基于網(wǎng)絡藥理學六君子湯治療胃輕癱的機制研究

彭美萍，郭思彤，藍 穎，劉曉霞，譚思濤

（廣西醫(yī)學科學院·廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，廣西 南寧 530021）

傳統(tǒng)中藥湯劑六君子湯源于《世醫(yī)得效方》，有益氣健脾、燥濕化痰之功效，主要用于脾胃不和、食欲不振，或反胃腹痛腹瀉、脾胃消化功能下降，即現(xiàn)代西醫(yī)理論中所說的慢性胃炎、胃潰瘍、胃輕癱等胃腸道疾病。近年來，也有很多高質(zhì)量的多中心、雙盲、隨機試驗證實了六君子湯有助于恢復脾胃功能，減輕消化不良癥狀，改善胃排空情況[1]。 但是關(guān)于六君子湯發(fā)揮療效的關(guān)鍵靶點與分子機制鮮有報道。與研究化學藥的藥理特征以單一成分對應單一靶點相比，中藥具有多組分、多靶標和多途徑協(xié)同作用的特點。如何闡釋清楚其物質(zhì)基礎及作用原理一直是中藥研究的一大難題，網(wǎng)絡藥理學可為中藥復方作用機制研究提供嶄新的思路與手段，這有助于揭示中藥復方的科學內(nèi)涵、發(fā)掘復雜中藥的有效成分、預測作用靶點和新的適應證，為提升中醫(yī)藥創(chuàng)新研究和大數(shù)據(jù)挖掘提供理論支撐[2]。為此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，從六君子湯的物質(zhì)基礎出發(fā)，著眼于整體角度分析六君子湯治療胃輕癱的分子機制。

1 材料與方法

1.1 六君子湯相關(guān)靶點篩選

利用中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學平臺（TCMSP 數(shù)據(jù)庫）[3]查找人參、半夏、白術(shù)、陳皮、茯苓、甘草六味中藥的化學組成成分，根據(jù)口服利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18 這兩項藥代動力學參數(shù)對活性化合物及其作用的蛋白質(zhì)靶點進行初篩，結(jié)合化學專業(yè)數(shù)據(jù)庫[4],使用SwissADME（https://www.swissadme.ch）工具預測化合物的ADME（吸收、分布、代謝、排泄）性質(zhì)并進行篩選，補充有效成分及其靶點，并參考相關(guān)文獻報道補充未預測到的活性化合物的已知靶點。匯總并刪除重復的靶點信息后，將化合物作用的蛋白質(zhì)靶點全部在Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）進行規(guī)范。轉(zhuǎn)化為標準的蛋白靶點編號。

1.2 胃輕癱相關(guān)靶點篩選

以“Gastroparesis， Dysmotility，Esophageal Dysmotility，Gastric stasis，Gastrointestinal ulceration，Gastrointestinal Dysfunction，digestive disturbance” 作 為關(guān)鍵詞，收集OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org）胃輕癱的潛在靶點信息。在DisGeNET數(shù)據(jù)庫（https://www.disgenet.org）中，選取與“Gastroparesis”聯(lián)系密切的相關(guān)疾病“Cyclical vomiting syndrome （disorder），Abnormality of the stomach，Abnormality of the gastric mucosa，Gastric ulcer，F(xiàn)unctional Gastrointestinal Disorders”。根據(jù)查詢結(jié)果進行篩選，保留相關(guān)度較高的目標靶點作為胃輕癱的潛在靶點，合并兩個疾病數(shù)據(jù)庫靶點后，刪除重復值得到該疾病靶點。

1.3 六君子湯成分-胃輕癱靶點的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡構(gòu)建

為明晰六君子湯藥物相關(guān)靶點與胃輕癱靶點間的關(guān)聯(lián)，利用Excel 提取二者有交集的靶點并通過韋恩圖的方式來表達。用交集靶點通過STRING11.0 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡模型[5]，將生物種類設定為“Homosapiens”，最小互相作用閾值設定為“highest confidence ”（大于0.9），除此之外均為默認值，得到PPI網(wǎng)絡模型，通過CytoScape3.7.1 中的hubba 插件對PPI 網(wǎng)絡進行分析排序發(fā)現(xiàn)最佳的前20 個靶點，得到潛在的關(guān)鍵靶點基因，并通過分析其參與的生物學進程對其功能進行描述。

1.4 六君子湯成分-胃輕癱靶點功能與通路的富集分析

Metascape 平臺（https://metascape.org/gp/index.html）對基因擁有強大的分析功能，其覆蓋面也相當廣泛，整合了GO、KEGG、UniProt 和DrugBank 等多個權(quán)威的數(shù)據(jù)資源，可靠性強，通過該平臺可以對提交數(shù)據(jù)進行通路富集和生物過程注釋[6,7]。將六君子湯調(diào)節(jié)治療胃輕癱的靶點提交到Metascape 平臺進行數(shù)據(jù)分析，P值設置為小于0.01，除此之外均為默認值，分析其主要的生物學過程與代謝通路并進行富集分析。

2 結(jié)果

2.1 六君子湯活性成分靶點的獲取

初步提取的中藥化學成分結(jié)果如下：人參190 種、半夏116 種、白術(shù)55 種、陳皮63 種、茯苓34 種、甘草280 種，經(jīng)藥物ADME 篩選后共獲得白術(shù)7 種活性成分，陳皮5 種活性成分，茯苓15 種活性成分，甘草92 種活性成分，繼續(xù)篩選刪除無對應靶點成分。各成分初步提取的作用靶點結(jié)果如下：人參116 個、半夏97 個、陳皮66 個、茯苓23 個、甘草230 個，合并除去相同的數(shù)值后共得到靶點267個。六君子湯成分-靶點網(wǎng)絡圖的構(gòu)建，核心靶點的提取，主要產(chǎn)生藥效的活性成分的提取都可以通過CytoScape3.7.1 中的“NetworkAnalyzer”分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡拓撲參數(shù)得到并將結(jié)果可視化，見表1 與圖1。

圖1 六君子湯成分-靶點網(wǎng)絡圖

表1 六君子湯有效成分篩選結(jié)果

2.2 胃輕癱相關(guān)靶點的獲取

由OMIM 及DisGeNET 數(shù)據(jù)庫根據(jù)疾病相關(guān)性進行篩選，分別獲得胃輕癱靶點1989、328 個。結(jié)合DRUGBANK 數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，合并去除相同的數(shù)值，最終得到1902 個胃輕癱相關(guān)靶點。

2.3 六君子湯成分-胃輕癱靶點PPI 網(wǎng)絡的構(gòu)建

將篩選的六君子湯活性成分靶點與胃輕癱靶點取交集，繪制韋恩圖，得到六君子湯成分-胃輕癱共同靶點68 個，見圖2。六君子湯靶點PPI 網(wǎng)絡可以通過STRING11.0 平臺構(gòu)建，見圖3。通過CytoScape3.7.1 中的hubba 插件對PPI 網(wǎng)絡進一步分析得到潛在的關(guān)鍵靶點基因，見圖4。分析得出AKT1 在網(wǎng)絡中的連接度、節(jié)點介度 、緊密度分別為51、0.0552、0.7791，推測AKT1 為六君子湯治療胃輕癱的最主要靶點。TNF、

圖2 六君子湯成分-胃輕癱靶點韋恩圖

圖3 六君子湯-胃輕癱靶點PPI 網(wǎng)絡

圖4 六君子湯-胃輕癱靶點PPI 網(wǎng)絡中的Module

IL-6、IL-1β、VEGFA、MAPK3、PPARG、PTGS2、CASP3、MMP9 亦為相對重要的靶點。

由于PPI 網(wǎng)絡中蛋白與蛋白之間的關(guān)系是相互作用的，因此可視化結(jié)果多以無向圖表示。PPI 復雜網(wǎng)絡中存在部分連線密度較高的模塊，其內(nèi)部網(wǎng)絡是PPI 網(wǎng)絡的核心子網(wǎng)，是潛在的具有生物學意義的集合[8]。因此，為更精確地分析六君子湯治療胃輕癱的作用機制，在得到六君子湯PPI 網(wǎng)絡后，要應用Metascape 數(shù)據(jù)平臺中的MCODE 分析功能，通過分子復合物檢測算法對相互作用關(guān)系進行分析聚類（見圖4）。分別保留PPI 網(wǎng)絡與聚類模塊中排名前三的生物學進程對其進行功能描述，見表2。

表2 聚類模塊評分前3

2.4 靶點功能與通路的富集分析

把六君子湯治療胃輕癱相關(guān)靶點通過Metascape 數(shù)據(jù)平臺進行信號通路分析，并對結(jié)果可視化，見圖5。由結(jié)果可見六君子湯主要參與的生物學過程（GO BP）包括對脂多糖的應答、對細胞遷移的正調(diào)控、對無機物質(zhì)的反應、對損傷的應答、凋亡信號通路。參與的通路（KEGG）主要有糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、VEGF 信號通路、TNF 信號通路、麻疹等。相關(guān)靶點治療胃輕癱的功能（GO MF）主要富集于細胞因子活性、血紅素結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、蛋白酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合等，以及細胞組分（GO CC）的富集，見圖6。

圖5 靶點-通路網(wǎng)絡

圖6 六君子湯主要成分潛在靶點的富集分析

3 討論

在對六君子湯治療胃輕癱作用機制的網(wǎng)絡藥理學研究中對“成分-成分靶點網(wǎng)絡”“胃輕癱相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡”“成分-胃輕癱靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡”進行綜合分析得到，六君子湯治療胃輕癱的10 個潛在核心靶點AKT1、TNF、IL-6、IL-1β、VEGFA、MAPK3、PPARG、PTGS2、CASP3、MMP9。

AKT1 即蛋白激酶B，可通過一系列下游底物的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化的介導參與調(diào)控細胞的代謝、增殖、細胞存活、生長和血管生成等各種進程。AKT 調(diào)控的通路是人類癌癥中最常見的激活信號通路。一半以上的人類腫瘤含有過度活化的AKT[9-10]。VEGFA 即血管內(nèi)皮生長因子A，是調(diào)節(jié)脂肪組織中血管生成的關(guān)鍵因子。VEGFA 可誘導內(nèi)皮細胞增殖，促進細胞遷移，抑制細胞凋亡，誘導血管通透性的改變[11]，也會造成血管系統(tǒng)功能紊亂，生成高密度和高通透性的微血管促進腫瘤擴張。腫瘤組織血管生成主要依賴于VEGFA 的應答。

KEGG 通路富集分析顯示，六君子湯治療胃輕癱所調(diào)控的核心靶點主要參與AGE-RAGE 信號通路、VEGF信號通路、流體剪切應力與動脈粥樣硬化。GO 富集分析顯示，六君子湯所調(diào)控的核心靶點顯著富集對脂多糖的應答、對細胞遷移的正調(diào)控、對無機物的應答等生物過程。通過對關(guān)鍵通路及靶點的綜合分析，發(fā)現(xiàn)PI3KAKT 通路作為子網(wǎng)絡在上述多個關(guān)鍵通路中都有很高的參與度，該途徑是AKT 激活的關(guān)鍵節(jié)點。PI3K-AKT 信號通路被不同種類的細胞刺激或遭遇毒性損傷而激活，參與調(diào)節(jié)細胞促進生長和分裂，創(chuàng)建代謝反應、輔助繁殖等基本功能[12]。當酪氨酸激酶（RTK）或G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）與生長因子結(jié)合，會分別激活PI3K 的兩個異源二聚體，催化細胞膜上PIP2 轉(zhuǎn)化為PIP3，生成物PIP3 又成為下游通路的第二信使幫助激活AKT，進而通過磷酸化下游底物參與凋亡、蛋白質(zhì)合成、代謝和細胞周期來控制關(guān)鍵的細胞過程[13]。而且該通路為關(guān)鍵通路AGE-RAGE 信號通路的下游，通過PI3K-AKT 通路調(diào)節(jié)NF-κB 的表達可以對TNF、IL-6、IL-1β 等炎癥因子產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)的作用。

通過復雜網(wǎng)絡分析藥理特性的研究對于準確識別中藥成分的復雜機制具有重要意義。KEGG 通路富集分析表明靶點PTGS2 參與如花生四烯酸、TNF、NF-κB 和VEGF信號通路等炎癥途徑。PTGS2作為一種炎癥介質(zhì)，是一種限速酶，可催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素，發(fā)揮促炎癥作用并破壞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而促進白細胞分泌并加重炎癥反應[14]。許多炎癥性疾病的發(fā)病機制與花生四烯酸代謝途徑相關(guān)。PTGS2 是前列腺素的誘導酶，不僅參與炎癥反應前列腺素的生物合成，而且是該途徑的關(guān)鍵酶，這可以作為后續(xù)驗證PTGS2 作為關(guān)鍵蛋白的有力基礎。

研究結(jié)果表明六君子湯作為一個復方中藥制劑含有多種有效成分可以通過多個靶點干預疾病的進程，而同一靶點可在不同的生物學過程及信號通路發(fā)揮作用，體現(xiàn)了六君子湯多通路、多靶點聯(lián)合作用的復雜性。本文借助網(wǎng)絡藥理思維，構(gòu)建六君子湯的“組分-靶點-疾病途徑”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡并預測其潛在的作用機制。使六君子湯治療胃輕癱更好地應用于臨床，為后續(xù)評價六君子湯臨床療效指標的挖掘提供了重要線索，也為深入研究六君子湯可能存在的作用機制提供了新的思路和技術(shù)手段。但由于網(wǎng)絡藥理學方法僅僅是單純的數(shù)據(jù)分析，有自身的局限性，加上中藥復方制劑成分較多，在熬制時可能會產(chǎn)生復雜的化學反應，所以熬制后六君子湯的化學成分變化以及活性成分在體內(nèi)的代謝物并不在本次研究分析范圍內(nèi)。本研究主要利用數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)分析，結(jié)合生物信息學，對六君子湯做了初步的功能和調(diào)控作用的注釋和預測，后續(xù)將在此數(shù)據(jù)挖掘的基礎上進一步對六君子湯的有效活性成分進行更深入的篩選與通過動物實驗進行驗證，從而進一步明晰六君子湯的主要調(diào)控靶點。