潰瘍性結(jié)腸炎動(dòng)物模型構(gòu)建方法的研究進(jìn)展

田家華，索小濤，馬晨曦，鄭麗紅，王海強(qiáng)

1 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化二科，哈爾濱 150040；2 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第四醫(yī)院消化內(nèi)科

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，病理改變主要累及結(jié)腸或直腸的黏膜層和黏膜下層，臨床表現(xiàn)為黏液膿血便、間斷性腹瀉、腹痛、里急后重等。有研究表明，UC可增加自身免疫性肝病、結(jié)直腸癌、貧血等疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，并可引起焦慮、抑郁等精神心理疾病，給患者造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和巨大的心理壓力［1-3］。目前，UC的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，可能與腸道微生態(tài)失衡、自身免疫功能紊亂以及家族遺傳等因素有關(guān)［4］。UC診斷尚無金標(biāo)準(zhǔn)，主要結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、結(jié)腸鏡檢查及腸組織病理檢查等綜合分析。但UC 病程往往較長(zhǎng)，病情遷延難愈，緩解期與活動(dòng)期交替出現(xiàn)，病例收集和隨訪難度較大。UC動(dòng)物模型可模擬UC腸黏膜屏障損傷、腸道炎癥狀態(tài)及菌群紊亂情況。因此，通過構(gòu)建合理的動(dòng)物模型對(duì)揭示UC的發(fā)病機(jī)制、探索高效的治療策略至關(guān)重要。目前，UC動(dòng)物模型的構(gòu)建方法主要有誘導(dǎo)法、基因敲除法和聯(lián)合法，這些模型構(gòu)建方法各有利弊，應(yīng)根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)需求和實(shí)驗(yàn)條件選擇最適合的動(dòng)物模型。本文結(jié)合文獻(xiàn)就UC動(dòng)物模型構(gòu)建方法的研究進(jìn)展作一綜述。

1 誘導(dǎo)法構(gòu)建UC動(dòng)物模型

誘導(dǎo)法是UC 動(dòng)物模型最常見的建模方法，通常采取口服、灌胃、灌腸三種方式經(jīng)消化道給藥，部分化學(xué)藥物還可采取經(jīng)腹腔注射方式給藥。誘導(dǎo)法的成本相對(duì)較低，對(duì)實(shí)驗(yàn)室硬件要求較低，并且建模成功率較為理想。但誘導(dǎo)法對(duì)給藥時(shí)間、藥物濃度及動(dòng)物敏感性等要求較高，部分誘導(dǎo)藥物的毒性較強(qiáng)，易造成動(dòng)物死亡。根據(jù)誘導(dǎo)劑不同，誘導(dǎo)法可分為化學(xué)藥物誘導(dǎo)法、微生物誘導(dǎo)法和食物誘導(dǎo)法。誘導(dǎo)法UC 動(dòng)物模型的誘導(dǎo)藥物、給藥方式、常用動(dòng)物、建模周期及模型評(píng)價(jià)見表1。

表1 誘導(dǎo)法UC模型的誘導(dǎo)藥物、給藥方式、常用動(dòng)物、建模周期及模型評(píng)價(jià)

1.1 化學(xué)藥物誘導(dǎo)法 化學(xué)藥物誘導(dǎo)法是通過化學(xué)藥物、抗原或抗體制劑等破壞腸黏膜屏障并誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥，是最經(jīng)典且最常用的UC 動(dòng)物模型構(gòu)建方法。最常用的化學(xué)藥物為葡聚糖硫酸鈉（DSS），其次為三硝基苯磺酸（TNBS）和乙酸。此外，還有一些使用頻次較低的化學(xué)藥物，如二硝基苯胺磺酸（DNBS）、惡唑酮（OXA）、吲哚美辛等。通過DSS 構(gòu)建UC 動(dòng)物模型簡(jiǎn)單易行，成功率高，可重復(fù)性強(qiáng)，可模擬UC 急性和慢性炎癥過程。通過TNBS 構(gòu)建UC動(dòng)物模型，低劑量時(shí)炎癥維持時(shí)間較短且存在自愈傾向，而高劑量時(shí)則易引起動(dòng)物死亡。但該模型構(gòu)建方法可通過調(diào)整藥物劑量模擬UC 活動(dòng)期與緩解期交替的臨床狀態(tài)。乙酸構(gòu)建UC 動(dòng)物模型周期短，藥效持續(xù)時(shí)間有限，僅可誘導(dǎo)UC 急性炎癥過程。DNBS 的藥理特征與TNBS 類似，但需配合乙酸使用，建模較復(fù)雜，近年越來越少通過DNBS 構(gòu)建UC 動(dòng)物模型。OXA 與DNBS 同為半抗原，無法單獨(dú)應(yīng)用，需預(yù)先配合乙醇致敏，通過OXA 構(gòu)建UC 動(dòng)物模型亦逐年減少。吲哚美辛可抑制腸黏膜中前列腺素合成，進(jìn)而損傷腸黏膜屏障，但該藥制備時(shí)操作繁瑣，并且損傷部位更趨向于小腸，近年已逐漸被棄用?；瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)法一般需要先將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于光照12 h/黑暗12 h交替、適宜的溫度和濕度環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，然后制備相應(yīng)濃度的化學(xué)藥物進(jìn)行口服、灌胃、灌腸或腹腔注射。根據(jù)模擬的臨床分期不同，化學(xué)藥物誘導(dǎo)法建模所需時(shí)間由1 周至數(shù)月不等［5］。各化學(xué)藥物的作用機(jī)制有所不同，DSS 和乙酸可直接作用于消化道黏膜層及黏膜下層，通過破壞消化道物理屏障的緊密連接結(jié)構(gòu)，為致病菌鞭毛、脂多糖等有毒物質(zhì)侵襲結(jié)腸組織創(chuàng)造條件，還可影響TNF-α、IL-6 分泌，進(jìn)而破壞炎癥因子平衡；TNBS、DNBS、OXA則作為抗原通過誘發(fā)免疫炎癥反應(yīng)，模擬UC 患者的腸組織病理變化；吲哚美辛是一種非甾體抗炎藥，可抑制維持腸黏膜屏障的前列腺素分泌，進(jìn)而造成腸黏膜屏障破壞和腸道炎癥?；瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)法的適用范圍較廣，既可用于免疫相關(guān)性研究，又可用于腸黏膜屏障相關(guān)性研究?；瘜W(xué)藥物誘導(dǎo)法的建模動(dòng)物包括小鼠、大鼠、犬、家兔等，建模難度較低，建模成功率高，但由于其主要通過消化道給藥，能夠直接破壞腸黏膜屏障并誘發(fā)免疫應(yīng)答，部分藥物可能還會(huì)誘發(fā)腸外癥狀，如TNBS 對(duì)皮下組織的腐蝕性較強(qiáng)，可影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。盡管目前已有學(xué)者提出了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用藥劑量換算公式，但在實(shí)際應(yīng)用中，化學(xué)藥物誘導(dǎo)法構(gòu)建UC 動(dòng)物模型過程中仍存在用藥劑量混亂情況，從而對(duì)模型構(gòu)建成功率造成一定影響。

1.2 微生物誘導(dǎo)法 腸道菌群是指腸道內(nèi)的微生物，對(duì)維持腸道正常功能具有重要作用［6］。正常情況下，腸道菌群可與宿主及外部環(huán)境建立起動(dòng)態(tài)平衡，一旦腸道菌群紊亂，即可引起宿主多種功能喪失，如黏膜屏障功能喪失、炎癥和免疫功能喪失等，從而誘發(fā)多種疾病［7］。當(dāng)前，腸道菌群與UC 發(fā)病的關(guān)系尚未完全明確，但普遍認(rèn)為益生菌作為優(yōu)勢(shì)菌群可抑制致病菌繁殖，同時(shí)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)維護(hù)腸黏膜屏障，避免腸道炎癥發(fā)生［8］。厚壁菌門及擬桿菌門的主要代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可為結(jié)腸上皮細(xì)胞提供60%～70%的能量，是維護(hù)腸黏膜屏障的重要能量來源。而梭狀芽孢菌、類桿菌等與UC 發(fā)生和病情加重密切相關(guān)，在UC 活動(dòng)期患者腸道中此類菌群豐度明顯增加［9-10］。微生物誘導(dǎo)法是通過灌胃或灌腸方式使致病菌定植于結(jié)腸處，從而誘發(fā)UC相關(guān)癥狀的模型構(gòu)建方法。微生物誘導(dǎo)法包括從UC 患者糞便中提取致病菌移植誘導(dǎo)和使用單一菌株移植誘導(dǎo)兩種。微生物誘導(dǎo)法普遍適用于各類實(shí)驗(yàn)鼠，可模擬UC 患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)。學(xué)者們大多選擇移植UC患者腸道菌群來構(gòu)建其動(dòng)物模型，建模成功率較高，但出現(xiàn)動(dòng)物死亡的概率較大，而單一菌株移植建模成功率尚不確定［11］。微生物誘導(dǎo)法構(gòu)建UC 動(dòng)物模型存在較大的不確定性，難以明確誘發(fā)UC的具體菌屬，故該建模方法有待于進(jìn)一步優(yōu)化。

1.3 食物誘導(dǎo)法 特定的飲食習(xí)慣與UC 發(fā)生有一定相關(guān)性。有研究認(rèn)為，膳食纖維攝入減少和肉類、蛋類以及乳制品類食物攝入增多是當(dāng)前UC發(fā)病率不斷增長(zhǎng)的主要原因［12-15］。食物誘導(dǎo)法是通過高糖高脂飲食和增加乙醇攝入量等誘導(dǎo)腸黏膜屏障損傷的UC 動(dòng)物模型構(gòu)建方法。THOMAS 等［16］使用麥芽糖混合豬油制作高脂飼料，小鼠自由進(jìn)食該高脂飼料6周，第6周末予3% DSS，成功構(gòu)建出UC動(dòng)物模型。LI等［17］每日將SD大鼠置于濕熱環(huán)境中6 h，實(shí)驗(yàn)全程予蜂蜜水、豬油喂養(yǎng)，從第3周起每日灌胃高度白酒，成功模擬出熱帶沿海人群的UC動(dòng)物模型。該方法構(gòu)建的UC動(dòng)物模型較貼近臨床實(shí)際情況，可探索飲食結(jié)構(gòu)與UC 發(fā)病的相關(guān)性。但由于飼養(yǎng)環(huán)境和特定食物制備等問題，該模型構(gòu)建方法主要適用于小型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如BALB/c 小鼠、C57BL/6 小鼠、Swiss小鼠。食物誘導(dǎo)法構(gòu)建UC 動(dòng)物模型的成功率較低，并且不能單獨(dú)構(gòu)建UC 動(dòng)物模型，通常需要聯(lián)合其他UC動(dòng)物模型構(gòu)建方法［12］。

2 基因敲除法構(gòu)建UC動(dòng)物模型

全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)了不少可能與UC 相關(guān)染色體上的易感區(qū)域及易感基因［18］?；蚯贸?0 世紀(jì)80 年代末發(fā)展起來的一種新型分子生物學(xué)技術(shù)，是使生物體基因組中的特定基因失活或失效的過程。近年來，修改實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特定基因片段以實(shí)現(xiàn)免疫應(yīng)答或屏障功能失常成為構(gòu)建UC 動(dòng)物模型的新手段?；蚯贸?gòu)建的動(dòng)物模型為進(jìn)一步探索基因異常所致自發(fā)性UC 的發(fā)病機(jī)制提供了可能。根據(jù)敲除基因不同，基因敲除法可分為屏障蛋白基因敲除法和抗炎因子基因敲除法。

2.1 屏障蛋白基因敲除法 在UC 發(fā)生、發(fā)展過程中，腸黏膜屏障結(jié)構(gòu)和功能的維持對(duì)機(jī)體免疫環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要［19］。屏障蛋白基因敲除法UC 動(dòng)物模型是通過敲除構(gòu)成結(jié)腸黏膜屏障的蛋白，以構(gòu)建自發(fā)性UC 動(dòng)物模型。腸黏膜屏障損傷后，其通透性增加，腸道細(xì)菌、內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)等可通過受損的腸黏膜屏障進(jìn)入內(nèi)環(huán)境，誘發(fā)和（或）加重炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致UC 的發(fā)生、發(fā)展?；蚯贸＿x擇的屏障蛋白包括帶狀閉合蛋白、咬合蛋白、閉合蛋白等，通過在靶基因中引入突變使其失去功能［20］?；蚯贸椒ㄓ型粗亟M、RNA 干擾和CRISPR/Cas9。CRISPR/Cas9 是最常用的基因編輯工具，它使用引導(dǎo)RNA 和Cas9 酶在基因組的特定位置引入靶向DNA 斷裂，從而導(dǎo)致基因破壞［21-22］。屏障蛋白基因敲除法構(gòu)建UC 動(dòng)物模型的成功率高，在實(shí)驗(yàn)過程中無自愈傾向，可完全模擬UC 的腸組織病理變化，并且損傷位置精準(zhǔn)可控，適用于針對(duì)閉鎖蛋白、Claudin 蛋白、膜周蛋白家族以及連接黏附分子等靶點(diǎn)的藥物研發(fā)，也是未來構(gòu)建UC 動(dòng)物模型的主流方法。屏障蛋白基因敲除法理論上適用于所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但由于基因工程技術(shù)難度大、成本高，該模型動(dòng)物主要為小鼠。

2.2 抗炎因子基因敲除法 腸道內(nèi)炎癥平衡被破壞是UC 的發(fā)病機(jī)制之一［23］?？寡滓蜃踊蚯贸贑RISPR/Cas9 基因技術(shù)平臺(tái)，通過內(nèi)切酶切割雙鏈DNA 導(dǎo)致切割位點(diǎn)移碼突變或片段缺失，造成基因沉默，功能喪失，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除［24］；這一步驟完成后，炎癥平衡被打破，促進(jìn)了炎癥反應(yīng)，從而成功構(gòu)建了UC 動(dòng)物模型［25］?？寡滓蜃踊蚯贸ㄊ荱C動(dòng)物模型中最適合研究發(fā)病機(jī)制的建模方法，同時(shí)也適用于自發(fā)性UC 高發(fā)人群的靶向藥物研發(fā)。與屏障蛋白基因敲除法類似，該模型動(dòng)物主要為小鼠，其原因一個(gè)是成本高，另一個(gè)是抗炎因子基因敲除后，炎癥平衡被破壞，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在死亡風(fēng)險(xiǎn)。

3 聯(lián)合法構(gòu)建UC動(dòng)物模型

聯(lián)合法采取兩種及以上方法構(gòu)建UC 動(dòng)物模型，常用于補(bǔ)充單一模型構(gòu)建方法模擬UC 腸組織病理狀態(tài)的不足。GE 等［11］通過化學(xué)藥物聯(lián)合微生物菌群構(gòu)建的小鼠UC 動(dòng)物模型，不僅能模擬腸道菌群失調(diào)狀態(tài)，還能模擬腸道炎癥狀態(tài)，此外還解決了單一菌株建模成功率較低的問題。張澤丹等［26］通過化學(xué)藥物聯(lián)合特殊飲食并模擬特殊環(huán)境構(gòu)建的小鼠UC 模型，能夠模擬UC 患者真實(shí)的生活習(xí)慣，適用于特定地域或人群的UC 研究。聯(lián)合法構(gòu)建UC動(dòng)物模型對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品類要求較低，各品類實(shí)驗(yàn)鼠均可用于構(gòu)建UC 動(dòng)物模型。聯(lián)合法構(gòu)建UC 動(dòng)物模型的根本目的在于進(jìn)一步縮小實(shí)驗(yàn)室內(nèi)模擬環(huán)境和臨床實(shí)際的差異，可廣泛用于發(fā)病機(jī)制的研究，但聯(lián)合法并非多種模型構(gòu)建方法的簡(jiǎn)單堆砌，需要科學(xué)合理的前期設(shè)計(jì)。

綜上所述，UC是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，其確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。目前，UC診斷尚無金標(biāo)準(zhǔn)，主要結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、結(jié)腸鏡檢查及腸組織病理檢查等綜合分析。但UC病程往往較長(zhǎng)，病情遷延難愈，緩解期與活動(dòng)期交替出現(xiàn)，病例收集和隨訪難度較大。而UC動(dòng)物模型可模擬UC腸黏膜屏障損傷、腸道炎癥狀態(tài)及菌群紊亂情況。因此，通過構(gòu)建合理的動(dòng)物模型對(duì)揭示UC的發(fā)病機(jī)制、探索高效的治療策略至關(guān)重要。目前，UC動(dòng)物模型的構(gòu)建方法主要有誘導(dǎo)法、基因敲除法和聯(lián)合法。這些模型構(gòu)建方法各有利弊，應(yīng)根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)需求和實(shí)驗(yàn)條件選擇最適合的動(dòng)物模型。