一步式農(nóng)藥殘留快速檢測集成卡制備及應(yīng)用

關(guān)鍵詞：農(nóng)藥殘留；快速檢測；檢測卡；有機磷；氨基甲酸酯；膽堿酯酶抑制法

0 引言

農(nóng)藥殘留問題已成為影響我國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的重要因素之一。有機磷（OP）和氨基甲酸酯（CM）類農(nóng)藥在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用最為普遍（占70%～75%），其通過不可逆的抑制動物神經(jīng)系統(tǒng)的乙酰膽堿酯酶（AchE），實現(xiàn)對昆蟲的殺傷[1-3]。質(zhì)譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等方法在果蔬農(nóng)藥殘留檢測中應(yīng)用較廣，但這些方法需要昂貴的儀器和專業(yè)的操作人員，并且耗時[4-7]。膽堿酯酶抑制法具有成本低、耗時短、操作簡單等優(yōu)勢，是國家標準GB/T5009.199—2003《蔬菜中有機磷和氨基甲酸醋類農(nóng)藥殘留量的快速檢測》規(guī)定的對OP和CM類農(nóng)藥殘留進行快速篩查的通用方法[8-9]。目前，這種方法仍然受到多步驟操作、酶活性不穩(wěn)定等因素的限制。因此，研究開發(fā)性能穩(wěn)定、靈敏度高的新型農(nóng)藥殘留即時檢驗（POCT）系統(tǒng)，具有十分重要的意義。

噴墨打印技術(shù)以非接觸的方式簡單、準確地將微量材料沉積到印刷基材上，具有穩(wěn)定性好、準確度高、重現(xiàn)性好及成本效益高等優(yōu)點[10-12]。它可以通過噴墨打印的方式實現(xiàn)多種材料，如小分子、生物蛋白和藥物等的固定[13-15]。GDORE等[16]使用噴墨打印機打印多酶二維陣列，并檢測了固定后酶活性。LEEJ等[17]制備酶溶液作為打印墨水，固定黃嘌呤氧化酶并評估藥物活性。但考慮到農(nóng)藥對乙酰膽堿酯酶的抑制需要時間，實現(xiàn)農(nóng)藥殘留一步法檢測的研究較少。

本研究基于膽堿酯酶抑制法，利用數(shù)字化控制的高精度樣品沉積技術(shù)——噴墨打印技術(shù)，構(gòu)建了有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留廣譜、快速篩查的新型檢測方法。利用噴墨打印技術(shù)，將反應(yīng)體系打印到聚乙烯醇（PVA）膜上，反面貼上AChE酶膜片，以聚氯乙烯（PVC）膠板做支撐將所有成分壓制成一個整體，制備靈敏、高效、方便操作并便于攜帶的檢測集成卡，建立了一種簡單、快速、高效的農(nóng)藥殘留檢測方法，簡化了檢測步驟，拓寬了檢測的應(yīng)用范圍，提高了檢測的便捷性和有效性，實現(xiàn)了檢測過程的一步化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氧化樂果和克百威等農(nóng)藥標準品購自北京國家標準物質(zhì)信息中心；AChE購自鄭州貝貝生物科技有限公司生產(chǎn)的紅林蟻膽堿酯酶；果蔬樣品購自鄭州市超市；碘化乙酰硫代膽堿（Atch-I）、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、PVA購自上海阿拉丁試劑有限公司；納米玻璃纖維膜、PVC膠板購自上海金生物科技有限公司。

MilliQ試劑水系統(tǒng)（Millipore，Billerica，MA）制備超純水；噴墨打印機為HPInkTankWireless418。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配置

配制pH值為8.0的磷酸鹽（PS）緩沖溶液；取適量農(nóng)藥標準品，用PS緩沖溶液稀釋至合適濃度；稱取Atch-I溶解于超純水中，制備不同濃度的底物溶液；稱取DNTB，分別溶于無水乙醇中，制備不同濃度的顯色劑溶液。

1.2.2 打印設(shè)置

將配置好的底物、顯色劑和PS緩沖溶液各取0.5mL分別注射進入清洗干凈的M（洋紅色）、C（青色）、Y（黃色）墨盒中，并使其均勻地吸附在墨盒中的海綿上，封閉墨盒，準備打印。試驗通過AdobePhotoShop軟件控制CMYK顏色參數(shù)，使相應(yīng)墨盒中的墨水噴射出來。利用AdobePhotoShop軟件將CMYK顏色參數(shù)設(shè)置為C=100、M=0、Y=0、K=0時，則只有注入C墨盒中的墨水能噴出。同樣，通過調(diào)整參數(shù)，可以使其他相應(yīng)墨盒中的墨水噴射出來。

1.2.3 打印層數(shù)優(yōu)化

將0.5mL（濃度12.5mg/mL）和0.5mL（濃度125mg/mL）的底物打印溶液分別注入M墨盒中；將0.5mL（濃度10.5mg/mL）和0.5mL（濃度105mg/mL）的顯色劑打印溶液分別注入C墨盒中；將0.5mL（1×）和0.5mL（10×）的PS打印溶液分別注入Y墨盒中。通過AdobePhotoShop調(diào)節(jié)CMYK相應(yīng)的參數(shù)，利用羊皮紙為打印基板來測試打印效果。分別打印M=100（C=Y=K=0）、C=100（M=Y=K=0）和Y=100（C=M=Y=0）的直徑6mm的圓形。低濃度的PS緩沖溶液（1×）、底物溶液（12.5mg/mL）和顯色劑溶液（10.5mg/mL）打印10層；高濃度的PS緩沖溶液（10×），底物溶液（125mg/mL）和顯色劑溶液（105mg/mL）打印1層。打印結(jié)束后，在各打印圖案上滴加酶抑制反應(yīng)體系中沒有被打印在圖案中的其余反應(yīng)溶液，室溫靜置2min，觀察各打印圖案上溶液的顯色情況，分析打印濃度與打印層數(shù)之間的關(guān)系。

1.2.4 打印溶液濃度優(yōu)化

向噴墨打印機的M墨盒中注入0.5mL不同濃度的底物打印溶液（50、75、100和125mg/mL），向C墨盒中注入0.5mL不同濃度的顯色劑打印溶液（30、50、80和100mg/mL），向Y墨盒中注入0.5mL不同濃度的PS打印溶液（10×、20×、30×、40×），通過AdobePhotoShop調(diào)節(jié)CMYK相應(yīng)的參數(shù)，在羊皮紙上測試打印效果。打印結(jié)束后，在打印圖案上滴加反應(yīng)體系中沒有被打印在圖案上的成分，陰性對照為在各打印圖案上滴加等量的水，室溫靜置2min，觀察顯色情況，選擇底物、顯色劑、PS打印溶液打印1層即可顯色明顯的最佳顯色濃度。

1.2.5 農(nóng)藥檢測

將OP農(nóng)藥（氧化樂果）、CM類農(nóng)藥（克百威）稀釋至不同濃度（氧化樂果0.5、1.0、2.0和3.0mg/L；克百威0.01、0.05和1.70mg/L），滴入檢測卡中，室溫放置15min后，觀察顯色結(jié)果。以超市購買的大白菜作為實際樣品，將不同濃度的氧化樂果（0.5、1.0、2.0和3.0mg/L）溶液噴灑于大白菜的葉片上，使葉片表面上的農(nóng)藥量達到1mL/g，并將葉片在室溫下靜置24h。靜置結(jié)束后將葉片剪碎，稱取5g于燒杯中，并向燒杯中加入10mL、1×PS緩沖溶液，充分振蕩，靜置5min后吸取40μL上清液滴加于檢測系統(tǒng)的檢測點上，室溫靜置15min，觀察檢測點的顯色情況。

一步式快速檢測集成卡制備及農(nóng)藥殘留檢測示意如圖1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 打印層數(shù)與打印濃度選擇

由圖2可知，低濃度溶液在打印基板上沉積10層后的顯色效果與高濃度溶液在打印基板上沉積1層后的顯色效果相同，說明打印層數(shù)的疊加也是打印濃度疊加的過程。為了使檢測系統(tǒng)的制備過程更加高效、快捷，試驗將確定底物、顯色劑、PS打印溶液在利用噴墨打印技術(shù)打印時打印1層就可以顯色明顯的打印濃度。

2.2 底物打印濃度選擇

由圖3可知，隨著打印濃度增加，顯色效果逐漸增強，當(dāng)?shù)孜锎蛴∪芤簼舛?25mg/mL時，顯色效果最強，因此，確定底物打印溶液濃度125mg/mL。

2.3 PS打印溶液打印濃度選擇

由圖4可知，不同濃度的PS打印溶液在打印基板上沉積1層后的顯色效果無差異，因此，試驗選擇10×的PS打印溶液來進行后續(xù)的打印。

2.4 顯色劑打印溶液打印濃度選擇

由圖5可知，隨著打印濃度增加，顯色效果逐漸增強，當(dāng)顯色劑打印溶液濃度105mg/mL時，顯色效果較強，因此，確定顯色劑打印溶液濃度105mg/mL。

2.5 農(nóng)藥殘留檢測集成卡對常見農(nóng)藥檢測靈敏度

為了評估農(nóng)藥殘留檢測系統(tǒng)對常見OP和CM類農(nóng)藥檢測時靈敏度，試驗選取了OP和CM類代表農(nóng)藥氧化樂果、克百威，進行檢出限（LOD）測定，檢測結(jié)果如圖6和表1所示。國家標準規(guī)定的氧化樂果、克百威LOD分別為2.3和0.5mg/L，試驗所測LOD分別為0.5和0.01mg/L[18]。檢出限均滿足國家標準的檢出限標準，并且其檢出限在一定程度上優(yōu)于國家標準的檢出限標準，說明制備的農(nóng)藥殘留檢測系統(tǒng)具有較高的靈敏度。

2.6 農(nóng)藥殘留檢測集成卡對實際樣品中農(nóng)藥殘留定性檢測

為了進一步評估農(nóng)藥殘留檢測系統(tǒng)對實際樣品中存在的農(nóng)藥殘留情況進行檢測時檢測效果，選用超市購買的大白菜作為實際樣品，并將氧化樂果標準品用PS緩沖溶液稀釋成合適的濃度用于檢測，檢測結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，農(nóng)藥殘留檢測系統(tǒng)可以檢測到實際樣品中的氧化樂果，并且檢測系統(tǒng)對氧化樂果檢出限1mg/mL，優(yōu)于國家標準的氧化樂果檢出限濃度（2.3mg/mL）。

2.7 農(nóng)藥殘留檢測集成卡與市售檢測試劑盒對比

利用本研究制備的農(nóng)藥殘留檢測卡、市售農(nóng)藥殘留檢測試劑盒（分光光度法），分別對常見OP和CM類農(nóng)藥進行檢測，結(jié)果如表2所示。本研究制備的一步檢測卡對幾種農(nóng)藥的IC50檢出值均低于市售農(nóng)藥殘留檢測試劑盒，表明本研究系統(tǒng)具有更低的檢出濃度，更高的靈敏度。

3 結(jié)束語

本研究采用噴墨打印技術(shù)沉積反應(yīng)體系，制備了簡單、快速、穩(wěn)定的一步式OP和CM類農(nóng)藥殘留快速檢測集成卡。制備的新型農(nóng)藥殘留POCT系統(tǒng)與傳統(tǒng)的依賴分光光度計的檢測方法相比，實現(xiàn)了由濕式、多步式的檢測方式變?yōu)楦墒?、一步式檢測。當(dāng)檢測樣品滴加到酶膜上時，通過顏色的變化即可判斷出被檢樣品中的農(nóng)藥殘留情況。該檢測卡取代了傳統(tǒng)的用移液槍滴加的步驟，簡化了操作程序，實現(xiàn)了納升級溶液的精確自動化輸送，提高了檢測靈敏度。同時，沉積在計算機控制條件下進行，大大提高了檢測系統(tǒng)的再現(xiàn)性，減少了檢測點之間的誤差。對納升級溶液代表性農(nóng)藥進行檢測，結(jié)果表明，快速檢測集成卡對這幾種農(nóng)藥的檢出限符合國家標準規(guī)定的檢出限，在一定程度上比市售檢測試劑盒的檢出限更低，具有較高的靈敏度。新型農(nóng)藥殘留快速檢測集成卡操作簡便、方便快捷、易于使用及價格合理，具有靈敏度高、穩(wěn)定性強、重現(xiàn)性好的優(yōu)點，適合多種場合實時檢測，在POCT中表現(xiàn)出較大的應(yīng)用潛力。