半胱天冬酶3靶向分子影像探針在腫瘤細(xì)胞凋亡監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展

奚鴻杰，華迪，蔡舒玥，謝佺，邱玲，林建國(guó)

1 南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南京 211166；2 江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所

惡性腫瘤是嚴(yán)重威脅我國(guó)居民健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。正常情況下，生物體內(nèi)的細(xì)胞增殖和凋亡維持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)［1-2］。細(xì)胞增殖失控或凋亡受阻可導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，而通過(guò)調(diào)控信號(hào)通路或相關(guān)蛋白表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是許多抗腫瘤藥物的主要作用機(jī)制之一［3-5］。然而，傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡檢測(cè)或評(píng)價(jià)方法，如TUNEL 法和腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，存在操作流程繁瑣、醫(yī)生主觀判斷差異、各種原因所致假陽(yáng)性結(jié)果等局限性，有可能使患者錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)機(jī)［6］。因此，早期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)細(xì)胞凋亡對(duì)惡性腫瘤治療效果評(píng)估以及指導(dǎo)后續(xù)治療具有重要意義。分子影像是一種新興的無(wú)創(chuàng)顯像技術(shù)，能夠可視化單個(gè)分子或特定細(xì)胞亞群，從而反映活體狀態(tài)下分子水平變化。常用的分子影像技術(shù)，如近紅外熒光顯像具有靈敏度高、響應(yīng)速度快的特點(diǎn)，正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像（PET）具有靈敏度高、組織穿透力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，如今已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究以及藥物研制等領(lǐng)域［7-8］。半胱天冬酶3（Caspase-3）是細(xì)胞凋亡的半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中至關(guān)重要的死亡執(zhí)行蛋白酶，能夠啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)蛋白的特異性降解，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶［9-10］。因此，設(shè)計(jì)靶向Caspase-3 的分子影像探針，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)治療過(guò)程中腫瘤部位Caspase-3表達(dá)，精準(zhǔn)評(píng)估治療效果，從而為個(gè)體化治療提供可靠依據(jù)。本文結(jié)合文獻(xiàn)就Caspase-3 分子影像探針在腫瘤細(xì)胞凋亡監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 Caspase-3分子影像探針概述

Caspase-3 是細(xì)胞凋亡的半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中至關(guān)重要的死亡執(zhí)行蛋白酶，主要由細(xì)胞應(yīng)激引起的內(nèi)源性途徑和細(xì)胞外信號(hào)誘導(dǎo)的外源性途徑激活?；罨腃aspase-3可通過(guò)酶解凋亡抑制物、細(xì)胞外基質(zhì)及骨架蛋白和裂解DNA 修復(fù)相關(guān)分子的方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［9］。因此，Caspase-3 可作為重要的分子靶點(diǎn)用于細(xì)胞凋亡顯像，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)治療效果的實(shí)時(shí)評(píng)估。

近年已設(shè)計(jì)出許多靶向Caspase-3 的分子影像探針，根據(jù)與Caspase-3 不同的作用方式，主要分為Caspase-3 抑制劑類和Caspase-3 多肽底物類分子影像探針，見(jiàn)表1。Caspase-3 抑制劑類分子影像探針能夠與Caspase-3 結(jié)合，通過(guò)顯像信號(hào)改變來(lái)檢測(cè)Caspase-3 活性，如［18F］ICMT-11、［123/125I］-FITI。Caspase-3 多肽底物類分子影像探針則是基于Caspase-3特異性識(shí)別多肽底物天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸（DEVD）設(shè)計(jì)的，能夠靶向凋亡細(xì)胞并被Caspase-3 剪切而釋放顯像信號(hào)，如Bio-DEVD-HCy、［18F］CP-18。

表1 Caspase-3分子影像探針類型、結(jié)構(gòu)及顯像方式

2 Caspase-3抑制劑類分子影像探針在腫瘤細(xì)胞凋亡監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

Caspase-3 抑制劑類分子影像探針具有靛紅磺胺、肽醛、N-亞硝基苯胺等基團(tuán)，其結(jié)構(gòu)中缺電子的羰基可與Caspase-3高親和性結(jié)合，隨后通過(guò)探針中標(biāo)記的放射性核素或熒光基團(tuán)進(jìn)行顯像［11］，通常用于檢測(cè)治療后Caspase-3表達(dá)。

2.1 ［18F］ICMT-11 ［18F］ICMT-11是在化合物靛紅磺酰胺的結(jié)構(gòu)上進(jìn)行修飾，左側(cè)引入苯基醚的氟取代基團(tuán)，在保持該化合物對(duì)Caspase-3高選擇性和高親和力的同時(shí)，提高其生物穩(wěn)定性。隨后，在其N-1側(cè)引入1，2，3-三唑并通過(guò)2-氟乙基疊氮化物在銅催化下發(fā)生環(huán)加成反應(yīng)，使用18F 進(jìn)行放射性標(biāo)記［12］。［18F］ICMT-11 具有較高的放射化學(xué)產(chǎn)率和代謝穩(wěn)定性，可與高表達(dá)的Caspase-3特異性結(jié)合并顯像凋亡的腫瘤細(xì)胞。有研究在纖維肉瘤細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞荷瘤小鼠中發(fā)現(xiàn)，［18F］ICMT-11 在體內(nèi)無(wú)脫氟現(xiàn)象，可從心臟和未經(jīng)治療的腫瘤組織中迅速清除；在分別使用順鉑和多西環(huán)素治療后，荷瘤小鼠腫瘤組織能夠觀察到清晰的PET 顯像信號(hào)，并且Caspase-3表達(dá)和對(duì)探針的攝取顯著升高［13］。與目前已應(yīng)用于臨床的［18F］FDG 相比，在治療6 h 后就可通過(guò)注射［18F］ICMT-11 進(jìn)行PET 顯像，觀察Caspase-3 表達(dá)，能夠較早地驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞凋亡，表明該探針在臨床檢測(cè)Caspase-3 和療效評(píng)估方面具有巨大潛力。此外，注射［18F］ICMT-11 后未觀察到明顯的不良反應(yīng)［14］，表明該探針具有一定的安全性和良好的耐受性。然而，該探針肝臟和腸道的攝取較高，導(dǎo)致腹部具有高背景信號(hào)，并且在治療過(guò)程中可能受腫瘤組織壞死、對(duì)治療反應(yīng)的異質(zhì)性、Caspase-3 表達(dá)低等因素影響，導(dǎo)致對(duì)探針的攝取減少［15］，但該探針在無(wú)創(chuàng)顯像方面仍具有巨大潛力。

2.2 ［123/125I］-FITI 有研究對(duì)ICMT-11 的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化，在三唑環(huán)上引入一個(gè)碘取代基團(tuán)，開(kāi)發(fā)了ICMT-11 的5-碘-1，2，3-三唑衍生物FITI。在成功合成探針前體FITI 后，使用鄰菲羅啉作為螯合劑成功標(biāo)記獲得［123/125I］-FITI。［123/125I］-FITI 通過(guò)引入高極性物質(zhì)1，2，3-三唑類化合物，使N-烷基化取代基與Caspase-3的S1結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用，提高了探針與Caspase-3的親和力，從而達(dá)到更好的顯像效果［16］。

［123/125I］-FITI 的抑制常數(shù)Ki 為（6.1±0.9） nM，略低于ICMT-11［（12.4±4.7） nM］，表明該探針與底物結(jié)合較緊密，對(duì)Caspase-3的親和力較高。隨后有研究選用人結(jié)腸癌細(xì)胞SW1222 構(gòu)建了荷瘤小鼠模型，給予依托泊苷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并通過(guò)SPECT/CT顯像進(jìn)行體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，注射依托泊苷的荷瘤小鼠腫瘤組織對(duì)［123/125I］-FITI 的攝取有所提高；但與［18F］ICMT-11類似，該探針在腹部攝取較高，而在腫瘤組織總攝取較低，體內(nèi)降解和代謝較快，SPECT/CT顯像效果并不理想［17］。因此，提高腫瘤組織攝取和降低代謝速率是提高Caspase-3 抑制劑類分子影像探針顯像的關(guān)鍵。

3 Caspase-3多肽底物類分子影像探針在腫瘤細(xì)胞凋亡監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用

Caspase-3 多肽底物類分子影像探針是基于Caspase-3 可識(shí)別四肽底物DEVD 設(shè)計(jì)的，將其與相應(yīng)的顯像和修飾基團(tuán)相連，能夠增強(qiáng)此類探針對(duì)Caspase-3 的靶向性和特異性，從而增強(qiáng)顯像效果［18］。此類探針進(jìn)入凋亡細(xì)胞后，Caspase-3 特異性識(shí)別并切割底物序列，隨后剪切產(chǎn)物釋放顯像信號(hào)。相較于Caspase-3 抑制劑類分子影像探針，Caspase-3 多肽底物類分子影像探針不易受治療早期腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)的Caspase-3影響，能夠更好地顯示細(xì)胞凋亡進(jìn)程，進(jìn)而指導(dǎo)治療效果的早期評(píng)估。

3.1 Ac-Tat-DEVD-CV Ac-Tat-DEVD-CV 是由Caspase-3 底物DEVD、細(xì)胞穿透肽及熒光基團(tuán)甲酚紫組成的近紅外熒光分子探針。該探針在細(xì)胞穿透肽協(xié)助下進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，肽-甲酚紫共軛結(jié)構(gòu)在582 nm 處顯示發(fā)射峰，經(jīng)Caspase-3 裂解多肽底物后，迅速釋放肽-甲酚紫共軛結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致582 nm 處熒光強(qiáng)度降低、628 nm 處熒光強(qiáng)度增加，從而增強(qiáng)可探測(cè)的熒光強(qiáng)度［19］。將該探針與其他內(nèi)源性物質(zhì)（如生物小分子、蛋白質(zhì)）孵育一定時(shí)間后，不會(huì)導(dǎo)致熒光比率增加，表明該探針對(duì)Caspase-3具有選擇特異性。在使用星形孢菌素誘導(dǎo)宮頸癌HeLa 細(xì)胞凋亡后，通過(guò)Ac-Tat-DEVD-CV進(jìn)行細(xì)胞顯像及光譜分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)星形孢菌素處理的HeLa細(xì)胞在628 nm處出現(xiàn)了新的發(fā)射峰；雖然在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中，HeLa 細(xì)胞在582、628 nm 處的熒光強(qiáng)度均降低，但其熒光比率仍有所提升；隨著共孵育時(shí)間延長(zhǎng)，HeLa 細(xì)胞中Caspase-3 表達(dá)和熒光比率均逐漸升高，當(dāng)加入Caspase-3 抑制劑后則明顯降低［19］，二者呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。因此，Ac-Tat-DEVD-CV在指示細(xì)胞凋亡程度方面展現(xiàn)出了優(yōu)越的性能，有望在小鼠體內(nèi)進(jìn)一步進(jìn)行顯像研究。

3.2 Bio-DEVD-HCy 靶向Caspase-3 的小分子熒光/光聲（FL/PA）雙模態(tài)探針Bio-DEVD-HCy，能夠?qū)晒怙@像的高靈敏度與光聲顯像的高空間分辨率及高穿透性相結(jié)合，從而提供更全面的凋亡顯像信息。Bio-DEVD-HCy由靶向腫瘤的生物素、Caspase-3識(shí)別底物DEVD 及半花菁染料HCy組成。該探針可與腫瘤凋亡細(xì)胞表面高度表達(dá)的生物素受體結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞后濃聚，被Caspase-3 識(shí)別剪切后，生成帶有游離氨基的HCy，進(jìn)而發(fā)出強(qiáng)烈的FL/PA 信號(hào)。該探針在Caspase-3 工作緩沖液中孵育后，F(xiàn)L/PA 信號(hào)強(qiáng)度隨著Caspase-3濃度增加呈線性升高，具有較高的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并且不易被體內(nèi)物質(zhì)干擾，對(duì)Caspase-3具有良好的選擇性。有研究在4T1荷瘤小鼠尾靜脈注射阿霉素（Dox），隨后注射Bio-DEVD-HCy進(jìn)行顯像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)L/PA 信號(hào)強(qiáng)度在注射4 h 后達(dá)到最大值，加入生物素阻斷劑后，F(xiàn)L/PA信號(hào)強(qiáng)度有所降低［20］。因此，Bio-DEVD-HCy 可通過(guò)靶向生物素更好地進(jìn)入腫瘤凋亡細(xì)胞并濃聚，從而放大FL/PA 信號(hào)，可視化腫瘤細(xì)胞中Caspase-3 表達(dá)，有望在臨床上轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

3.3 ［18F］-CP18 靶向Caspase-3 的PET 顯像探針［18F］-CP18 由三部分組成，即多肽底物DEVD、用于增強(qiáng)腎清除能力的半乳糖基團(tuán)以及用于促進(jìn)細(xì)胞攝取及改善藥代動(dòng)力學(xué)的C 末端聚乙二醇鏈，并通過(guò)銅催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(yīng)進(jìn)行放射性核素18F 標(biāo)記。當(dāng)探針進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后被活化的Caspase-3裂解，聚乙二醇鏈斷裂導(dǎo)致其余分子的親水性降低，從而在細(xì)胞中濃聚，繼而增加信號(hào)強(qiáng)度［21］。該探針與21 種蛋白酶共孵育后，只有Caspase-3 能夠使其顯著裂解，表明該探針對(duì)Caspase-3具有靶向特異性。通過(guò)不同腫瘤細(xì)胞系荷瘤小鼠體內(nèi)顯像研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)5-氟尿嘧啶或地塞米松治療后，荷瘤小鼠的腫瘤組織對(duì)［18F］-CP18 均能顯著攝?。?2］。RAPIC等［23］研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌細(xì)胞荷瘤小鼠在經(jīng)5-氟尿嘧啶或伊立替康治療后，［18F］-CP18 在腫瘤部位的攝取略有升高，兩者聯(lián)合治療后腫瘤細(xì)胞Caspase-3表達(dá)上調(diào)，在腫瘤部位則顯示出更高的攝取。此外，［18F］-CP18 主要通過(guò)腎臟清除，代謝較快，腫瘤背景較低。這些研究表明，［18F］-CP18 在腫瘤治療效果監(jiān)測(cè)方面具有較高的應(yīng)用價(jià)值。然而，［18F］-CP18在體內(nèi)血液循環(huán)時(shí)間較短，組織代謝快且易受背景干擾，無(wú)法得到持久且清晰的顯像信息。

3.4 ［18F］-C-SNAT及［18F］SF-DEVD ［18F］-C-SNAT是基于CBT-Cys 的點(diǎn)擊縮合反應(yīng)，通過(guò)兩步法進(jìn)行18F 放射性標(biāo)記，得到的新型智能自組裝PET 分子探針。［18F］-C-SNAT 在進(jìn)入腫瘤凋亡細(xì)胞后，多肽底物DEVD 被Caspase-3 識(shí)別并剪切，而在腫瘤微環(huán)境中存在的谷胱甘肽可將二硫鍵還原為巰基，隨后通過(guò)CBT-Cys 的點(diǎn)擊縮合反應(yīng)進(jìn)行分子內(nèi)環(huán)化，環(huán)狀探針通過(guò)疏水相互作用形成納米顆粒，在腫瘤細(xì)胞中濃聚，從而延長(zhǎng)滯留時(shí)間［24］。有研究在經(jīng)Dox 治療的宮頸癌HeLa 細(xì)胞荷瘤小鼠體內(nèi)PET 顯像研究中發(fā)現(xiàn)，［18F］-C-SNAT 能夠清晰顯像發(fā)生細(xì)胞凋亡的腫瘤部位，并且具有較高的腫瘤背景比。此外，［18F］-C-SNAT 在經(jīng)抗腫瘤治療的腫瘤組織積累量顯著增加，但耗散速率改變并不明顯。有研究對(duì)CBT-Cys 的點(diǎn)擊縮合反應(yīng)中芳香腈與氨基硫醇構(gòu)效關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)，芳香環(huán)上的電子離域、吸電子基團(tuán)、雜原子以及氨基硫醇的親核性對(duì)點(diǎn)擊縮合反應(yīng)均有顯著影響［25］，這為該點(diǎn)擊縮合反應(yīng)的優(yōu)化提供了思路。然而，體內(nèi)高濃度內(nèi)源性游離半胱氨酸易與CBT 結(jié)構(gòu)中的巰基競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而影響該點(diǎn)擊縮合反應(yīng)。

自組裝PET分子探針［18F］SF-DEVD是將CBT-Cys的點(diǎn)擊縮合反應(yīng)中的環(huán)支架進(jìn)行改進(jìn)，引入了兩個(gè)長(zhǎng)度適當(dāng)?shù)钠S基以調(diào)節(jié)配體的長(zhǎng)度和芳香性，形成了一個(gè)新的生物正交反應(yīng)支架SF，在改善反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的同時(shí)，使其更易發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化，從而提高在體內(nèi)的原位自組裝效率，達(dá)到更理想的顯像效果［26］。有研究在宮頸癌HeLa 細(xì)胞荷瘤小鼠瘤內(nèi)注射Dox，評(píng)估了［18F］SF-DEVD 的PET 顯像能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射顯像60 min 后，該探針在荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡部位逐漸濃聚，PET顯像非常清晰；共注射冷化合物［19F］SF-DEVD 后，在腫瘤細(xì)胞凋亡部位顯示出更高的攝取和更強(qiáng)、更持久的放射性信號(hào)［27-28］。結(jié)果表明，［18F］SF-DEVD 可用于無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)、靈敏地監(jiān)測(cè)體內(nèi)Caspase-3活性，未來(lái)有望應(yīng)用于臨床研究。

3.5 ［18F］-IR780-1 將雙模態(tài)探針與原位自組裝策略相結(jié)合，設(shè)計(jì)并合成了小分子PA/PET 探針［18F］-IR780-1。［18F］-IR780-1 以三唑IR-780 為支架，引入了CHQ，Caspase-3 可切割底物DEVD，二硫鍵保護(hù)的D-Cys 以及用于18F 標(biāo)記的三氟硼酸鹽。［18F］-IR780-1 在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部濃聚形成納米顆粒，增強(qiáng)PET 顯像信號(hào)的同時(shí)，引起聚集熒光淬滅效應(yīng)，導(dǎo)致FL 信號(hào)減弱、PA 信號(hào)增強(qiáng)。因此，該探針通過(guò)PA和PET聯(lián)合顯像，具有PA顯像的高分辨率和PET顯像的高靈敏度優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)χ委熎陂g腫瘤組織中Caspase-3 活性進(jìn)行全面、準(zhǔn)確的顯像分析。與其他Caspase-3分子影像探針相比，［18F］-IR780-1具有更高的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并且只有Caspase-3能夠激活其PA信號(hào)，表明該探針對(duì)Caspase-3具有更高的靈敏度和選擇性。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該探針在復(fù)雜的生物相關(guān)環(huán)境中表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，可用于后續(xù)小鼠體內(nèi)顯像。有研究經(jīng)Dox 治療建立腦膠質(zhì)瘤U87MG 荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡模型，使用［18F］-IR780-1 進(jìn)行雙模態(tài)顯像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Dox治療后荷瘤小鼠腫瘤部位對(duì)［18F］-IR780-1 具有更高的攝取，產(chǎn)生更強(qiáng)的PA 和PET 信號(hào)；當(dāng)靜脈注射Caspase-3 抑制劑Z-VAD-FMK后，PA和PET信號(hào)顯著降低，表明兩者信號(hào)的增強(qiáng)主要是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞中Caspase-3 表達(dá)上調(diào)［29］。因此，［18F］-IR780-1 可通過(guò)放大PA 和PET 信號(hào)，顯像細(xì)胞凋亡，提供腫瘤組織Caspase-3活性和分布情況，對(duì)早期監(jiān)測(cè)腫瘤治療應(yīng)答具有重要意義。此外，該探針主要通過(guò)腎臟和肝臟清除，并且經(jīng)Dox治療后PET信號(hào)明顯增強(qiáng)［30］，推測(cè)可能與Dox的毒副作用有關(guān)。因此，［18F］-IR780-1 還可用于監(jiān)測(cè)藥物對(duì)器官的毒副作用。

綜上所述，分子影像是一種新興的無(wú)創(chuàng)顯像技術(shù)，能夠可視化單個(gè)分子或特定細(xì)胞亞群，從而反映活體狀態(tài)下分子水平變化。Caspase-3 是細(xì)胞凋亡的半胱天冬酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中至關(guān)重要的死亡執(zhí)行蛋白酶，能夠啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)蛋白的特異性降解，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。設(shè)計(jì)靶向Caspase-3的分子影像探針，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)治療過(guò)程中腫瘤部位Caspase-3表達(dá)，精準(zhǔn)評(píng)估治療效果，從而為個(gè)體化治療提供可靠依據(jù)。根據(jù)與Caspase-3不同的作用方式，Caspase-3分子影像探針主要分為Caspase-3抑制劑類和Caspase-3多肽底物類分子影像探針。這兩類探針對(duì)Caspase-3均具有良好的靶向特異性和選擇性，已成功應(yīng)用于實(shí)時(shí)顯像小鼠或人體治療早期的腫瘤細(xì)胞凋亡。但這些探針仍有一定不足，如靈敏度低、組織背景高、代謝速度快等，尚需進(jìn)一步優(yōu)化。