基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究甘草瀉心湯治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的作用機制

袁園，秦雷明，慶慧，崔偉鋒*

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（recurrent oral ulcer，ROU）是發(fā)病率很高的一種口腔黏膜類疾病，其發(fā)病率接近20%［1］，具有周期性、復(fù)發(fā)性以及自限性等特點。ROU 發(fā)病人群的年齡一般在10～30 歲之間，且患病的女性較多。ROU 的發(fā)病機制目前尚不清楚，其發(fā)生可能與遺傳、免疫、飲食、微生物、微量元素缺乏、維生素缺乏、精神心理等多種因素有關(guān)［2］，目前尚無特效治療方法［3］?，F(xiàn)階段，西醫(yī)的治療以補充維生素、服用抗菌藥物等手段為主，但是長期服用易損傷肝腎功能并產(chǎn)生耐藥性，而且容易復(fù)發(fā)，部分患者的治療效果不理想［4-5］。中醫(yī)學(xué)將ROU歸為“口瘡”“口瘍”“口糜”等范疇，《金匱要略》［6］稱之為“狐惑病”，記載為“狐惑之為病，狀如傷寒，默默欲眠，目不得閉，臥起不安，蝕于喉為惑，蝕于陰為狐，不欲飲食，惡聞食臭，其面目乍赤、乍黑、乍白。蝕于上部則聲喝，甘草瀉心湯主之”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為該癥多因胃熱脾寒引發(fā)口瘡，且外有熱象內(nèi)有虛寒，為寒熱錯雜之證［7］。臨床上應(yīng)用甘草瀉心湯治療ROU 已積累了豐富的臨床經(jīng)驗且療效良好，但其作用機制尚不明確?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法可構(gòu)建“疾病-藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)，并從整體觀察及分析中藥組方對疾病的影響。中醫(yī)在臨證組方配伍時遵循方證一體觀，突出方劑的整體性能，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法與中醫(yī)的整體觀相符。本研究將運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法和分子對接技術(shù)對甘草瀉心湯治療ROU 的作用機制進(jìn)行探究，為臨床和進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 甘草瀉心湯的主要成分及靶點的獲取

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫［8］中，將關(guān)鍵詞設(shè)置為“Herb name”并檢索 7 味中藥（半夏、黃連、黃芩、干姜、甘草、人參、大棗）的化學(xué)成分，根據(jù)口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 以及藥物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18 對成分進(jìn)行篩選，以獲得有效活性成分及其作用的蛋白質(zhì)靶點。

1.2 靶點名稱的標(biāo)準(zhǔn)化處理

在Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫［9］中輸入搜索到的蛋白質(zhì)靶點，將Status 設(shè)為“Reviewed”，Popular organisms 設(shè)為“Human”，把檢索到的靶點名稱轉(zhuǎn)化為Official Gene Symbol，以便后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

1.3 “中藥-活性成分-相關(guān)靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將檢索出的藥物成分和蛋白質(zhì)靶點合并整理后，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件繪制“中藥-活性成分-相關(guān)靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。將度值（degree）從大到小排列，排名前4 位的有效活性成分作為關(guān)鍵活性成分。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在GeneCards 數(shù)據(jù)庫［10］中以“recurrent oral ulcer”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，得到疾病靶點485 個，與藥物成分靶點合并后去掉重復(fù)靶點，得到交集靶點43 個。利用STRING 數(shù)據(jù)庫［11］對交集靶點進(jìn)行分析（將研究物種設(shè)定為“Homo sapiens”），得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件繪制PPI 網(wǎng)絡(luò)。利用Cytoscape 中的插件Network Analyzer 對所得到的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)所得數(shù)據(jù)中的度值、緊密中心性、介數(shù)中心性3 個參數(shù)篩選出核心靶點。

1.5 基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析

將交集靶點導(dǎo)入微生信平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行KEGG 通路富集分析及GO 注釋，得到富集結(jié)果、GO 功能氣泡圖、KEGG 通路氣泡圖以及相關(guān)信號通路圖。

1.6 分子對接

選定的關(guān)鍵活性成分和核心靶點的分子對接模擬計算通過Autodock 1.5.6 軟件來完成。從PDB（Protein Data Bank）數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org/）中下載文件格式為PDB 的核心靶點結(jié)構(gòu)文件，再從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中下載文件格式為MOL2 的關(guān)鍵活性成分結(jié)構(gòu)文件。在AutoDock 1.5.6 軟件中將蛋白質(zhì)靶點的PDB 文件去水加氫設(shè)為受體，將活性成分的MOL2 文件加全氫后設(shè)置為配體；設(shè)置對接Box 后運行Autogrid4、設(shè)置對接參數(shù)及運算方法后運行Autodock4，得到分子對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 甘草瀉心湯活性成分和靶點篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫對中藥成分進(jìn)行初步篩選后，可分別得到甘草瀉心湯中7 味中藥的有效活性成分（半夏13 種、黃連14 種、黃芩36 種、干姜5種、甘草92 種、人參22 種、大棗29 種），以及有效活性成分對應(yīng)的相關(guān)靶點（半夏93 個、黃連176 個、黃芩113 個、干姜41 個、甘草215 個、人參107 個、大棗194 個）。將7 味中藥中無對應(yīng)蛋白質(zhì)靶點的有效活性成分剔除后合并，再刪除重復(fù)成分后得到甘草瀉心湯的有效活性成分共164 種，涉及268 個有效成分靶點。篩選出度值排名前20 位的成分見表1。

表1 甘草瀉心湯的部分有效活性成分（度值排名前20 位）

2.2 “中藥-活性成分-相關(guān)靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用 Cytoscape 3.8.0 軟件繪制“中藥-活性成分-相關(guān)靶點”網(wǎng)絡(luò)圖（圖1），網(wǎng)絡(luò)由439 個節(jié)點構(gòu)成，包括3450 條邊。經(jīng)Analyze Network 分析，甘草的度值最高，為88；度值排名前4 位的關(guān)鍵活性成分為C2（槲皮素）、A1（β-谷甾醇）、B1（豆甾醇）、D1（山柰酚），其度值依次為429、181、124、117。

GC：甘草；HQ：黃芩；DZ：大棗；RS：人參；BX：半夏；HL：黃連；GJ：干姜。紫色：中藥；黃色：活性成分；粉色：關(guān)鍵活性成分；藍(lán)色：相關(guān)靶點；圖形大小與度值相關(guān)，度值越大，圖形越大圖1 甘草瀉心湯治療ROU 的“中藥-活性成分-相關(guān)靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將有效活性成分相關(guān)靶點和疾病相關(guān)靶點合并去重后共得到43 個交集靶點，導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用分析，通過Cytoscape3.7.1 軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)（圖2），該網(wǎng)絡(luò)圖包括43 個節(jié)點，606 條邊。根據(jù)拓?fù)鋵W(xué)分析得到的參數(shù)進(jìn)行篩選，共得到10 個核心靶點，分 別 為IL-6、TNF、IL-1β、ALB、CCL2、IL-10、VEGFA、MMP9、VCAM1、ICAM1。 核 心靶點的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)見表2。

圖2 甘草瀉心湯治療ROU 的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

表2 甘草瀉心湯治療ROU 的核心靶點的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)

2.4 GO 功能和KEGG 通路富集分析

將有效活性成分和疾病相關(guān)靶點取交集后得到的43 個交集靶點，導(dǎo)入微生信平臺進(jìn)行GO 功能和KEGG 通路富集分析。共得到3078 個GO 富集條目，其中包括生物過程（biological process，BP）2740 個，主要涉及對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)（response to molecule of bacterial origin） 等；細(xì)胞組成（cellular component，CC）124 個，涉及膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、膜區(qū)（membrane region）等；分子功能（molecular function，MF） 214 個，涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、受體配體活性（receptor ligand activity） 等。 以P≤0.01 為條件進(jìn)行篩選并按照P值由小到大進(jìn)行排列，選取排名前10 的條目進(jìn)行可視化處理（圖3～5）。KEGG信號通路富集共獲得174 條通路，以P≤0.01 為條件進(jìn)行篩選并按照P值由小到大進(jìn)行排列，選取排名前10 的條目進(jìn)行可視化處理（圖6）。通路主要涉及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、細(xì)胞流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）等信號通路。

圖3 甘草瀉心湯治療ROU 的GO 富集分析結(jié)果（生物過程）

圖4 甘草瀉心湯治療ROU 的GO 富集分析結(jié)果（細(xì)胞成分）

圖5 甘草瀉心湯治療ROU 的GO 富集分析結(jié)果（分子功能）

圖6 甘草瀉心湯治療ROU 的KEGG 富集分析結(jié)果

2.5 分子對接

篩選得到的關(guān)鍵活性成分為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、豆甾醇；PPI 網(wǎng)絡(luò)度值前4 的核心靶點是IL-6、TNF、IL-1β、ALB。 利用AutoDock 1.5.6 軟件對篩選出的關(guān)鍵活性成分和核心靶點進(jìn)行分子對接模擬計算，關(guān)鍵活性成分與核心靶點對接結(jié)果見表3。該結(jié)果表明，甘草瀉心湯中關(guān)鍵活性成分與核心靶點的結(jié)合能均≤-5.0kJ/mol，提示關(guān)鍵活性成分與核心靶點均具有良好的結(jié)合活性。采用PyMol 軟件對分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化，部分關(guān)鍵活性成分與核心靶點的分子對接結(jié)果見圖7。

表3 關(guān)鍵活性成分與核心靶點對接結(jié)果 kJ/mol

A：IL-6 與山柰酚；B：ALB 與豆甾醇；C：IL-1β與豆甾醇；D：TNF 與β-谷甾醇圖7 部分關(guān)鍵活性成分與核心靶點的分子對接示意圖

3 討論

ROU 發(fā)病的原因很復(fù)雜［2，12］?？谇火つひ蚋鞣N原因受到損傷后，由細(xì)胞免疫介導(dǎo)的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)可進(jìn)一步導(dǎo)致?lián)p傷部位的黏膜損傷、炎癥細(xì)胞的聚集、壞死組織的吞噬以及受損黏膜中不同大小潰瘍的形成?；颊甙l(fā)病時常伴有腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF） 、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8、IL-10 等 炎 癥 因子的異常表達(dá)，產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)貫穿ROU 整個病理生理進(jìn)程［13］，并進(jìn)一步加重黏膜損傷，影響潰瘍病灶愈合，使病情惡化。ROU 的發(fā)病率較高，在免疫功能紊亂的人群中，其發(fā)病率會進(jìn)一步升高。

中醫(yī)學(xué)對ROU 的病因認(rèn)識較為清楚，臨床以寒熱錯雜型的病癥最為多見，這也是該病反復(fù)發(fā)作的原因之一［14］。甘草瀉心湯由7 味中藥組成，方中黃芩、黃連苦降以除熱；干姜、半夏辛溫開結(jié)以散寒；人參、甘草、大棗益氣補虛兼生津液，防苦寒傷陽，又防辛熱傷陰。諸藥合用，則辛開苦降，寒熱平調(diào)，標(biāo)本兼治［15］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，ROU 患者潰瘍發(fā)作期CD3+T 淋巴細(xì)胞和 CD4+T 淋巴細(xì)胞明顯減少，患者細(xì)胞免疫水平明顯低于正常范圍［16］；而經(jīng)甘草瀉心湯治療后的患者，CD3+、CD4+、CD4+/ CD8+升高，CD8+顯著降低，提示甘草瀉心湯可以有效提高ROU 患者免疫功能［17-18］。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對甘草瀉心湯治療ROU 的潛在作用機制進(jìn)行深入分析。根據(jù)“中藥-活性成分-相關(guān)靶點”網(wǎng)絡(luò)分析得到了4 個關(guān)鍵活性成分，分別是β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素、山柰酚。其中，槲皮素能夠極顯著地抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌炎癥介質(zhì)NO 以及促炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6，提示槲皮素有理想的體外抗炎效果［19］；山柰酚能夠顯著抑制LPS 誘導(dǎo)的人單核細(xì)胞THP-1 中巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的趨化因子（macrophage-derived chemokine， MDC），干擾素γ誘導(dǎo)蛋白10（interferonγinducible protein-10，IP-10）以及IL-8 等炎癥因子的產(chǎn)生，從而有效抑制炎癥進(jìn)展［20］；Pandith 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，飛機草（Chromolaena odorata）提取物中的豆甾醇能明顯減少由脂多糖LPS 誘導(dǎo)增多的致炎因子環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase 2，COX-2）和誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS） 的表達(dá)，同時抑制前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和NO 的釋放，從而發(fā)揮其抗炎作用。在ROU 的發(fā)生過程中，T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子水平有所變化，如IL-1、IL-2、IL-6 等促炎因子分泌會增加，而抗炎因子IL-10 分泌會減少。應(yīng)用β-谷甾醇治療時，大多數(shù)促炎細(xì)胞因子和單核細(xì)胞趨化蛋 白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）的表達(dá)水平都有所下降，而抗炎因子IL-10 的表達(dá)上調(diào)［22］。

對PPI 網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析，IL-6、IL-1β、ALB、TNF、CCL2、VEGFA、NOS3 等為核心靶點。其中，IL-1β為致炎因子之一，能刺激IL-2、IL-6、IL-8 等其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生并相互影響。IL-6 是促進(jìn)B 淋巴細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞活化，參與免疫應(yīng)答以及炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵成分［23］。ROU 患者TNF-α水平升高可刺激IL-2、IL-6 等細(xì)胞因子功能及數(shù)量的改變，從而破壞細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)平衡，并引起IL-2、IL-6 等促炎因子的釋放及抑制IL-10 釋放，從而加重炎癥反應(yīng)，使?jié)兗又兀?4］。CCL2 能夠誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，進(jìn)而促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，促進(jìn)炎癥進(jìn)程［25］。

對甘草瀉心湯治療ROU 的關(guān)鍵靶點進(jìn)行GO功能分析，包括BP、MF 和CC［26］。甘草瀉心湯治療ROU 涉及BP 主要為對LPS 的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、細(xì)胞間黏附的調(diào)節(jié)、活性氧代謝過程、白細(xì)胞黏附的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間黏附的正向調(diào)節(jié)、白細(xì)胞-細(xì)胞黏附、白細(xì)胞-細(xì)胞黏附的正向調(diào)節(jié)、T 細(xì)胞活化、細(xì)胞對生物刺激的反應(yīng)等，其中富集最多的是對LPS 的反應(yīng)。就MF 而言，主要涉及細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、受體配體活性、信號受體激活劑活性、生長因子受體結(jié)合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合、腫瘤壞死因子超家族受體結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合、生長因子結(jié)合、NADP 結(jié)合等過程。在CC 方面，目標(biāo)主要富集在膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、細(xì)胞質(zhì)泡腔、囊泡腔、過氧化物酶體、微體、質(zhì)膜外側(cè)、分泌顆粒腔、血小板α 顆粒腔等。這些結(jié)果表明甘草瀉心湯可通過調(diào)節(jié)多種復(fù)雜的生物過程來治療ROU。

KEGG 通路分析結(jié)果表明，甘草瀉心湯可能通過調(diào)控糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、瘧疾、炎癥性腸病、甲型流感、美洲錐蟲病、非洲錐蟲病、TNF 信號通路、IL-17 信號通路等信號通路，從而治療ROU。研究表明，當(dāng)機體處于炎癥、創(chuàng)傷、糖尿病等狀態(tài)時，晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation endproducts，AGEs）升高，上調(diào)晚期糖基化終產(chǎn)物受體（receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）的表達(dá)［27］。AGEs/RAGE/NF-κB 信號通路被激活，NF-κB 活化并核移，導(dǎo)致血清IL-1β、TNF-α等炎癥介質(zhì)水平升高，引起組織損傷［28］。基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）等基因在振蕩剪切應(yīng)力下表達(dá)明顯升高，表現(xiàn)為促進(jìn)抗As基因、抗凝血基因的活化，從而發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗凝效應(yīng)［29］。IL-17 與炎癥的發(fā)生和發(fā)展有密切的關(guān)系，其通過刺激靶細(xì)胞釋放前炎癥細(xì)胞因子以及動員中性粒細(xì)胞的細(xì)胞因子來發(fā)揮作用，在誘導(dǎo)IL-6、NO、PGE2 產(chǎn)生的同時上調(diào)IL-1β、TNF-α等炎癥因子水平，使局部炎癥擴大［30］。

此外，分子對接結(jié)果顯示，關(guān)鍵活性成分和核心靶點對接的結(jié)合能均低于-5.0kJ/mol，表明核心靶點與甘草瀉心湯關(guān)鍵活性成分之間具有很強的結(jié)合能力。

綜上所述，甘草瀉心湯中的多種活性成分可協(xié)同發(fā)揮抗炎作用，減少由LPS 誘導(dǎo)增多的炎性因子和趨化因子的產(chǎn)生，并通過作用于TNF、IL-1β、IL-6、CCL2、NOS3 等關(guān)鍵靶點以及參與AGERAGE、NF-κB、IL-17 等信號通路發(fā)揮抗炎作用、改善免疫功能。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法，對甘草瀉心湯治療ROU 的成分和靶點進(jìn)行了分析，闡述了其主要的生物過程和信號通路，為臨床和進(jìn)一步研究甘草瀉心湯通過多成分、多靶點、多途徑治療ROU 提供了科學(xué)依據(jù)。