氧化條件下姜黃素對(duì)豬肉肌原纖維蛋白理化和凝膠特性的影響

常海軍，石源偉，伯朝英，周文斌，胡 渝

（重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，重慶市特色農(nóng)產(chǎn)品加工儲(chǔ)運(yùn)工程技術(shù)研究中心，重慶 400067）

肌原纖維蛋白占肌肉總蛋白的55%～60%，是肌肉中含量最高的一種蛋白，主要由肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白構(gòu)成[1]。肌原纖維蛋白的一個(gè)重要特性就是在熱加工過程中能形成凝膠，對(duì)肉制品的保水性、質(zhì)構(gòu)和感官等起著至關(guān)重要的作用[2]。然而肉蛋白在運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及加工過程中易受到外界環(huán)境的影響發(fā)生氧化，導(dǎo)致其物理化學(xué)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)的變化，蛋白氧化對(duì)肌原纖維蛋白功能特性的改變是影響肉和肉制品品質(zhì)的主要因素，氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間共價(jià)交聯(lián)，可促進(jìn)凝膠化和乳化的可溶性聚合物或不溶性聚合物的產(chǎn)生，從而降低其凝膠性能，影響產(chǎn)品的質(zhì)量[3]。植物多酚的介導(dǎo)會(huì)影響蛋白質(zhì)分子間共價(jià)鍵交聯(lián)，對(duì)凝膠保水性、流變學(xué)特性、彈性模量、凝膠強(qiáng)度等凝膠特性產(chǎn)生影響，從而影響蛋白凝膠性能[4]。Chen Bo等[5]研究發(fā)現(xiàn)添加谷胱甘肽會(huì)促進(jìn)肌原纖維蛋白中二硫鍵的形成，增加蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用，提高其凝膠特性，同時(shí)研究表明植物多酚類物質(zhì)會(huì)和蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)或非共價(jià)修飾作用，進(jìn)而影響其蛋白凝膠穩(wěn)定性。

近年來，天然植物多酚因其來源廣泛、價(jià)格低廉、種類繁多、安全性高等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。目前，研究以植物多酚為代表的天然抗氧化劑誘導(dǎo)調(diào)控肌肉蛋白氧化及對(duì)功能特性的影響已成為肉品科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。姜黃素是從姜科植物根莖中分離的一種具有二酮結(jié)構(gòu)的多酚化合物，是一種廣泛使用的天然活性物質(zhì)之一[6]，作為一種食品添加劑，姜黃素還具有抗炎、抗癌、抗菌、抗氧化等多種生物活性功能[7]。因副作用小、價(jià)格低且容易獲得，姜黃素在食品營(yíng)養(yǎng)及醫(yī)藥方面的重要性逐漸凸顯出來，它的生物學(xué)作用成為近年來的研究熱點(diǎn)之一，其中最受關(guān)注的是抗氧化作用。

雖然姜黃素在許多方面的生物活性得到廣泛的研究，但是在肉蛋白抗氧化或與蛋白相互作用方面的研究仍較少。目前鮮見針對(duì)植物多酚姜黃素用于調(diào)控肉蛋白氧化程度提高肉制品品質(zhì)相關(guān)報(bào)道，其調(diào)控肉蛋白氧化穩(wěn)定性和凝膠特性機(jī)理尚待進(jìn)一步闡明。因此，本研究以豬肉肌原纖維蛋白為對(duì)象，創(chuàng)建Fenton氧化體系模擬肉制品的氧化環(huán)境，探究不同濃度水平姜黃素對(duì)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠特性的影響，以期為天然多酚類物質(zhì)在肉制品抗氧化中應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬背最長(zhǎng)肌購(gòu)于重慶市南岸區(qū)五公里人人樂超市。剔除可見的脂肪組織后，順著肌纖維方向切成100 g左右的肉條，真空密封包裝后，貯存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、氯化鎂（MgCl2）、三氯乙酸、戊二醛、叔丁醇、冰醋酸成都市科龍化工試劑廠；姜黃素（純度≥97%）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸、牛血清白蛋白、酒石酸甲鈉（NaKC4H4O6）、氫氧化鈉（NaOH）、L-抗壞血酸、哌嗪-1,4-二乙磺酸、水溶性VE（Trolox）、尿素、考馬斯亮藍(lán)染色液、聚丙烯酰胺 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；三氯化鐵（FeCl3）、雙氧水（H2O2，30%）、β-巰基乙醇 上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Marker）北京索萊寶科技有限公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MARS40（哈克）旋轉(zhuǎn)流變儀 賽默飛世爾科技有限公司；S-8020掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；TAXT Plus質(zhì)構(gòu)儀 英國(guó)Stable Micro Systems公司；CR400色差儀 日本美能達(dá)公司；TGL-20高速冷凍離心機(jī) 四川蜀科儀器有限公司；LM-861多功能破壁機(jī) 廣東順德多蒙電器有限公司；DGG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；L G J-1 0 冷凍干燥機(jī)北京松源華興科技發(fā)展有限公司；Ultra-Turrax T25高速均質(zhì)勻漿機(jī) 德國(guó)IKA-WERKE公司；V2000可見分光光度計(jì)、FA2004電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；UV-1900紫外-可見分光光度計(jì) 上海翱藝儀器有限公司；TDZ5-WS多管架自動(dòng)平衡離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DYCZ-MINNI2電泳儀 北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取及濃度測(cè)定

以豬背最長(zhǎng)肌為原材料，參照Cao Yungang等[8]的方法提取肌原纖維蛋白：將冷藏備用的肉切成小塊置于絞肉機(jī)中并加入4 倍體積的肌原纖維蛋白提取液（10 mmol/L磷酸鈉、0.1 mol/L NaCl、2 mmol/L MgCl2和1 mmol/L EGTA，pH 7.0）于點(diǎn)動(dòng)模式下運(yùn)行30 s，再于長(zhǎng)動(dòng)模式下運(yùn)行1 min，勻漿后經(jīng)冷凍離心（8 000×g、10 min、4 ℃），傾去上清液，所得沉淀再加入4 倍體積的肌原纖維蛋白提取液，重復(fù)提取3 次，最后將所得沉淀加入4 倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液，攪拌均勻并用3 層紗布過濾以除去殘余的結(jié)締組織，調(diào)節(jié)pH值為6.25后離心（8 000×g、10 min、4 ℃），所得白色膏狀沉淀即為肌原纖維蛋白。整個(gè)提取過程在0～4 ℃條件下進(jìn)行，肌原纖維蛋白于4 ℃保存并48 h內(nèi)使用。采用周非白[9]所述的雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，制作蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 氧化介導(dǎo)的姜黃素-肌原纖維蛋白凝膠的制備

凝膠的制備參照Lv Yuanqi等[10]的方法并稍作修改，準(zhǔn)確稱取5 g上述1.3.1節(jié)中所提取的肌原纖維蛋白于50 mL離心管中，加入20 mL不同濃度梯度姜黃素（0（blank）、5、10、15、20 μmol/L），同時(shí)制備不含抗氧化劑但含有氧化因子（5 mmol/L H2O2）的氧化對(duì)照組（o x），均質(zhì)后，于4 ℃氧化反應(yīng)12 h，再加入1 mL Trolox（終濃度為1 mmol/L）振蕩搖勻，再置于室溫平衡30 min待離心管壁上不再有大量的蛋白樣液后，密封好，將樣品置于水浴鍋中，從室溫（25 ℃左右）緩慢升溫至80 ℃（2 ℃/min）再保溫10 min，取出置于冰水中冷卻至常溫，置于4 ℃環(huán)境中貯藏過夜。在測(cè)定凝膠性能之前，應(yīng)該將制得的凝膠樣品取出在常溫中平衡2 h之后再進(jìn)行下步操作。含0、5、10、15、20 μmol/L姜黃素的組別分別命名為blank、ox+c5、ox+c10、ox+c15、ox+c20。

1.3.3 肌原纖維蛋白凝膠特性測(cè)定

1.3.3.1 凝膠白度

凝膠色差值的測(cè)定參照Xia Xiufang等[11]的方法，色差儀經(jīng)自檢、調(diào)零、白板校正后，進(jìn)行凝膠樣品的測(cè)定，每個(gè)樣品測(cè)定3 次，取其平均值。其中L*表示明暗度，數(shù)值越大表示越亮，相反則越暗；a*表示紅綠度，正值表示偏紅，負(fù)值表示偏綠；b*表示黃藍(lán)度，正值表示偏黃，負(fù)值表示偏藍(lán)。凝膠白度的計(jì)算如式（1）：

1.3.3.2 凝膠蒸煮損失與保水性

凝膠蒸煮損失測(cè)定：蒸煮前準(zhǔn)確稱取離心管的質(zhì)量記作m0/g，凝膠和離心管的總質(zhì)量記作m1/g，蒸煮（具體步驟同1.3.2節(jié)）后倒掉水分后稱其總質(zhì)量為m2/g，肌原纖維蛋白凝膠蒸煮損失計(jì)算如式（2）：

凝膠保水性的測(cè)定：參照熊杰[12]的方法并稍作修改，準(zhǔn)確稱取1.3.2節(jié)制得的凝膠10 g分裝于離心管中，離心（4 ℃、8 000×g、15 min）除去水分，稱質(zhì)量，每個(gè)樣品重復(fù)操作3 次，凝膠保水性的計(jì)算如式（3）：

式中：M1為離心后離心管與凝膠的總質(zhì)量/g；M2為離心前離心管和凝膠的總質(zhì)量/g；M0為離心管質(zhì)量/g。

1.3.3.3 凝膠強(qiáng)度與質(zhì)構(gòu)

凝膠強(qiáng)度測(cè)定：利用質(zhì)構(gòu)分析儀測(cè)定凝膠的強(qiáng)度，同樣將平衡2 h除去可見的游離水的凝膠置于測(cè)試平臺(tái)上固定好，進(jìn)行Return to Start測(cè)試。探頭型號(hào)：P/0.5，觸發(fā)力：5 g，下壓距離：6 mm，測(cè)前速率：2 mm/s，測(cè)中速率：1 mm/s，測(cè)后速率：2 mm/s。

凝膠全質(zhì)構(gòu)測(cè)定：參照韓馨蕊等[13]的方法并略加修改，利用質(zhì)構(gòu)分析儀測(cè)定凝膠的全質(zhì)構(gòu)，將平衡2 h除去可見的游離水的凝膠置于測(cè)試平臺(tái)上進(jìn)行全質(zhì)構(gòu)測(cè)定。探頭型號(hào)：P/75，下壓比：50%，觸發(fā)力：5 g，測(cè)前速率：2 mm/s，測(cè)試速率：1 mm/s，測(cè)后速率：1 mm/s。

1.3.4 肌原纖維蛋白凝膠動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性測(cè)定

不同處理方式的樣品凝膠動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性的測(cè)定方法參照Du Juanjuan等[14]描述的方法并稍作修改，肌原纖維蛋白凝膠（0.2 g/mL），經(jīng)離心（4 ℃、800 r/min、30 s）脫氣后備用。采用振蕩溫度掃描測(cè)試模塊，安裝P20/Ti-01210465型轉(zhuǎn)子，儀器調(diào)零后，將脫氣的樣品均勻布滿在儀器平臺(tái)上，用硅油密封平板外蛋白質(zhì)和空氣的接觸位置，以防加熱導(dǎo)致蛋白液蒸發(fā)，再進(jìn)行20～80 ℃的溫度掃描。測(cè)定參數(shù)：振蕩頻率為0.1 Hz，最大應(yīng)力為2%，上下板狹縫為1 mm，以2.1 ℃/min的升溫速率加熱樣品，在此過程中記錄凝膠的儲(chǔ)能模量（G’）和損耗模量（G”）。

1.3.5 肌原纖維蛋白凝膠分子間作用力測(cè)定

參照Zhang Zhongli等[15]的描述并稍作修改，將1.3.2節(jié)制得的凝膠準(zhǔn)確稱取2 g加入10 mL S1（0.6 mol/L NaCl），6 000 r/min勻漿2 min，于4 ℃放置1 h后離心（4 ℃、8 000×g、20 min），4 ℃保留上清液；上述沉淀加入10 mL S2（1.5 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl混合溶液），6 000 r/min勻漿2 min，于4 ℃放置1 h，相同條件下離心20 min，上清液于4 ℃保存；將上述沉淀加入10 mL S3（8 mol/L尿素和0.6 mol/L NaCl混合溶液），6 000 r/min勻漿2 min，于4 ℃放置1 h，相同條件下離心20 min，上清液于4 ℃保存，重復(fù)此操作，將兩次離心的上清液合并，4 ℃保存；繼續(xù)向沉淀中加10 mL S4（0.5 mol/Lβ-巰基乙醇、0.6 mol/L NaCl和8 mol/L尿素混合液，pH 7），6 000 r/min勻漿2 min，于4 ℃放置1 h，相同條件下離心20 min，上清液于4 ℃保存，經(jīng)S4提取后所得沉淀加入2 mL 0.1 mol/L NaOH充分溶解后于4 ℃保存。通過雙縮脲法測(cè)其上清液的蛋白含量。其中離子鍵：以溶解于S1的蛋白含量表示；氫鍵：以溶解于S2的蛋白含量表示；疏水鍵：以溶解于S3的蛋白含量表示；二硫鍵：以溶解于S4的蛋白含量表示；非二硫鍵：以經(jīng)S4提取液后所得沉淀溶于NaOH的蛋白含量表示。

1.3.6 肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)觀察

參照Zhao Yinyu等[16]描述的方法，將制得的凝膠樣品準(zhǔn)確稱取10 g，用小刀切成2 mm×2 mm×5 mm的小條，加入10 mL 2.5%戊二醛溶液（溶于磷酸緩沖液中，pH 6.8）浸泡過夜，固定12 h后加入10 mL磷酸緩沖液（0.1 mol/L、pH 6.8）洗滌3 次，每次10 min，隨后依次用體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液進(jìn)行脫水處理，每次10 min，再用10 mL無水乙醇脫水，每次10 min，共3 次。脫水完成后再加入10 mL氯仿進(jìn)行脫脂1 h，再用無水乙醇-叔丁醇（1∶1，V/V），以及叔丁醇各進(jìn)行置換1 次，每次15 min，最后將樣品冷凍24 h后于冷凍干燥機(jī)中干燥。干燥后的樣品緊貼于掃描電子顯微鏡樣品臺(tái)上并噴金處理，加速電壓為2.0 kV，放大30 000 倍進(jìn)行觀察。

1.3.7 肌原纖維蛋白凝膠電泳

電泳樣品制備參照曹云剛[17]所描述的方法進(jìn)行，準(zhǔn)確稱取5 g蛋白凝膠，研磨之后置于50 mL塑料離心管中，加入20 mL 5%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液，3 000 r/min均質(zhì)1 min后于80 ℃水浴1 h，取出冰水冷卻至室溫，離心（3 000×g、15 min），以除去不溶物。將上清液用哌嗪-1,4-二乙磺酸緩沖溶液稀釋至20 mg/mL后用于電泳樣品的制備，其余過程與蛋白樣液電泳操作步驟相同。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組樣品設(shè)置3 個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)測(cè)試重復(fù)3 次，所有數(shù)據(jù)用表示，利用SPSS 23.0進(jìn)行誤差及顯著性分析（其中P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌原纖維蛋白凝膠特性分析

2.1.1 凝膠白度

由圖1可知，與空白對(duì)照組相比，氧化后凝膠白度變化不顯著（P＞0.05），說明5 mmol/L H2O2氧化下，蛋白凝膠白度未受到明顯的影響。但是加入姜黃素后，凝膠白度顯著性降低（P＜0.05），且隨著姜黃素濃度的增加，凝膠白度降低，5、10、15、20 μmol/L姜黃素處理后，肌原纖維蛋白凝膠白度與氧化對(duì)照組相比，分別下降了2.15、6.59、10.01和11.15，可能與姜黃素與肌原纖維蛋白相互作用有關(guān)，姜黃素的加入會(huì)導(dǎo)致凝膠保水能力的增加，即凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)內(nèi)的結(jié)合水較多，相對(duì)而言肌原纖維蛋白表面的自由水含量降低，導(dǎo)致光折射能力下降進(jìn)而L*值降低，最后導(dǎo)致凝膠白度的降低[18]，其次可能是因?yàn)榻S素是一種自帶黃色程度較深的天然植物多酚類物質(zhì)，雖然添加的量不多但也會(huì)影響凝膠的紅綠度（a*）和黃藍(lán)度（b*）值，進(jìn)而影響其凝膠白度。

圖1 不同處理對(duì)肌原纖維蛋白凝膠白度的影響Fig.1 Effects of different treatments on the whiteness of MP gels

研究發(fā)現(xiàn)一些植物多酚的加入會(huì)產(chǎn)生蛋白凝膠白度下降的現(xiàn)象，如韓馨蕊等[13]認(rèn)為安石榴苷（黃色）的添加也會(huì)導(dǎo)致凝膠白度的降低，劉丹[18]研究發(fā)現(xiàn)染料木素在較高濃度條件下使凝膠白度降低，隨著蘆丁和槲皮素濃度的增加，凝膠白度逐漸降低，這可能就是由于酚類物質(zhì)本身顏色所影響，而沒食子酸和兒茶素出現(xiàn)低濃度條件下使凝膠白度降低、高濃度條件下使凝膠白度增加的現(xiàn)象，這可能是因?yàn)榈蜐舛葪l件下植物多酚與Fe3+螯合，以及酚類物質(zhì)氧化形成醌類化合物使得凝膠白度降低，而高濃度條件下，兩種酚類物質(zhì)使得凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)崩塌，破壞了蛋白的結(jié)構(gòu)。同時(shí)Wang Yingjie等[19]研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物紫檀芪（白色粉末）也會(huì)降低肌原纖維蛋白凝膠的白度，認(rèn)為是紫檀芪可以顯著提高凝膠特性所致。

2.1.2 蒸煮損失與保水性

蒸煮損失與保水性是評(píng)價(jià)凝膠品質(zhì)極為重要的因素之一，可反映凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)截留水分能力的大小[20]，如圖2和圖3所示，與空白對(duì)照組相比，氧化后凝膠蒸煮損失顯著性增加（P＜0.05），增加了58.18%，凝膠保水性顯著性降低（P＜0.05），降低了15.35%，這與前人的研究結(jié)果一致，Cao Yungang[21]和Wang Zhaoming[22]等均發(fā)現(xiàn)氧化后凝膠蒸煮損失增加和保水性下降的現(xiàn)象。而姜黃素的添加正好可以減少蒸煮損失的增大與保水性的降低，且隨著姜黃素濃度的增加，對(duì)凝膠蒸煮損失的降低和保水性的提高更明顯，當(dāng)姜黃素濃度為20 μmol/L時(shí)，與氧化對(duì)照組相比，凝膠蒸煮損失降低了18.61%，凝膠保水性提高了32.31%。該現(xiàn)象可能由以下原因造成：首先，姜黃素是二酮結(jié)構(gòu)的多酚化合物，在一定程度上可以抑制蛋白的氧化，且自身的羥基結(jié)構(gòu)具有良好的親水能力，因而姜黃素的添加可以降低其凝膠的蒸煮損失和提高保水性[23]；其次，姜黃素的添加會(huì)引起肌球蛋白的解離，提高體系內(nèi)離子強(qiáng)度，通過靜電相互作用力增強(qiáng)其凝膠的水合作用，使凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，提高其保水能力，從而降低蒸煮損失，葉浪等[24]研究認(rèn)為凝膠保水性增強(qiáng)可能是由于肌原纖維蛋白引入磷酸基團(tuán)，增加了蛋白質(zhì)分子的電負(fù)性，肌動(dòng)球蛋白解離成肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的速率增大，疏水基團(tuán)增多，肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)空間增大，蛋白質(zhì)與水分子結(jié)合位點(diǎn)增加，使更多水分被保留下來。

圖2 不同處理對(duì)肌原纖維蛋白凝膠蒸煮損失的影響Fig.2 Effects of different treatments on the cooking loss of MP gels

圖3 不同處理對(duì)肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響Fig.3 Effects of different treatments on the water retention capacity of MP gels

2.1.3 凝膠強(qiáng)度

凝膠強(qiáng)度可以反映蛋白凝膠成形能力的大小。由圖4可知，空白對(duì)照組的凝膠強(qiáng)度顯著性高于氧化組（P＜0.05），說明5 mmol/L H2O2氧化體系下產(chǎn)生的羥自由基會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)原有的結(jié)構(gòu)改變，使得蛋白凝膠成形性降低，這與前人的研究結(jié)果一致，程鏡蓉[25]和Feng Xianchao[26]等研究發(fā)現(xiàn)羥自由基體系下，蛋白凝膠強(qiáng)度會(huì)顯著性下降，而當(dāng)加入姜黃素之后，肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度迅速增加，甚至凝膠強(qiáng)度高于空白對(duì)照組，5、10、15、20 μmol/L姜黃素處理后，凝膠強(qiáng)度與空白對(duì)照組相比分別上升了132.72%、156.41%、170.67%、183.20%，說明姜黃素的加入可以防止羥自由基損壞肌原纖維蛋白凝膠且大大提高肌原纖維蛋白凝膠性能。這可能是因?yàn)榻S素的加入可以提高蛋白質(zhì)的溶解度，從而使參與蛋白質(zhì)成膠的大分子物質(zhì)更多，使得凝膠強(qiáng)度更大；其次姜黃素的加入可以提高凝膠持水性，所以此時(shí)凝膠更加飽滿，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定致密，故而姜黃素的添加有更強(qiáng)的凝膠強(qiáng)度。Tang Changbo等[27]的研究結(jié)果與本研究相反，他們發(fā)現(xiàn)迷迭香酸加入后半胱氨酸會(huì)與迷迭香酸形成結(jié)合物，減少二硫鍵的形成，最終導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度的減弱，這可能是由于植物多酚的不同而導(dǎo)致了完全相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖4 不同處理對(duì)肌原纖維蛋白凝膠強(qiáng)度的影響Fig.4 Effects of different treatments on the gel strength of MPs

2.1.4 凝膠質(zhì)構(gòu)

不同處理方式對(duì)肌原纖維蛋白全質(zhì)構(gòu)影響如表1所示。與空白對(duì)照組相比，氧化后凝膠的硬度、彈性、凝聚性、膠黏性、咀嚼性和回彈性均出現(xiàn)了顯著性降低的趨勢(shì)，其中硬度、彈性、膠黏性和咀嚼性分別降低了28.36%、68.53%、34.77%、37.70%。

表1 不同處理方式對(duì)凝膠全質(zhì)構(gòu)的影響Table 1 Effects of different treatments on the texture characteristics of MP gels

凝膠硬度是指儀器探頭首次下壓凝膠時(shí)，壓力達(dá)到的最大值，它是衡量凝膠質(zhì)構(gòu)特性的重要指標(biāo)之一[28]。由表1可知，凝膠的硬度隨著姜黃素濃度的增加整體呈上升趨勢(shì)（P＜0.05），其中膠黏性、咀嚼性與硬度的變化趨勢(shì)一致，說明姜黃素的添加有利于凝膠的形成。

不同姜黃素添加量對(duì)凝膠改善程度也有所不同，當(dāng)姜黃素濃度為20 μmol/L時(shí)，與氧化對(duì)照組相比，凝膠硬度、彈性、凝聚性、膠黏性和咀嚼性分別提高了31.08%、8.89%、9.09%、39.88%、55.55%。這可能是因?yàn)榻S素含有2 個(gè)鄰甲氧基酚基、2 個(gè)烯酮基和1 個(gè)酮烯醇的結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的親水能力，使得水合作用更強(qiáng)，從而增加了凝膠特性。Sun Lijun等[29]研究了蘋果多酚對(duì)魚糜凝膠特性的影響，發(fā)現(xiàn)蘋果多酚的羥基結(jié)構(gòu)具有較強(qiáng)的親水能力，可以增加凝膠特性。同時(shí)姜黃素的酚羥基結(jié)構(gòu)還可以與蛋白質(zhì)中的C＝O基團(tuán)形成氫鍵，增強(qiáng)蛋白質(zhì)與多酚之間的相互作用[30]。賈娜等[31]研究了在氧化情況下槲皮素對(duì)豬肉肌原纖維蛋白凝膠的影響，發(fā)現(xiàn)槲皮素會(huì)和肌原纖維蛋白結(jié)合形成巰基-醌加合產(chǎn)物，增加凝膠強(qiáng)度。

2.2 肌原纖維蛋白凝膠動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性

肌原纖維蛋白的動(dòng)態(tài)流變學(xué)特性可以反映蛋白熱誘導(dǎo)凝膠形成能力的改變[32]。G’也稱為彈性模量，它能夠反映隨著溫度的變化凝膠彈性的變化，G’越大則表示凝膠彈性越好；G”也稱為黏性模量，它是指材料發(fā)生形變時(shí)，由于黏性形變（不可逆）而損耗的能量大小，用于反映材料黏性的大小，G”越大則表示黏性越大[11]。

如圖5所示，氧化對(duì)照組和空白對(duì)照組以及樣品組在40～50 ℃熱誘導(dǎo)下凝膠儲(chǔ)能模量均出現(xiàn)了相似的上升趨勢(shì)，此時(shí)為肌球蛋白溶液中重酶解肌球蛋白（肌球蛋白頭部）的變性開始，肌球蛋白頭部通過二聚作用開始聚集，在二硫鍵和非共價(jià)鍵的作用下形成具有彈性的蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[33]，而50～60 ℃熱誘導(dǎo)凝膠儲(chǔ)能模量又呈現(xiàn)出下降的現(xiàn)象，此時(shí)為酶解肌球蛋白輕鏈的變性溫度，肌球蛋白尾部的解螺旋導(dǎo)致蛋白質(zhì)的流動(dòng)性增大，破壞了蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[34]。當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí)，蛋白質(zhì)因熱變形而展開、折疊、交聯(lián)，形成不可逆的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)為G’的持續(xù)上升[35]。

圖5 不同處理方式對(duì)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠G’的影響Fig.5 Effects of different treatments on the storage modulus (G’) of heat-induced MP gels

氧化對(duì)照組和其他處理組相比，在第一個(gè)拐點(diǎn)處（43 ℃左右）之前，蛋白G’均低于其他處理組，這可能是因?yàn)樵诘蜏貤l件下蛋白凝膠結(jié)構(gòu)主要由蛋白質(zhì)之間的相互作用所影響，而氧化后加速了蛋白質(zhì)的變性速率，使得蛋白質(zhì)來不及形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，因而在20～43 ℃氧化對(duì)照組的G’更低，加入姜黃素后可以促進(jìn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)以及姜黃素與蛋白質(zhì)之間的相互作用，促進(jìn)了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。而當(dāng)溫度高于43 ℃后，添加姜黃素的肌原纖維蛋白凝膠的G’高于氧化對(duì)照組及空白對(duì)照組，同時(shí)氧化對(duì)照組也高于空白對(duì)照組，說明一定的氧化程度有助于蛋白凝膠的形成，可能是因?yàn)樵谝欢ǖ难趸瘲l件下會(huì)使得蛋白質(zhì)產(chǎn)生更多的共價(jià)鍵，尤其二硫鍵的形成有利于蛋白凝膠化[36]，這一研究結(jié)果與程鏡蓉[25]的研究結(jié)果相反，可能是因?yàn)檠芯窟x擇的氧化體系中雙氧水濃度不同。但Cao Yungang等[37]指出，在4 ℃ Fenton氧化體系下氧化12 h后，兩個(gè)轉(zhuǎn)變峰均高于未氧化的空白對(duì)照組。于晶超[32]研究了不同雙氧水濃度梯度下形成的氧化體系對(duì)蛋白熱誘導(dǎo)凝膠流變特性的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度條件下有利于蛋白凝膠的形成，而高氧化強(qiáng)度下會(huì)破壞凝膠結(jié)構(gòu)，降低凝膠彈性。肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠G”的變化趨勢(shì)與G’一致，當(dāng)加熱到50 ℃左右時(shí)達(dá)到第一個(gè)最大峰，從50～65 ℃急劇下降，之后隨著溫度的升高G”逐漸上升（圖6）。整個(gè)熱誘導(dǎo)加熱過程中，G’始終高于G”，說明蛋白熱誘導(dǎo)形成的凝膠是一個(gè)彈性相對(duì)較強(qiáng)的蛋白凝膠[14]。

圖6 不同處理方式對(duì)肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠G”的影響Fig.6 Effects of different treatments on the loss modulus (G”) of heat-induced MP gels

2.3 肌原纖維蛋白凝膠分子間作用力

蛋白凝膠的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)的動(dòng)力學(xué)聚集過程，在這個(gè)聚集過程，只有吸引力和排斥力處于平衡狀態(tài)才能形成保持大量水分在內(nèi)的高度有序的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的蛋白凝膠[38]。一般認(rèn)為凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成是由于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水相互作用以及相鄰肽鍵之間的相互吸引力和排斥力相互平衡的結(jié)果，形成和維持蛋白凝膠結(jié)構(gòu)的力主要有離子鍵、氫鍵、疏水鍵、二硫鍵以及非二硫鍵等作用力[39]。如圖7所示，肌原纖維蛋白氧化后，離子鍵和氫鍵分別下降了20.97%、28.34%，而疏水性作用力、二硫鍵和非二硫鍵則顯著性上升了27.36%、45.25%、59.95%（P＜0.05），這主要是因?yàn)檠趸蟮鞍踪|(zhì)表面的凈電荷數(shù)會(huì)減少，進(jìn)而減少其表面的離子強(qiáng)度，蛋白質(zhì)之間的相互斥力減弱，蛋白質(zhì)的三級(jí)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)遭到破壞；其次由于氧化系統(tǒng)中的羥自由基會(huì)攻擊肌原纖維蛋白的氨基酸側(cè)鏈，降低氫鍵的含量[40]；此外，氧化也會(huì)導(dǎo)致肌原纖維蛋白表面疏水性的增強(qiáng)和二硫鍵含量的升高。與氧化對(duì)照組進(jìn)行比較，添加姜黃素都顯著性降低了由于氧化帶來的負(fù)面影響，增強(qiáng)了離子鍵、氫鍵的相對(duì)含量而降低了表面疏水性、二硫鍵和非二硫鍵相對(duì)含量。這些可能都與姜黃素的添加中和了氧化體系中羥自由基以及其他部分的自由基因子，緩解了肌原纖維蛋白的氧化相關(guān)，說明姜黃素可以較好地緩解肌原纖維蛋白的氧化，同時(shí)有利于穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但是從加入姜黃素后的4 個(gè)處理組可以看出，姜黃素添加量對(duì)蛋白質(zhì)離子鍵、氫鍵、表面疏水性的影響較大而對(duì)二硫鍵和非二硫鍵的影響較小，這可能是因?yàn)榍叭叩南鄬?duì)含量基數(shù)較大。

圖7 不同處理方式對(duì)肌原纖維蛋白凝膠分子間作用力的影響Fig.7 Effects of different treatments on intermolecular forces of MP gels

2.4 肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)

肌原纖維蛋白的有序聚集形成了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過掃描電子顯微鏡可以直觀地觀察出凝膠的微觀結(jié)構(gòu)，包括凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，如多孔性、疏松性等，通常情況下凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的致密性和凝膠的保水性有著密切的關(guān)系，可以進(jìn)一步反映出凝膠的特性[34]。如圖8所示，空白對(duì)照組的凝膠結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出連續(xù)的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，孔洞較小、結(jié)構(gòu)緊密，而氧化后凝膠結(jié)構(gòu)變得疏松，空隙變大且多，這可能是因?yàn)檠趸龠M(jìn)了部分蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集，破壞了凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[41]。隨著添加姜黃素濃度的增加，肌原纖維蛋白凝膠結(jié)構(gòu)逐漸得到恢復(fù)，空隙變小且更加致密，當(dāng)姜黃素濃度達(dá)到15 μmol/L時(shí)凝膠結(jié)構(gòu)幾乎與空白組無明顯差別，這可能是因?yàn)榻S素的加入消耗了氧化體系中了羥自由基，減少了蛋白質(zhì)的氧化，也有可能是因?yàn)榻S素與肌原纖維蛋白發(fā)生了某些交聯(lián)反應(yīng)，形成了更加穩(wěn)定、連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而具有較強(qiáng)的凝膠強(qiáng)度[42]。同時(shí)也可以得出在該研究濃度范圍內(nèi)，高濃度姜黃素有利于凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。

圖8 不同處理對(duì)凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.8 Effects of different treatments on the microstructure of MP gels

2.5 肌原纖維蛋白凝膠電泳

利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）技術(shù)對(duì)蛋白氧化及添加姜黃素后所引起的蛋白交聯(lián)情況進(jìn)行分析。由圖9可知，肌原纖維蛋白中的肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain，MHC）在非還原條件下氧化12 h后明顯減少，且肌動(dòng)蛋白（Actin）條帶變淡，同時(shí)濃縮膠頂部顏色明顯加深，說明大分子聚集物顯著增多，而在還原條件下，絕大多數(shù)的MHC得以恢復(fù)，且濃縮膠頂部的大分子聚集物大部分消失，這表明由氧化引起的蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集行為主要是由MHC通過二硫鍵形成大分子物質(zhì)引起[17]。

圖9 非還原（A）和還原（B）條件下肌原纖維蛋白凝膠SDS-PAGE圖Fig.9 SDS-PAGE patterns of MP gels under reducing and nonreducing conditions

在氧化環(huán)境中，姜黃素的添加并不能完全阻止蛋白質(zhì)的聚集，甚至低濃度條件下（5、10 μmol/L姜黃素）與氧化對(duì)照組無論是MHC、Actin，還是濃縮膠頂部的聚集情況都相差不大，但是當(dāng)濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，可以清晰看到濃縮膠頂部的聚集物質(zhì)較少。加入β-巰基乙醇還原后MHC和Actin條帶均得到恢復(fù)，表明大部分聚合物都是通過二硫鍵相互作用形成的，同時(shí)還原后濃縮膠頂部仍然還有少量的聚集物存在，說明形成的大分子聚集物除了以S—S形式形成外還存在非二硫鍵。通過SDSPAGE可以看出姜黃素對(duì)氧化引起的蛋白質(zhì)凝膠聚集行為具有一定的改善作用。

2.6 各指標(biāo)間相關(guān)性分析

采用相關(guān)性熱圖分析肌原纖維蛋白凝膠各指標(biāo)之間的相關(guān)程度見圖10。結(jié)果表明，凝膠白度與保水性和凝膠強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)，蒸煮損失與凝膠質(zhì)構(gòu)各指標(biāo)影響都呈負(fù)相關(guān)。另外，凝膠分子間疏水鍵、二硫鍵和非二硫鍵與凝膠保水性、凝膠強(qiáng)度和質(zhì)構(gòu)都呈負(fù)相關(guān)，這說明蛋白凝膠形成過程中，分子間作用力對(duì)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成以及凝膠三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中水分的保持具有重要作用，可作為評(píng)價(jià)蛋白凝膠形成過程中的動(dòng)態(tài)力學(xué)聚集過程。

圖10 肌原纖維蛋白凝膠各指標(biāo)間相關(guān)性分析Fig.10 Correlation analysis between indicators of MP gels

3 結(jié)論

氧化條件下添加姜黃素可使豬肉肌原纖維蛋白凝膠白度顯著降低，促進(jìn)凝膠強(qiáng)度和保水性的增加以及改善凝膠質(zhì)構(gòu)特性，可減緩由氧化而引起的凝膠蒸煮損失的增加；姜黃素的添加可以促進(jìn)凝膠G’和G”增加；添加姜黃素增加了凝膠蛋白分子間離子鍵和氫鍵的相對(duì)含量，而降低了表面疏水性、二硫鍵和非二硫鍵相對(duì)含量；氧化后凝膠微觀結(jié)構(gòu)變得疏松、多孔、不結(jié)實(shí)，而加入姜黃素后凝膠微觀結(jié)構(gòu)得到恢復(fù)，高濃度姜黃素（15～20 μmol/L）可使肌原纖維蛋白凝膠微觀結(jié)構(gòu)恢復(fù)至未氧化狀態(tài)，在一定程度上可以緩解蛋白質(zhì)由于氧化導(dǎo)致的聚集情況；姜黃素對(duì)肌原纖維蛋白凝膠的調(diào)控表現(xiàn)為濃度效應(yīng)，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著姜黃素濃度的增加，對(duì)肌原纖維蛋白凝膠的形成有一定的促進(jìn)作用，濃度越高更有利于提高肌原纖維蛋白凝膠特性。適量的姜黃素可控制肉品中蛋白質(zhì)的氧化、提高蛋白凝膠特性，從而增強(qiáng)肉制品的質(zhì)構(gòu)特性。