA轉(zhuǎn)錄和抑制[30]。當(dāng)肌肉受到低頻電場的作用時(shí)，核糖體試圖通過促進(jìn)mRNA衰變進(jìn)一步維持細(xì)胞穩(wěn)定性，因此相關(guān)蛋白上調(diào)[31]。如圖9所示，核糖體蛋白（G5E6D6）與pH值、硬度和彈性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。在先前的報(bào)道中，核糖體途徑相關(guān)蛋白在冷應(yīng)激下發(fā)生改變[32]，并且核糖體蛋白質(zhì)的平衡水平抑制細(xì)胞生長和增殖[33]，可以推斷，在低頻電場的幫助下，解凍期間肌肉的冷收縮程度降低。

張淼[34]發(fā)現(xiàn)，在汁液損失高的樣品中結(jié)蛋白含量較高，肌原纖維的橫向交聯(lián)加強(qiáng)，增加了肉的汁液損失，而結(jié)蛋白的降解消除了肌原纖維間的交聯(lián)，迫使水分遷移至細(xì)胞間的力消失，而且已經(jīng)遷移至細(xì)胞間的水分可能回吸至細(xì)胞內(nèi)，增加肉的持水性。LFEFT組的結(jié)蛋白（O62654）下調(diào)，汁液損失率低，因而，結(jié)蛋白與總損失率呈高度顯著正相關(guān)（P＜0.001）。

整合素是細(xì)胞外基質(zhì)和肌動蛋白之間的連接點(diǎn)。局灶性黏連是含有多蛋白整合素的復(fù)合物[35]。Talin-1（A0A3Q1MLQ7）作為黏著斑的中心蛋白，參與整合素的激活并將其連接到肌動蛋白細(xì)胞因子[36]。蛋白質(zhì)整合素的降解可能不利于保水能力，也被證明與牛肉中滴漏通道的形成有關(guān)[37]。在LFEFT與RTT組牛肉比較中，Talin-1（A0A3Q1MLQ7）與滴水損失率呈高度顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001），滴水通道的形成有助于提高水分從肌肉細(xì)胞“逃逸”的能力，說明LFEFT組的保水能力高于RTT組。

綜上，在冷凍和貯藏過程中，肌肉組織中形成的冰晶不僅在解凍過程中造成水分損失，而且還通過破壞肌漿網(wǎng)，導(dǎo)致肌漿網(wǎng)釋放鈣離子，激活A(yù)TPase并加速ATP分解，還可以暴露肌動蛋白和肌球蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，使肌動蛋白和肌球蛋白結(jié)合，從而引起肌肉收縮，進(jìn)一步影響肌肉質(zhì)量；并且ATP的產(chǎn)量也有所下降，同時(shí)冷凍形成的冰晶破壞肌酸激酶活性，從而減少磷酸肌酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)生ATP的量（圖10）。在低頻電場的幫助下，水分子之間的氫鍵被破壞，水分子旋轉(zhuǎn)形成小而密集的冰晶，減少對肌肉纖維的損傷，進(jìn)一步有效改善肉質(zhì)。

3 結(jié) 論

低頻電場通過破壞水分子之間的氫鍵，形成小而密集的冰晶，減少肌肉纖維損傷，從而有效改善解凍后的肉質(zhì)。從DAPs與品質(zhì)性狀的相關(guān)性結(jié)果可知，有43 個(gè)DAPs與品質(zhì)指標(biāo)顯著相關(guān)，其中高度相關(guān)的14 種DAPs有望作為牛肉pH值、色澤、質(zhì)構(gòu)特性、TVB-N含量和持水力的潛在標(biāo)志物。這些新發(fā)現(xiàn)有助于了解解凍后肉類中發(fā)生的蛋白質(zhì)組變化，以及低頻電場作用影響肉質(zhì)的潛在機(jī)制。在工業(yè)生產(chǎn)中，LFEFT既提高了生產(chǎn)效率，又保證了牛肉品質(zhì)，對于牛肉在貯藏和加工過程中的質(zhì)量控制具有重要意義。

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第一作者簡介：林穎（1998—）（ORCID： 0009-0002-1084-4517），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail： linying2310@163.com

*通信作者簡介：李宗軍（1967—）（ORCID： 0000-0001-7495-3822），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail： hnlizongjun@163.com