暗褐脈柄牛肝菌子實體多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)表征及體外降血糖活性

潘章超，張人諭，黎歡昶，曾念開，王 勇

（熱帶藥物創(chuàng)新與轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，人機智能協(xié)同腫瘤精準(zhǔn)診療國際聯(lián)合研究中心，海南省熱帶藥用植物研究開發(fā)重點實驗室，海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口 571199）

糖尿病是一種以胰島素分泌不足或自身無法正常使用胰島素控制血糖水平為特征的疾病[1]。臨床上糖尿病通常可以分為1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病，其中2型糖尿病占糖尿病患者總?cè)藬?shù)的90%以上[2]。我國糖尿病患者人數(shù)已超過1.14億，據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟預(yù)測，到2030年，這一數(shù)值將達(dá)到3.66億[3-4]。糖尿病的經(jīng)久不愈容易對各種器官造成危害甚至引發(fā)一系列并發(fā)癥，如房顫[5]、動脈粥樣硬化、高血壓[6]、糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變[7]等，已經(jīng)嚴(yán)重危害著人們的身體健康。目前口服降糖藥和注射胰島素是治療2型糖尿病的主要方法，但其藥物都存在一定的不良反應(yīng)。因此開發(fā)一種安全、有效和副作用小的降血糖藥物至關(guān)重要。

天然來源多糖因其具有降血糖[8-9]、抗氧化[10]、免疫調(diào)節(jié)[11]和抗炎[6-12]等作用引起越來越多人的關(guān)注。文丹等[13]采用水提取法得到麥冬多糖的粗提物，通過自由基清除實驗證明了麥冬多糖在體外具有很好的抗氧化效果；在體內(nèi)H2O2誘導(dǎo)的NIH/3T3細(xì)胞損傷模型中，麥冬多糖的預(yù)處理可以很好地降低NIH/3T3細(xì)胞的死亡率、單線態(tài)氧的產(chǎn)生和炎癥因子的表達(dá)量，進(jìn)一步證明了麥冬多糖在細(xì)胞體內(nèi)的抗氧化效果；最后在葡萄糖苷酶活性實驗中，麥冬多糖對葡萄糖苷酶具有呈濃度依賴性的抑制作用。因此，從天然產(chǎn)物中制備多糖，開發(fā)新型、安全、高效的降血糖藥物已成為該領(lǐng)域的研究熱點。

暗褐脈柄牛肝菌（Phlebopus portentosus(Berk.&Broome) Boedijn）又名暗褐網(wǎng)柄牛肝菌，俗稱“黑牛肝菌”，為小牛肝菌科（Boletinellaceae）、脈柄牛肝菌屬（Phlebopus）真菌[14-16]。該種主要分布在中國海南、云南和廣西等地區(qū)[17]。暗褐脈柄牛肝菌個體肥美，富含多種礦物質(zhì)，是高蛋白、低脂肪、備受公眾喜愛的食用菌，同時具有較好的藥用價值[18]，具有清熱解煩、補虛提神、疏筋活血等功效[19]?，F(xiàn)代藥理研究表明真菌多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、降血脂等生物學(xué)活性[20-22]。Karnchanatat等[23]利用水提醇沉法得到多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物，經(jīng)分離純化后，獲得大量的多糖片段PPC-P11，實驗表明PPC-P11具有很強的抗氧化能力。當(dāng)前，暗褐脈柄牛肝菌多糖的體外降血糖活性的研究較少，有待對其進(jìn)行深入研究。本研究首先獲得暗褐脈柄牛肝菌粗多糖，并對其進(jìn)一步分離純化得到純化多糖組分，通過紫外光譜、紅外光譜、核磁共振和掃描電子顯微鏡等對純化多糖進(jìn)行初步結(jié)構(gòu)表征，通過α-葡萄糖苷酶抑制實驗篩選活性最好的組分，并闡明其降血糖活性及機制，為暗褐脈柄牛肝菌降血糖相關(guān)醫(yī)藥產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

暗褐脈柄牛肝菌子實體購自云南西雙版納傣族自治州，由海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院曾念開教授鑒定為小牛肝菌科脈柄牛肝菌屬真菌暗褐脈柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）的子實體。

DEAE-52纖維素 浙江聯(lián)碩生物科技有限公司；日本三菱化學(xué)大孔吸附樹脂（HP 20、HP 2MGL、SP 825、SP 850）上海摩速科學(xué)器材有限公司；4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-alpha-Dglucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶（10 U/mg）、阿卡波糖、牛血清白蛋白、丙烯葡聚糖凝膠S-400HR 上海源葉生物科技有限公司；對硝基苯酚（4-nitrophenol，PNP）百靈威科技有限公司；D2O上海麥克林生化科技有限公司；溴化鉀（光譜純）天津市大茂化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán) 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Spectra Max 190全波長酶標(biāo)儀 上海美谷分子儀器有限公司；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；CBS-A程控全自動部分收集器 上海滬西儀器廠有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；JNM-ECZ400S/L1核磁共振波譜儀日本電子株式會社；1100高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；1525高效液相色譜儀 沃特世科技（上海）有限公司；Nicolet iS5紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司；Quanta FEG250場發(fā)射掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 暗褐脈柄牛肝菌粗多糖的提取

稱取暗褐脈柄牛肝菌子實體粉末100 g，加體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液1 000 mL，置于超聲波提取器中超聲30 min（40 ℃）；離心（4 000 r/min、10 min），保留沉淀；沉淀加入1 000 mL去離子水，在80 ℃的水浴鍋內(nèi)浸提2 h，過濾，保留濾液，濾渣加入1 000 mL去離子水在同條件下繼續(xù)提取，重復(fù)提取4 次，合并4 次濾液，將上清液濃縮；在濃縮液中緩慢加入4 倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶液進(jìn)行沉淀，并在4 ℃靜置24 h；離心（4 000 r/min、10 min）得到沉淀，沉淀加200 mL去離子水溶解；加入200 mL的Sevag試劑（氯仿∶正丁醇＝4∶1，V/V）進(jìn)行萃取，去除蛋白質(zhì)，保留上清液，重復(fù)此過程3 次。

1.3.2 大孔樹脂的篩選及脫色

對HP 2MGL、HP 20、SP 850、SP 825 4 種型號的大孔樹脂進(jìn)行篩選，測定多糖脫色前后的吸光度，分別記為A前和A后，按式（1）計算脫色率，脫色前后蛋白質(zhì)量分別記為M前和M后，按式（2）計算脫蛋白率，脫色前后多糖質(zhì)量分別記為m前和m后，按式（3）計算多糖保留率，按照多糖保留率50%、脫色率30%、脫蛋白率20%進(jìn)行加權(quán)，再選擇合適的大孔吸附樹脂進(jìn)行脫色。將上清液置于燒杯中，加入體積分?jǐn)?shù)6%的經(jīng)篩選出的最優(yōu)大孔樹脂進(jìn)行攪拌脫色[24]；脫色后得到的溶液加入4 倍體積95%乙醇溶液進(jìn)行沉淀，靜置過夜，離心，沉淀冷凍干燥得暗褐脈柄牛肝菌子實體粗多糖。

1.3.3 暗褐脈柄牛肝菌多糖的分離純化

稱取1.5 g暗褐脈柄牛肝菌粗多糖粉末，溶解至10 mL去離子水中，分裝至2 mL離心管中，離心，保留上清液；在已處理好的DEAE-52纖維素色譜柱中加入粗多糖溶液，分別用蒸餾水、NaCl溶液（0.1、0.2、0.4 mol/L）洗脫，用苯酚-濃硫酸法[25]檢測多糖含量，得到暗褐脈柄牛肝菌子實體純化多糖含量梯度曲線；將各級洗脫液濃縮、透析和冷凍干燥48 h；對含量較高的洗脫組分進(jìn)行丙烯葡聚糖凝膠S-400HR二次分級純化，冷凍干燥即得到暗褐脈柄牛肝菌子實體純化多糖。

1.3.4 多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

精密稱取烘干至恒質(zhì)量的葡萄糖對照品10 mg于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖溶液備用。移取0.1 mg/mL葡萄糖對照品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL分別置于10 mL具塞試管中，分別加蒸餾水補至2.0 mL。在試管中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)6%苯酚溶液1.0 mL后再快速加濃硫酸5.0 mL，混勻靜置10 min，于沸水浴內(nèi)加熱15 min，然后取出快速冷卻至室溫。在490 nm處測吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

配制0.1 mg/mL的暗褐脈柄牛肝菌多糖溶液，吸取0.1 mL，用蒸餾水補至2.0 mL，同對照品方法操作，最后在490 nm處測吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算即可求得多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

稱取10 mg牛血清白蛋白于100 mL容量瓶中定容至刻度線，配制成0.1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確稱取0.020 1 g的考馬斯亮藍(lán)G-250溶于10.0 mL體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液中，加入20.0 mL 85%的濃H3PO4溶液，用蒸餾水定容至200 mL，經(jīng)雙層濾紙過濾后得考馬斯亮藍(lán)溶液，避光保存?zhèn)溆谩７謩e吸取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入純水補至1 mL，再加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)備用液，靜置15 min，在595 nm處測定吸光度，根據(jù)數(shù)據(jù)繪圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1 mg/mL多糖溶液1 mL，同牛血清白蛋白方法操作，最后在595 nm處測吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線換算即可求得蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.6 分子質(zhì)量的測定

采用水相凝膠滲透色譜法測定多糖的分子質(zhì)量，色譜條件：示差折光檢測器；色譜柱（PL aquqgel-OH MIXED 8 μm；7.8 mm×30 cm）；柱溫30 ℃；流動相為0.2 mol/L NaNO3和NaH2PO4混合溶液（pH 7）；流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，進(jìn)行不同相對分子質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（1×103～1×105）和樣品分析。通過Breeze軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最后確定該多糖的平均分子質(zhì)量。

1.3.7 單糖組成的測定

稱取10 mg（精確到0.1 mg）多糖樣品于20 mL的鉗口瓶中，加入5 mL的2 mol/L三氟乙酸溶液，充N2封管（10 L/min、1 min），100 ℃烘箱中水解2 h；冷卻后打開蓋，取1 mL加入1 mL甲醇后，70 ℃水浴下用N2吹干，加入1 mL 0.3 mol/L NaOH溶液。分別取400 μL的混合單糖標(biāo)準(zhǔn)液或多糖水解液于5 mL的具塞試管中，加400 μL PMP甲醇溶液，于70 ℃水浴中反應(yīng)2 h；加400 μL 0.3 mol/L的HCl溶液中和（pH 6～7）；加水1 200 μL，再加等體積的氯仿，渦旋混勻振搖，靜置，棄去氯仿相，萃取2 次。將水相用0.45 μm微孔膜（水系）過濾后供高效液相色譜儀進(jìn)樣分析。色譜條件：色譜柱C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：90 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.8）；流動相B：乙腈；檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；梯度洗脫條件：0～9 min，86% A、14% B；9～28 min，83% A、17% B；28～29 min，78% A、22% B；29～32 min，50% A、50% B；32～36 min，86% A、14% B。

1.3.8 紫外光譜分析

取暗褐脈柄牛肝菌粗多糖10 mg，置10 mL容量瓶中定容，在200～400 nm范圍進(jìn)行掃描測定[26]。

1.3.9 紅外光譜分析

取暗褐脈柄牛肝菌粗多糖2 mg加入0.2 g KBr固體混合研磨均勻，取約80 mg壓片，在4 000～400 cm-1范圍進(jìn)行紅外光譜測定[27]。

1.3.10 核磁共振分析

稱取暗褐脈柄牛肝菌粗多糖10 mg溶于0.6 mL D2O中，溶解后轉(zhuǎn)移至核磁管，密封。在核磁共振波譜儀上進(jìn)行1H-NMR和13C-NMR測定[28]。

1.3.11 掃描電子顯微鏡觀察

取少量多糖粉末直接粘到導(dǎo)電膠上后噴金，在10 kV加速電壓下，分別在500、1 000 倍和2 000 倍條件下采用Quanta FEG250場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察并記錄樣品的微觀形態(tài)。

1.3.12α-葡萄糖苷酶抑制率測定

精密稱取暗褐脈柄牛肝菌多糖樣品1 0 m g，用4 mL 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）溶解，得到2.5 mg/mL的暗褐脈柄牛肝菌子實體多糖溶液，并將其分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的多糖溶液。

參考文獻(xiàn)[29]方法，并作適當(dāng)改進(jìn)。暗褐脈柄牛肝菌子實體多糖樣品組：吸取不同質(zhì)量濃度的多糖溶液40 μL于96 孔板中，加入30 μL的α-葡萄糖苷酶（0.2 U/mL），輕晃混勻，在37 ℃的生化培養(yǎng)箱中孵育10 min，然后加入30 μL的PNPG溶液（0.5 mmol/L），在37 ℃的生化培養(yǎng)箱中孵育20 min，最終每孔加入50 μL的碳酸鈉溶液（0.5 mol/L）終止反應(yīng)，5 min后用酶標(biāo)儀在405 nm處測定其吸光度。樣品對照組：將上述步驟中的“加入30 μL的α-葡萄糖苷酶（0.2 U/mL）”改為“加入30 μL的PBS”，其余步驟相同?？瞻讓φ战M：用等量的PBS溶液代替多糖溶液，其余步驟相同。用阿卡波糖溶液作為陽性對照，每個樣品做3 次平行實驗。

α-葡萄糖苷酶抑制率計算如式（4）所示：

式中：A0為空白對照組吸光度；A1為多糖樣品組吸光度；A2為樣品對照組吸度。

1.3.13α-葡萄糖苷酶抑制機理的確定

參考文獻(xiàn)[30]方法，并稍作修改。在固定底物濃度的條件下，改變酶的用量，測定不同質(zhì)量濃度的多糖組分對α-葡萄糖苷酶抑制率的影響。取40 μL不同質(zhì)量濃度的多糖（0、2、4 mg/mL），每個質(zhì)量濃度分別加入0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶液30、60、90、120 μL，30 μL 0.5 mmol/L的PNPG為底物，按1.3.12節(jié)方法測定，利用酶標(biāo)儀在405 nm處測定吸光度。以酶用量（橫坐標(biāo)）對應(yīng)反應(yīng)速率（縱坐標(biāo)）作圖，由此圖反映α-葡萄糖苷酶經(jīng)暗褐脈柄牛肝菌多糖組分作用后剩余的酶活力與加入酶量間的關(guān)系。并根據(jù)動力學(xué)分析，判斷是可逆抑制還是不可逆抑制。

1.3.14α-葡萄糖苷酶抑制動力學(xué)

依次向試管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的PNP溶液（0.5 mmol/L），再加入0.5 mol/L的碳酸鈉溶液至2.31 mL，以蒸餾水為空白對照，利用酶標(biāo)儀在405 nm處測定吸光度；以PNP的體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制線性回歸方程，得到PNP標(biāo)準(zhǔn)曲線。

參考文獻(xiàn)[31]方法，并稍作修改。在固定酶濃度為0.2 U/mL的條件下，改變加入底物PNPG的濃度，測定暗褐脈柄牛肝菌子實體多糖對α-葡萄糖苷酶活力的影響。方法同1.3.12節(jié)，改變底物PNPG濃度為0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L。以酶反應(yīng)的初速度對底物濃度作圖，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程作圖，并判斷抑制類型。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

采用Excel和GraphPad 8.0.2軟件處理數(shù)據(jù)，用表示結(jié)果，采用Origin 2021軟件作圖，其中P＜0.05代表具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 暗褐脈柄牛肝菌多糖的提取結(jié)果

100 g暗褐脈柄牛肝菌粉末經(jīng)水提醇沉得到暗褐脈柄牛肝菌粗多糖8.9 g，得率為8.9%。以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖為對照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到擬合方程為Y＝12.425X-0.036 7（R2＝0.999 8），計算得到粗多糖中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.13%。以牛血清白蛋白為對照品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到擬合方程為Y＝7.775X+0.062 9（R2＝0.999 8），計算得到粗多糖中的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.4%。

2.2 4 種大孔樹脂的篩選結(jié)果

如表1所示，HP 2MGL具有較高的多糖保留率，但脫色率較差，僅41.82%，而SP 825的脫色率最好，其也具有較高的多糖保留率，綜合加權(quán)平均結(jié)果分析，SP 825型大孔樹脂最適用于暗褐脈柄牛肝菌多糖提取液的脫色并用于后續(xù)實驗。

表1 4 種樹脂對暗褐脈柄牛肝菌多糖的脫色實驗結(jié)果Table 1 Decolorization efficiencies of four types of resin for the crude polysaccharide from P.portentosus

2.3 暗褐脈柄牛肝菌多糖的分離純化結(jié)果

如圖1所示，通過DEAE-52纖維素柱色譜后，獲得了3 個明顯的洗脫峰。其中，蒸餾水洗脫峰與NaCl（0.1 mol/L）的洗脫峰面積比較大，含量相對較多，合并洗脫液，經(jīng)透析、冷凍干燥后得3 種暗褐脈柄牛肝菌純化多糖組分粉末：PPP-0、PPP-1、PPP-2，其中PPP-0含量最高，PPP-2含量最低。由于另外兩個組分較少且不易收集，因此只將PPP-0收集后進(jìn)行下一步分離純化。PPP-0經(jīng)Sephacryl凝膠S-400HR柱分離純化后得到單一對稱的吸收峰見圖2，證明PPP-0均一性良好，將洗脫液收集凍干得絮狀組分PPP-0。

圖1 暗褐脈柄牛肝菌多糖的DEAE-52纖維素色譜洗脫曲線Fig.1 Elution curves of polysaccharides from P.portentosus by DEAE-52 cellulose column chromatography

圖2 圖1中PPP-0的丙烯葡聚糖凝膠S-400HR柱層析洗脫曲線Fig.2 Elution curve of PPP-0 shown in Fig.1 by Sephacryl S-400HR column chromatography

2.4 分子質(zhì)量

表2為暗褐脈柄牛肝菌多糖（PPP-0）分子質(zhì)量表，圖3為暗褐脈柄牛肝菌多糖的分子質(zhì)量測定色譜圖，暗褐脈柄牛肝菌多糖的水相凝膠滲透色譜洗脫曲線只有一個峰，重均分子質(zhì)量為31 059 Da，說明多糖組分均一。

圖3 暗褐脈柄牛肝菌多糖的凝膠滲透色譜圖Fig.3 Gel permeation chromatogram of PPP-0

表2 暗褐脈柄牛肝菌多糖的分子質(zhì)量Table 2 Molecular mass of PPP-0

2.5 單糖組成

如圖4所示，與13 種單糖混合對照品標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對比，暗褐脈柄牛肝菌多糖由4 種單糖組成，分別為甘露糖Man、葡萄糖Glc、半乳糖Gal、巖藻糖Fuc，其物質(zhì)的量比為1.029∶5.312∶14.022∶2.925，其物質(zhì)的量百分比依次為4.4%、22.8%、60.2%、12.6%。

圖4 13 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（A）及暗褐脈柄牛肝菌多糖（B）的高效液相色譜圖Fig.4 High performance liquid chromatograms of mixture of 13 monosaccharide standards (A) and PPP-0 (B)

2.6 紫外光譜分析

如圖5所示，黑色曲線是DEAE-52纖維素柱色譜分離后得到的多糖溶液紫外光譜圖，紅色曲線是該多糖經(jīng)過丙烯葡聚糖凝膠S-400HR柱色譜分離后的紫外光譜圖，可以看出，該多糖在260 nm附近有紫外吸收，結(jié)合多糖含量測定結(jié)果，推測可能為成分均一的糖蛋白復(fù)合體。

圖5 暗褐脈柄牛肝菌多糖的紫外光譜圖Fig.5 UV spectra of PPP-0

2.7 紅外光譜分析

由圖6可知，3 405 cm-1處的吸收峰寬且強，為多糖分子中—OH的分子間締合的氫鍵，2 937 cm-1處的中等強度的吸收峰是飽和C—H伸縮振動，1 652 cm-1處為酰胺羰基峰，說明組分中含有氨基糖，多糖中可能含有部分與糖結(jié)合的蛋白。1 384 cm-1處出現(xiàn)弱的吸收峰，是由于C—H的變角振動。1 081 cm-1處是醇羥基的變角振動吸收峰。這些都是典型的多糖特征峰。988 cm-1處的吸收峰表明該多糖為吡喃型糖環(huán)，866 cm-1處附近的一系列的吸收峰表明該多糖同時存在α和β兩種構(gòu)型。

圖6 暗褐脈柄牛肝菌多糖的紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrum of PPP-0

2.8 核磁共振波譜分析

一般情況下，在δ4.3～5.5端基質(zhì)子區(qū)，α-糖苷的端基質(zhì)子的化學(xué)位移一般大于δ4.95，β-構(gòu)型的糖端基質(zhì)子化學(xué)位移小于δ4.95，根據(jù)圖7A，δ4.94、4.93、4.48是β型H1質(zhì)子信號，δ5.01和δ5.02處是α型H1質(zhì)子信號，表明該多糖既有β型吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)也有α型吡喃糖環(huán)結(jié)構(gòu)，δ1.17、1.18、1.27、1.25為巖藻糖CH3的質(zhì)子信號。δ3.17、3.42等化學(xué)位移在δ3.0～4.0區(qū)域為糖殘基中非端基質(zhì)子的次甲基和亞甲基共振區(qū)。圖7B中，在端基碳的共振區(qū)（δ90～110）中，δ97.91是α型C1的共振信號，δ15.74為巖藻糖CH3上C的共振信號，對于游離C6共振信號約在δ62氧取代后則位移到δ68，所以δ68.32和δ68.86是發(fā)生氧取代的C6信號，說明該多糖有(1→6)糖苷鍵。綜合以上信息，可知該多糖包括α和β兩種構(gòu)型，具有(1→6)糖苷鍵，但該多糖是結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的雜多糖，僅憑現(xiàn)有數(shù)據(jù)無法分析其具體結(jié)構(gòu)，還需要結(jié)合甲基化實驗和二維核磁共振相關(guān)譜進(jìn)一步分析確定其結(jié)構(gòu)。

圖7 暗褐脈柄牛肝菌多糖的1H-NMR（A）和13C-NMR（B）圖Fig.7 1H-NMR (A) and 13C-NMR (B) spectra of PPP-0

2.9 掃描電子顯微鏡圖分析

從圖8可以看出，暗褐脈柄牛肝菌多糖呈片狀，有的卷曲，大小、形狀不均勻，在更高倍數(shù)下，表面相對緊密，說明此組分多糖分子間交聯(lián)非常緊密，彼此間相互作用較強。

圖8 暗褐脈柄牛肝菌多糖的掃描電子顯微鏡圖Fig.8 SEM images of PPP-0

2.10 α-葡萄糖苷酶抑制活性

通過α-葡萄糖苷酶抑制實驗，測得暗褐脈柄牛肝菌子實體粗多糖抑制率曲線，相同情況下對比陽性對照藥物阿卡波糖的抑制率曲線。由此可初步判定暗褐脈柄牛肝菌子實體粗多糖對α-葡萄糖苷酶具有一定的抑制作用。

為篩選出降血糖活性最好的純化多糖組分，將暗褐脈柄牛肝菌子實體粗多糖、PPP-0、PPP-1、PPP-2分別進(jìn)行酶抑制實驗，抑制率曲線如圖9所示，當(dāng)多糖質(zhì)量濃度在0.25～2.5 mg/mL時，暗褐脈柄牛肝菌多糖的粗多糖、PPP-0、PPP-1、PPP-2均有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其中PPP-1與PPP-2抑制率與多糖質(zhì)量濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系，PPP-0抑制率與多糖質(zhì)量濃度量效關(guān)系不明顯，并且抑制率均低于陽性對照藥品阿卡波糖。純化多糖組分中PPP-1與PPP-2在多糖質(zhì)量濃度為0.25～2.5 mg/mL的范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升的趨勢，且隨著質(zhì)量濃度的增大，PPP-1對α-葡萄糖苷酶的抑制率從32.20%到57.15%，PPP-2對α-葡萄糖苷酶的抑制率從39.04%到70.55%。在同等多糖質(zhì)量濃度（1.0 mg/mL）下，不同的多糖組分對α-葡萄糖苷酶抑制率為PPP-2＞PPP-0＞粗多糖＞PPP-1；在同等多糖質(zhì)量濃度（2.0 mg/mL）下，不同的多糖組分對α-葡萄糖苷酶抑制率為PPP-2＞粗多糖＞PPP-0＞PPP-1，其中PPP-2的抑制活性遠(yuǎn)高于另外3 個組分。由于提取分離純化實驗所得的多糖組分PPP-2含量最少，多糖組分PPP-0含量最大，所以最終選擇PPP-0組分進(jìn)行酶抑制動力學(xué)實驗，探究其抑制機理及類型。

圖9 暗褐脈柄牛肝菌子實體多糖抑制率曲線Fig.9 Inhibitory effects of polysaccharides from P.portentosus on α-glucosidase

2.11 α-葡萄糖苷酶抑制機理的確定

在測定酶活性體系中，如果有一定量的不可逆性抑制物質(zhì)存在時，會使酶的分子構(gòu)象發(fā)生永久性變化而失活，表現(xiàn)在其速率直線不經(jīng)過原點；如果有一定量的可逆性抑制物質(zhì)存在時，由于抑制劑的量恒定，所以可以得到一條經(jīng)過原點的速率直線。

通過酶標(biāo)儀在405 nm處測得各組的吸光度，代入PNP回歸方程，計算得到加入不同酶量后的反應(yīng)速率，以酶用量對應(yīng)反應(yīng)速率作圖，結(jié)果如圖10所示，得到不同質(zhì)量濃度的PPP-0對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)曲線，以此分析α-葡萄糖苷酶經(jīng)PPP-0多糖組分作用后剩余的酶活力與加入不同酶量之間的關(guān)系。α-葡萄糖苷酶經(jīng)過1 mg/mL PPP-0作用后，通過對數(shù)據(jù)分析，酶活力和酶添加量之間的關(guān)系是一條直線，方程為y＝0.017 4x-7×10-5，R2＝0.999 9；隨著PPP-0質(zhì)量濃度增加到2 mg/mL時，酶活力和酶添加量之間的關(guān)系是一條斜率減小的直線，方程為y＝0.016 9x-9×10-5，R2＝0.999 8。由于兩條曲線的縱截距很小，近似于0，所以可認(rèn)為其過原點，說明PPP-0對α-葡萄糖苷酶的抑制為可逆作用。PPP-0和α-葡萄糖苷酶可逆性地結(jié)合，抑制了酶的活力，使其催化效率降低，而不是因為PPP-0質(zhì)量濃度的增加，使酶分子構(gòu)象發(fā)生永久變化導(dǎo)致有效酶量的減少，以至于酶催化效率的下降。酶活力單位的定義為在37 ℃、pH 6.8的條件下1 min內(nèi)PNPG能轉(zhuǎn)化為1 μmol PNP的酶量。

圖10 PPP-0對α-葡萄糖苷酶的抑制動力學(xué)曲線Fig.10 Inhibition of kinetic curves of α-glucosidase by PPP-0

2.12 α-葡萄糖苷酶抑制動力學(xué)

以蒸餾水為空白對照，利用酶標(biāo)儀在405 nm處測定吸光度；以PNP的體積為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，作線性回歸方程，得到PNP回歸方程：y＝2.084x+0.010 8，R2＝0.999 7。在測定酶活性體系中，改變底物PNPG的濃度，加入濃度0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，測定不同濃度PPP-0對酶活力的影響，以未加酶液PPP-0組作對照。由Lineweaver-Burk法雙倒數(shù)作圖，即以1/[S]為橫坐標(biāo)（[S]表示底物濃度），1/[V]為縱坐標(biāo)（[V]表示酶促反應(yīng)速率），結(jié)果如圖11所示，可知PPP-0和無抑制的兩條直線相交于縱坐標(biāo)，存在抑制劑時，米氏常數(shù)Km值逐漸增大，最大反應(yīng)速率Vmax保持恒定，可推測出PPP-0組分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用類型是競爭性抑制。

圖11 PPP-0對α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk圖Fig.11 Lineweaver-Burk plot for α-glucosidase inhibition by PPP-0

3 結(jié)論

4 種大孔樹脂（HP 2MGL、HP 20、SP 850、SP825）中，SP 825大孔樹脂脫色綜合效果最好，且對多糖溶液的脫色率為63.49%，醇沉得到粗多糖8.9 g（得率8.9%），且粗多糖中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44.13%，蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.4%。

通過DEAE-52纖維素和丙烯葡聚糖凝膠S-400HR柱色譜分離和純化得到暗褐脈柄牛肝菌多糖3 個組分：PPP-0、PPP-1、PPP-2，其中PPP-0含量最高且為均一成分，重均分子質(zhì)量為31 059 Da；單糖組成分析表明PPP-0是一種由半乳糖Gal、葡萄糖Glc、巖藻糖Fuc和甘露糖Man組成的雜多糖，其物質(zhì)的量占比依次為60.2%、22.8%、12.6%、4.4%。

通過紫外光譜分析得出所制備的多糖，可能為成分均一的糖蛋白復(fù)合體；紅外光譜與核磁共振波譜分析得出該多糖結(jié)構(gòu)中存在α型和β型吡喃糖；掃描電子顯微鏡顯示，所制備的暗褐脈柄牛肝菌多糖呈片狀卷曲。

粗多糖、PPP-0、PPP-1和PPP-2均可抑制α-葡萄糖苷酶活性，但抑制率均低于陽性對照藥品阿卡波糖；測定酶活體系中，PPP-0組分對α-葡萄糖苷酶的抑制為可逆性抑制，即不會使酶的分子構(gòu)象發(fā)生永久性變化而失活；通過酶抑制動力學(xué)分析，可知PPP-0對α-葡萄糖苷酶的抑制為競爭性抑制。