環(huán)狀RNA在草食家畜肌肉中的研究進(jìn)展

吳子賢，李蘊(yùn)華，田 瑛，李秀男，趙艷紅，劉佳森

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018）

家畜肌肉的生長發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的、多階段的過程，受多種因素尤其是肌肉發(fā)育相關(guān)基因的調(diào)控。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA（circRNAs）廣泛參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和機(jī)體發(fā)育（包括肌肉發(fā)育）。有關(guān)circRNA 對家畜肌肉發(fā)育的影響目前已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本文簡要介紹了circRNAs 的發(fā)現(xiàn)、功能以及在家畜肌肉發(fā)育中的影響，以期為豐富家畜育種和提高家畜經(jīng)濟(jì)性狀提供參考。

1 circRNA的發(fā)現(xiàn)

circRNAs是一類由非規(guī)范剪接事件產(chǎn)生的非編碼RNA，被稱為反剪接。在反向剪接過程中，下游的剪接供體位點(diǎn)與上游的剪接受體位點(diǎn)共價(jià)連接。circRNA是一種閉合環(huán)狀RNA，可以穩(wěn)定存在于生物體中，但它不具有5’端帽結(jié)構(gòu)和3’端聚（a）尾結(jié)構(gòu)［1］。早在20世紀(jì)七八十年代，研究者就在Nature 和PANs 中提出circRNA 是一種共價(jià)封閉的環(huán)狀RNA 分子。根據(jù)circRNA 的序列組成，可將其分為3 種類型：外顯子來源的circRNA，內(nèi)含子來源的circRNA 和外顯子-內(nèi)含子circRNA。Cao 等［2］在羊的骨骼肌環(huán)狀RNA 文庫中發(fā)現(xiàn)了886種內(nèi)含子和外顯子形式的環(huán)狀RNA，其中大多數(shù)circRNA 和參與肌肉生長發(fā)育的肌肉特異性miRNA相互作用，尤其是circ776。但是，關(guān)于其他類型的circRNA 調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育的報(bào)道很少。因此，需要進(jìn)一步研究和突破。

2 circRNA的功能

circRNA 長期以來被認(rèn)為是具有調(diào)節(jié)效力的非編碼RNA（ncRNAs）［3］，可以在其合成位點(diǎn)與宿主基因結(jié)合，并通過形成RNA-DNA 雜合體（R 環(huán)結(jié)構(gòu)）導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄暫停或終止，從而上調(diào)外顯子跳過或截短轉(zhuǎn)錄本。大量的研究證實(shí)，circRNA 通過充當(dāng)ceRNA 或miR 海綿發(fā)揮生物學(xué)功能［4-5］。但鑒于circRNA 豐度普遍較低，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量有限，circRNA 如何檢測及怎樣充分發(fā)揮作用尚不清楚。Schuller 等［6］認(rèn)為，circRNAs 也可以與蛋白質(zhì)相互作用，其翻譯過程由核糖體完成，涉及起始、延伸、終止和核糖體循環(huán)。Zhao 等［7］研究發(fā)現(xiàn)，真核mRNAs 的起始包括從5'cap 近端連接點(diǎn)到起始密碼子的43s 預(yù)起始復(fù)合物的掃描，然后是核糖體亞單位連接和因子置換。由于缺乏5'帽和3'尾，circRNA只能采用不依賴帽的方式，由circRNA 編碼的肽通常被截?cái)?，其功能大部分類似于全長蛋白質(zhì)對應(yīng)物（circFBXW7-185aa）［8］。然而，一些源自circRNA 的蛋白質(zhì)發(fā)揮的功能獨(dú)立于宿主基因，甚至與宿主基因產(chǎn)物的功能相反（circFNDC3B-218aa）［9］。該結(jié)果拓寬了人類蛋白質(zhì)組的范圍。然而，circRNA 翻譯的調(diào)控機(jī)制以及延伸和終止的過程仍不完全清楚。

3 circRNA對家畜肌肉發(fā)育的影響

肌肉發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過程，主要依賴于肌纖維細(xì)胞的增殖和肥大［10］。研究表明，肌纖維的數(shù)量只在出生前增加，出生后變化不大，而且肌纖維的生長依賴于肌纖維的肥大［11］。肌纖維的肥大包括兩個(gè)方面：一是肌原纖維增多，二是肌纖維中的細(xì)胞核數(shù)目增多［12］。成肌細(xì)胞分化的生理過程，受包括PUR 蛋白家族在內(nèi)的復(fù)雜分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。PUR蛋白家族由轉(zhuǎn)錄因子富含嘌呤元件結(jié)合蛋白α（Purine-rich element binding protein alpha，PURα）和富含嘌呤元件結(jié)合蛋白β（Purine-rich element binding protein alpha，PURβ）組成，兩者在形成肌管中起著重要作用。PURα 和PURβ可以結(jié)合到MHC 的啟動子區(qū)域，抑制MHC 的轉(zhuǎn)錄和MHC蛋白的產(chǎn)生，從而抑制肌源性分化。circSamd4直接與PURα 和PURβ 結(jié)合，阻止其進(jìn)入細(xì)胞核，間接促進(jìn)肌肉細(xì)胞分化。肌肉發(fā)育是一個(gè)由多個(gè)基因調(diào)控的多步驟過程，它不僅受多種肌源性調(diào)控因子的調(diào)控，包括肌細(xì)胞生成素（Myogenin，MyoG）、肌源性調(diào)控因子-4（Cleregulatoryfactors-4，MRF-4）、肌球蛋白重鏈（Myosin heavy chain，MyhC）、成肌細(xì)胞調(diào)節(jié)因子家族成肌因子-5（Myogenic factor 5，Myf-5）、肌生長抑制素（Myostatin，MSTN）、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2A-D（Myocyte enhancer factor 2A-D，MEF2A-2D）、成肌分化抗原（Myogenic differentiation Antigen，MyoD）和配對盒（Paired box gene，Pax）家族成員Pax 3 和Pax 7［13］，也受其他相關(guān)基因的調(diào)控，如胰島素樣生長因子-I（Insulin-like growth factors-I，IGF-I）、胰島素樣生長因子-II（Insulin-like growth factors-II，IGF-II）、叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子01（Forkhead box O1，F(xiàn)ox01）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（Mechanistic target of rapamycin kinase，mTOR）［14］。此外，研究證實(shí)，影響肌肉發(fā)育的基因有兩種調(diào)節(jié)作用：一種是正向促進(jìn)，另一種是反向抑制［13，15-16］。這些生長因子在調(diào)節(jié)肌肉發(fā)育中發(fā)揮著獨(dú)特的作用，可以調(diào)節(jié)肌肉中許多部位的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、肌節(jié)激活和肌肉特異性基因譜系［17-18］。

據(jù)報(bào)道，動物肌肉和肌肉細(xì)胞中的circRNA 數(shù)量在2 000～37 000 之間［19-24］。在前人的研究中，許多circRNA 含有結(jié)合位點(diǎn)，如miR-1、miR-133、miR-206、miR-29、miR-378、miR-431［25］、miR-7［26］、miR-135a［27］、miR-1290［28］和miR-876-5p［29］，均在肌生成過程中參與細(xì)胞增殖、分化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。大量的證據(jù)還表明，家畜的肌肉發(fā)育確實(shí)受到circRNA 和miRNA 的調(diào)控。Shen 等［30］的研究證明，極少數(shù)circRNA 可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)家畜肌肉發(fā)育。然而，目前該領(lǐng)域幾乎沒有相關(guān)研究。因此，circRNA 以不同方式對肌肉發(fā)育的相關(guān)調(diào)控機(jī)制備受關(guān)注。

4 circRNA在家畜肌肉中的研究進(jìn)展

4.1 在牛肌肉中的研究

Wei 等［22］的研究結(jié)果表明，circLMO7 可以通過競爭性結(jié)合miR-378a-3p，增強(qiáng)miR-378a-3p 靶基因HDAC4的表達(dá)，促進(jìn)牛的肌細(xì)胞增殖，抑制成肌細(xì)胞的分化。Yan 等［31］通過建立RNA 序列文庫，共鑒定了哈薩克牛和新疆褐牛背最長肌樣本中的5 177 個(gè)circRNA，發(fā)現(xiàn)其中有46 個(gè)是差異表達(dá)的。差異表達(dá)基因的鑒定表明，肌肉發(fā)育過程與差異表達(dá)的circRNA有關(guān)。Wei等［22］首次檢測了牛骨骼肌在兩個(gè)發(fā)育時(shí)期（胚胎期和成年最長?。┑腸ircRNA 表達(dá)譜，指出當(dāng)miR-378a-3p 被下調(diào)、靶基因hdac4 被激活，從而促進(jìn)了肌細(xì)胞的增殖，抑制肌細(xì)胞分化。Li等［32］研究發(fā)現(xiàn)，circFGFR4 和miR-107 在秦川牛胚胎期（90 d）和成年期（24 個(gè)月）的背最長肌中高表達(dá)，并且circFGFR4 可以吸附miR-107。MiR-107 可通過與過表達(dá)的circFGFR4 結(jié)合來削弱Wnt3a 的表達(dá)。可見Wnt3a 作為miR-107 的靶點(diǎn)，在抑制肌管形成和促進(jìn)成肌細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著重要作用。綜上所述，circFGFR4 可以作為miR-107 海綿消除miR-107 對Wnt3a 表達(dá)和牛原代成肌細(xì)胞分化的抑制作用。Wang 等［33］研究發(fā)現(xiàn)，circTTN 可通過與miR-432 競爭性結(jié)合激活I(lǐng)GF-II/磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/AKT 信號通路，進(jìn)而促進(jìn)牛成肌細(xì)胞的增殖和分化。Li 等［32］研究發(fā)現(xiàn)，成年牛肌肉中的circFUT10可以通過競爭性結(jié)合miR-133a來降低其對靶基因的抑制作用，并且與肌肉發(fā)育相關(guān)的MyHC、MyoD和MyoG基因表達(dá)在mRNA 和蛋白質(zhì)水平上與circFUT10 的表達(dá)同步變化。circ-FUT10 過表達(dá)可促進(jìn)MyHC表達(dá)，誘導(dǎo)成肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。相反，circZfp609 與miR-194-5p 結(jié)合抑制bcl2相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（BCLAF1）的表達(dá)，從而影響Myf5 和MyoG 的表達(dá)，抑制成肌細(xì)胞分化。circSNX29 廣泛存在于牛的原代成肌細(xì)胞中，但其在胚胎骨骼肌中的表達(dá)水平明顯高于在成年骨骼肌中的表達(dá)水平。Peng等［34］研究發(fā)現(xiàn)，circSNX29的過表達(dá)促進(jìn)成肌細(xì)胞分化并抑制細(xì)胞增殖，而干擾circSNX29 會抑制成肌細(xì)胞分化并促進(jìn)增殖。之后的生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果表明，circSNX29 可能吸附到miR-744 上，具有9 個(gè)潛在的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶檢測結(jié)果表明，circSNX29可以直接競爭性結(jié)合miR-744，有效逆轉(zhuǎn)miR-744 對Wnt5a和CaMK II 的抑制作用。通過KEGG 通路富集分析、Western blot、鈣熒光探針和CamK II 活性檢測，發(fā)現(xiàn)Wnt5a 和circSNX29 的過表達(dá)激活了非經(jīng)典通路Wnt/Ca2+，通過增加CamK II 激酶的活性和PKC 的磷酸化水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)牛成肌細(xì)胞的增殖和分化。以上研究進(jìn)一步表明，胚胎期的肌肉發(fā)育比成年期更有效。

4.2 在羊肌肉中的研究

Li等［20］的研究結(jié)果表明，在胚胎期和成年期哈薩克羊的背最長肌中均有6 113個(gè)差異表達(dá)的circRNA，circRNA 的母源基因主要富集在肌肉生長發(fā)育相關(guān)的信號通路中。其中oar_circ_0000385、oar_circ_0000582和oar_circ_0001099 在與肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNA（miR-143、miR-133 和miR-23）上有多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；在綿羊成年背最長?。↙DM-A）和胚胎背最長?。↙DME）的RNA序列中共發(fā)現(xiàn)5 086個(gè)差異表達(dá)的circRNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果表明，circRNA 0000552、circRNA 00002456、circRNA 00004666、circRNA00004676和circRNA 00004690 在LDM-E 中的表達(dá)量相對高于LDM-A。circRNA 0003451、circRNA 0005243、circRNA 0005250 和circRNA 0005256 在LDM-A 中的表達(dá)相對高于LDM-E，證明circRNA 在綿羊肌肉差異表達(dá)。Cao等［2］從綿羊骨骼肌RNA 基因庫中提取了7 550 萬個(gè)序列，這些序列被映射到綿羊參考基因組中的729個(gè)基因，共包含886個(gè)circRNA；同時(shí)，該研究使用RNA-seq研究了分娩前后綿羊背長肌中的circRNA，共檢測到6 113個(gè)circRNA，其中部分circRNA（circRNA100、circRNA108、circRNA205、circRNA606、circRNA678、circRNA744 和circRNA776）含有至少兩個(gè)與肌肉發(fā)育相關(guān)的miRNA保守靶點(diǎn)（miR-29b、miR-133、miR-208和miR-499）。

5 結(jié)語

circRNAs 是肌肉發(fā)育的新調(diào)節(jié)劑。然而，目前有關(guān)circRNA 的功能注釋主要是預(yù)測和分析源編碼基因或可能的miRNA 結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)前的大多數(shù)研究都集中在通過ceRNA 共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)指導(dǎo)肌肉發(fā)育的circRNA 上。此外，一些研究證實(shí)circRNA 可以在轉(zhuǎn)錄和翻譯中調(diào)節(jié)家畜肌肉發(fā)育，只有少數(shù)研究表明circRNA 可以直接調(diào)節(jié)家畜肌肉發(fā)育。因此，深入研究circRNA 的形成和類型以及與靶基因的作用機(jī)制，探索其生物學(xué)功能，對于了解生物體的生長發(fā)育和疾病治療具有重要意義。由于circRNA 的多樣性、作用模式的多樣性以及研究方法的限制，尚需要一些時(shí)間來闡明這些基因及其調(diào)控機(jī)制。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)、新一代測序技術(shù)的飛速發(fā)展，circRNA 還有其他方法可以調(diào)節(jié)牲畜的肌肉發(fā)育。