核酸適配體傳感器在常見食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用及發(fā)展

關(guān)鍵詞：食源性致病菌；快速檢測(cè)；核酸適配體；適配體篩選；核酸適配體傳感器

0 引言

食源性致病菌是一類通過食物進(jìn)行傳播的致病菌，人體一旦被食源性致病菌侵染，極易導(dǎo)致急性腸胃炎、腹瀉、頭痛、嘔吐甚至死亡事件[1]。較為常見的食源性致病菌，主要有大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌等。早期實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要在分離、培養(yǎng)、鑒定等方面，難以滿足大量樣品快速檢測(cè)的需求，因此急需快速、準(zhǔn)確的方法檢測(cè)食源性致病菌，以縮小其危害范圍。近年來，研究人員不斷探索食源性致病菌的檢測(cè)方法，其中基于核酸適配體的檢測(cè)方法成為熱門趨勢(shì)。本研究總結(jié)歸納核酸適配體的篩選程序及其優(yōu)缺點(diǎn)，列舉核酸適配體傳感器在食源性致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用，分析其在應(yīng)對(duì)樣品的快速高效檢測(cè)要求時(shí)的發(fā)展趨勢(shì)，為食品及農(nóng)產(chǎn)品中食源性致病菌的快速檢測(cè)方法改進(jìn)提供更多思路。

1 檢測(cè)方法

1.1 早期篩查方法

早期的食源性致病菌檢測(cè)方法需要經(jīng)過人工分離和培養(yǎng)、生化鑒定等煩瑣步驟，存在檢驗(yàn)周期長(zhǎng)、靈敏度低、勞動(dòng)強(qiáng)度大等問題，并極易出現(xiàn)假陰性，一旦遇到突發(fā)性公共衛(wèi)生事件，便很難滿足及時(shí)、準(zhǔn)確、靈敏性和特異性高的需求[2]。

1.2 快速檢測(cè)方法

為適應(yīng)食源性致細(xì)菌的快速測(cè)定要求，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)和生物傳感器檢測(cè)技術(shù)等多種檢測(cè)技術(shù)被綜合運(yùn)用[3-4]。

1.2.1 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)原理是通過抗原?抗體特異性結(jié)合，將致病菌的表面抗原及產(chǎn)生的一些毒素當(dāng)作關(guān)鍵檢驗(yàn)?zāi)繕?biāo)[5]?，F(xiàn)有的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)包含酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、免疫熒光標(biāo)記技術(shù)等。免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)雖操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、樣品處理量大，但抗體制備成本高、周期長(zhǎng)、難度大[6]。

1.2.2 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)以核酸、蛋白、酶等類型的生物大分子作為研究目標(biāo)， 包含聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、生物芯片技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)等[7]。分子生物學(xué)技術(shù)特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，但易出現(xiàn)假陽性。

1.2.3 代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)

代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)是基于微生物生長(zhǎng)代謝，并監(jiān)測(cè)其整個(gè)生長(zhǎng)過程中的底物、代謝產(chǎn)物的變化特征，旨在分析給定樣品某一時(shí)刻細(xì)胞內(nèi)外所有小分子代謝物的集合[8-9]。代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)在食品科學(xué)中剛剛興起，在把控原料和成品質(zhì)量、生產(chǎn)和安全方面作用較大[10]。

1.2.4 生物傳感器檢測(cè)技術(shù)

生物傳感器是一種新型裝置，它包含一個(gè)生物受體，可以專門識(shí)別和捕獲目標(biāo)分析物，一個(gè)物理或化學(xué)換能器，可將生物或化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)換為可量化和可分析的信號(hào)[11]。其工作原理是生物受體與待測(cè)目標(biāo)物發(fā)生反應(yīng)生成信號(hào)，經(jīng)由能量轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)化成可量化分析的光、電等信號(hào)，再將其信號(hào)放大輸出，從而獲得目標(biāo)分析物的數(shù)據(jù)信息。生物傳感器包含光學(xué)生物傳感器、表面等離子體共振生物傳感器、微生物代謝生物傳感器、壓電生物傳感器、細(xì)胞生物傳感器、電化學(xué)生物傳感器、免疫傳感器、核酸生物傳感器、阻抗和電導(dǎo)生物傳感器等[12]。生物傳感器檢測(cè)技術(shù)特異性和靈敏度高，但制作周期長(zhǎng)，受樣品基質(zhì)的影響較大，故需進(jìn)一步改進(jìn)[13]。

1.2.5 核酸適配體檢測(cè)技術(shù)

核酸適配體是單鏈的DNA 或者RNA 配體，它可通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（以下簡(jiǎn)稱SELEX技術(shù)）來完成篩選，核酸適配體具有內(nèi)部結(jié)構(gòu)靈活性、親和力大、體量小、易修飾、反應(yīng)速度快和熱穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)[14]。這些優(yōu)點(diǎn)使核酸適配體在病原體檢測(cè)和生物分子篩選等方面得到了廣泛應(yīng)用[15]。

核酸適配體識(shí)別元件親和力較高、特異性強(qiáng)，是抗體的優(yōu)質(zhì)替代選擇，近年來，基于核酸適配體構(gòu)建的生物傳感器越來越多地被開發(fā)使用在食物源致病菌檢測(cè)工作中。

2 核酸適配體篩選及核酸適配體傳感器應(yīng)用

2.1 核酸適配體篩選技術(shù)

常規(guī)SELEX 技術(shù)由多個(gè)循環(huán)組成，包括4 個(gè)階段：①體外合成DNA 或RNA 文庫；②與目標(biāo)孵育；③分離未連接的核酸序列，并使用目標(biāo)分子的溶液去除未結(jié)合部分；④PCR 擴(kuò)增結(jié)合序列[16]。然而常規(guī)SELEX技術(shù)獲得的核酸適配體存在序列長(zhǎng)、親和力低的問題，需經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化才能實(shí)際應(yīng)用。

為使核酸適配體能更有效地被應(yīng)用在檢測(cè)中，研究人員針對(duì)食源性致病菌的SELEX 技術(shù)持續(xù)開發(fā)，其中包含Capture-SELEX、全細(xì)胞SELEX、氧化石墨烯SELEX、石英晶體微量天平SELEX、磁珠SELEX、毛細(xì)管電泳SELEX、微陣列芯片SELEX 和基因組SELEX 技術(shù)等[17]。

STOLTENBURG R 等[18] 研究了一種將靶標(biāo)與磁珠結(jié)合來選擇熒光標(biāo)記適配體的方法，推動(dòng)了Capture-SELEX 技術(shù)發(fā)展。Capture-SELEX 技術(shù)是一種針對(duì)自然狀態(tài)靶點(diǎn)尤其是小分子靶點(diǎn)的技術(shù)，用于選擇針對(duì)小分子的 DNA 和 RNA 適配體，但易導(dǎo)致部分假陽性，降低篩選效率，增加篩選難度[19]。SUH S H 等[20] 使用全細(xì)胞SELEX 技術(shù)靶向不同生長(zhǎng)階段的單核細(xì)胞增多性乳桿菌細(xì)胞，使用順序結(jié)合分析確定不同的靶結(jié)合位點(diǎn)，用共聚焦顯微鏡確認(rèn)適配體與細(xì)胞表面的結(jié)合，篩選出4 個(gè)對(duì)李斯特氏菌具有高結(jié)合親和力的適配體。表1 列舉了各類細(xì)胞SELEX 技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)[21]。SONGShixi 等[22] 采用功能化的氧化石墨烯和等溫滾環(huán)擴(kuò)增開發(fā)了一種先進(jìn)的細(xì)胞SELEX 技術(shù)，篩選針對(duì)食源性病原體副溶血性弧菌的適配體，獲得的適配體對(duì)副溶血性弧菌的親和力均gt;75%。WANG Lijun 等[23] 利用石英晶體微量天平篩選抗鼠傷寒沙門菌的適配體，篩選出的適配體具備較高的特異性和結(jié)合親和力，解離常數(shù)58.5 nM。HONG Shaoli 等[24] 利用磁性納米球（magnetic nanospheres，MNs）圖案化芯片開發(fā)了多功能篩選平臺(tái)，僅通過兩輪選擇就獲得了Kd 值22 nM 的特異性適配體。微流控細(xì)胞SELEX 技術(shù)的應(yīng)用具有速度快、成本低、省力等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)適配體選擇的發(fā)展具有重要意義，然而微流控細(xì)胞SELEX 技術(shù)因獲得所需適配體的成功率低，未能在一般生物實(shí)驗(yàn)室或臨床應(yīng)用中得到廣泛利用。

2.2 核酸適配體傳感器在食源性致病菌檢測(cè)中應(yīng)用

核酸適配體傳感器以適配體作為識(shí)別元件，用于識(shí)別目標(biāo)物質(zhì)，將識(shí)別結(jié)果轉(zhuǎn)化為可被測(cè)量的信號(hào)。其信號(hào)轉(zhuǎn)換可以是電化學(xué)、光學(xué)、溫度、壓電、磁和微機(jī)械或上述多種技術(shù)的組合[25]。

2.2.1 電化學(xué)適配體傳感器

電化學(xué)適配體傳感器是由換能元件（電極），將識(shí)別到的目標(biāo)物在電極表面進(jìn)行特異性雜交，然后將雜交的信息變?yōu)殡娦盘?hào)輸出，并將其轉(zhuǎn)換成可測(cè)量信號(hào)[26]。PARK Y M 等[27] 采用軟/光刻和金屬蒸發(fā)的方法制備了納米柱電極，該電極高度有序并對(duì)食源性大腸桿菌O157∶H7 的擴(kuò)增基因具有良好而穩(wěn)定的電化學(xué)檢測(cè)性能。LUO Caihui 等[28] 將大腸桿菌O111 適配體固定在金電極上，通過金?硫醇結(jié)合將探針固定于電極表面上，研制了一種基于靶標(biāo)誘導(dǎo)適配體置換的電化學(xué)生物傳感器， 可在3.5 h 內(nèi)完成牛奶中大腸桿菌O111 的檢測(cè)。電化學(xué)生物傳感器工作示意如圖1 所示[28]。

2.2.2 比色適配體傳感器

比色法因其變色明顯、讀取速度快等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)中[29]。TAROKH A 等[30] 研發(fā)了針對(duì)鼠傷寒沙門菌檢測(cè)的一種新式比色傳感器，傳感器采用石墨化碳納米片（g-C3N4）和氧化銅（Cu2O）納米晶體的復(fù)合材料制備，在15～150 000 CFU/mL 范圍內(nèi)具有較好響應(yīng)，檢出限15 CFU/mL。YANG Tao 等[31]利用功能化金納米顆粒和多壁碳納米管研制了一種搭載于智能手機(jī)的比色適配體傳感器，用于監(jiān)測(cè)牛奶中的大腸桿菌O157∶H7；顯色結(jié)果可直接利用智能手機(jī)的比色裝置進(jìn)行分析，傳感器重現(xiàn)性好，對(duì)其他細(xì)菌無交叉反應(yīng)；純培養(yǎng)可檢出O157∶H7 大腸桿菌濃度8 430 CFU/mL，人為污染牛奶培養(yǎng)1 h 可檢出O157∶H7大腸桿菌濃度524 CFU/mL。

2.2.3 熒光適配體傳感器

熒光適配體傳感器以適配體為識(shí)別元件，以熒光分析方法為信號(hào)轉(zhuǎn)換方式，為目標(biāo)物檢測(cè)提供了新方法[32]。WU Zhengzong [33] 利用鉑包覆金納米棒（AuNR@Pt）的多功能特性，開發(fā)了一種基于內(nèi)濾效應(yīng)和顏色變化策略的雙模適應(yīng)性傳感器，并將其應(yīng)用于副溶血性弧菌檢測(cè)，在50～10 000 000 CFU/mL 和100～1 000 000 CFU/mL 范圍內(nèi)，副溶血性弧菌與熒光信號(hào)強(qiáng)度和顏色信號(hào)強(qiáng)度均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。CHEN Min 等[34] 開發(fā)了一種磁性納米Fe3O4 修飾的氧化石墨烯（MNPs@GO）和適配體功能化上轉(zhuǎn)化納米顆粒（UCNPs）的方法來檢測(cè)金黃色葡萄球菌。當(dāng)金黃色葡萄球菌出現(xiàn)時(shí)，MNPs@GO被裂解，氧化石墨烯沒有被磁分離，這致使熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從適配體功能化的UCNP 供體到氧化石墨烯受體在547 nm 處的上轉(zhuǎn)化熒光強(qiáng)度降低，最小檢出濃度達(dá)13 CFU/mL。WUWei 等[35] 將帶有熒光標(biāo)記的腸炎沙門氏菌的特異性適配體吸附到氧化石墨烯中，當(dāng)存在腸炎沙門氏菌時(shí)，適配體自氧化石墨烯中釋放出來，從而顯著恢復(fù)熒光，該適配體傳感器可在30 min 內(nèi)檢測(cè)到低至40 CFU/mL的腸炎沙門氏菌，能夠滿足多重檢測(cè)的要求。

2.2.4 表面等離子體共振適配體傳感器

表面等離子體共振（surface plasma resonance，SPR）傳感器的工作原理為病原體與金屬表面結(jié)合引起共振向波長(zhǎng)更大處轉(zhuǎn)移，移動(dòng)量的大小對(duì)應(yīng)著結(jié)合的毒素或者病原體的濃度大小。開始研究人員將抗體固定在薄薄的金膜上，以捕獲各種病原體，在某些波長(zhǎng)和近紅外區(qū)域，金屬中的電子云和光相互作用產(chǎn)生了強(qiáng)烈的共振[12]。由于適配體跟抗體相比具有更好的穩(wěn)定性、特異性和更小尺寸，逐漸被應(yīng)用到SPR 傳感器中。AHN J Y 等[36] 采用全菌SELEX 技術(shù)策略分離抗副溶血性弧菌的特異性ssDNA 適配體，通過鏈霉親和素偶聯(lián)方法連接生物素化的適配體，并對(duì)基于適配體的SPR 生物傳感器進(jìn)行不同的測(cè)試，其制備的基于適配體的SPR 生物傳感器平臺(tái)具有較高的特異性，可以較好地區(qū)分副溶血性菌。LEI Pinhua 等[37] 將鏈霉親和素標(biāo)記的適配體（SA-適配體）作為信號(hào)放大單元，并將改進(jìn)的不對(duì)稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法結(jié)合到SPR 傳感器芯片的表面。該傳感器高靈敏、選擇性好、穩(wěn)定，在最佳條件下，其檢測(cè)下限為20 pM（對(duì)于合成目標(biāo)序列）。目前SPR 傳感器已成功應(yīng)用于沙門氏菌的檢測(cè)，最小檢出濃度可達(dá)60 CFU/mL。

2.2.5 化學(xué)發(fā)光適配體傳感器

化學(xué)發(fā)光法（chemiluminiscence，CL）是指在不使用外部光源或光學(xué)元件的情況下，由化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光。CL 法具有高靈敏度、檢出限小、線性動(dòng)態(tài)范圍廣、成本低和快速等優(yōu)點(diǎn)[38]。CUI Liwei 等[39] 研制了一種基于二茂鐵標(biāo)記的分子信號(hào)適配體（FC-MBA）固態(tài)電化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器開關(guān)系統(tǒng)，用于李斯特氏菌的快速檢測(cè)。該傳感器由ECL 襯底和ECL 強(qiáng)度開關(guān)組成，將金納米顆粒（AuNPs）與Ru（II）三聯(lián)吡啶的絡(luò)合物修飾到金電極上形成電化學(xué)發(fā)光襯底，并用FC 標(biāo)記的MBA 作為電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度開關(guān)。該方法檢出限5 CFU/mL，回收率98.1%～103.6%。

2.2.6 側(cè)向流傳感器

側(cè)向流動(dòng)檢測(cè)作為一種觀察點(diǎn)檢測(cè)手段，因其低成本、易操作、反應(yīng)快和需樣量少等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注。LU Chunxia 等[40] 建立了一種基于適配體的側(cè)向流動(dòng)試驗(yàn)條，用于同時(shí)檢測(cè)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7 和鼠傷寒沙門氏菌，試驗(yàn)采用三明治的形式，將與金納米顆粒結(jié)合的一級(jí)適配體作為信號(hào)探針，二級(jí)適配體包被的膜作為捕獲探針，在最佳試驗(yàn)條件下，對(duì)鼠傷寒桿菌、大腸桿菌O157∶H7 和金黃色葡萄球菌的視覺最低檢出濃度分別為1 000、10 000 和10 000CFU/mL，所有的測(cè)量均可在10 min 內(nèi)完成。RASTOGIS K 等[41] 開發(fā)了一種橫向流動(dòng)試驗(yàn)條帶法，能夠靈敏地檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7 特異性DNA，用修飾的寡核苷酸結(jié)合金納米粒子制備探針，輔以信號(hào)放大方法，最小可檢測(cè)濃度可達(dá)0.4 nM。側(cè)向流動(dòng)試驗(yàn)條已成為食源性致病菌的熱門檢測(cè)手段。

2.2.7 SERS 技術(shù)傳感器

表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface-enhanced ramanspectroscopy，SERS）技術(shù)利用分子振動(dòng)產(chǎn)生的光譜來對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)，其對(duì)樣品不會(huì)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的影響，損害較小。CHENG Siyun 等[42] 基于SERS 技術(shù)，將小麥胚芽凝集素（Wheat germ agglutinin，WGA）修飾到Fe3O4@Au 磁性納米顆粒（MNPs）上，利用WGA 和核酸適體的雙重識(shí)別模式制備了可同時(shí)檢測(cè)兩種高致病菌金黃色葡萄球菌（S.aureus）和單核增生李斯特菌（L.mono）的傳感器。在15 min 內(nèi)高效捕獲復(fù)雜樣品中的金黃色葡萄球菌和單乳桿菌，檢測(cè)靈敏度高達(dá)6 cells/mL。ZHAO Wenshi 等[43] 基于Fe3O4@Au 納米復(fù)合材料（NCs）的適配體（Apt）生物傳感器，用于對(duì)致病細(xì)菌的捕獲、SERS 技術(shù)檢測(cè)和光熱治療（PTT），優(yōu)化后的Fe3O4@Au-Apt 適配體傳感器對(duì)金黃色葡萄球菌的最小檢出限25 CFU/mL，細(xì)胞捕獲效率（CCE）高達(dá)68%。

各類核酸適配體傳感器已經(jīng)被大量應(yīng)用于食源性致病菌的檢測(cè)中，不同的傳感器技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，表2列舉了常見食源性致病菌的檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例，可根據(jù)檢測(cè)樣品種類及試驗(yàn)環(huán)境選擇最佳方法。

3 結(jié)束語

核酸適配體具有三維結(jié)構(gòu)，可特異性地跟目標(biāo)分子相結(jié)合，其在高溫下更穩(wěn)定，可經(jīng)過多種技術(shù)融合的SELEX 技術(shù)篩選，易進(jìn)行化學(xué)修飾，以便用于體外檢測(cè)。核酸適配體可以結(jié)合多種靶標(biāo)，并且具有高度的敏感性和特異性。目前，篩選出的核酸適配體種類繁多，沒有統(tǒng)一規(guī)范，核酸適配體傳感器難以批量生產(chǎn)，篩選出待測(cè)目標(biāo)物普遍適用的核酸適配體可有效解決此類問題。核酸適配體傳感器融合了電化學(xué)、比色法、熒光和SERS 等多種技術(shù)，近年來對(duì)用于修飾適配體的新型納米材料及傳感器載體的研究逐漸深入，核酸適配體傳感器在向微流控、集成化、可視化和多重檢測(cè)方向發(fā)展，有些傳感器更是可與智能存儲(chǔ)設(shè)備如手機(jī)、U 盤、電腦等連接，可更直觀地反映樣品的檢測(cè)結(jié)果，克服了樣品基質(zhì)及檢測(cè)環(huán)境對(duì)適配體的影響，使食源性致病菌的檢測(cè)更加方便、快捷、高效。