囊胚培養(yǎng)與移植在不孕癥患者中的應用

張丹丹,童 旭,王洋洋,馬陳東,沈 澍

(1.皖北煤電集團總醫(yī)院生殖醫(yī)學科;2.宿州市生殖醫(yī)學與胚胎重點實驗室,安徽 宿州 234000)

隨著輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)發(fā)展日趨成熟,IVF/ICSI-ET已成為治療不孕癥患者的常規(guī)方法,給一部分不孕不育家庭帶來了新希望,但隨之也出現(xiàn)了如卵巢過度刺激、多胎妊娠、異位妊娠、胎兒畸形等問題[1-2]。目前,在ART治療周期中,常采用形態(tài)學評分法對胚胎發(fā)育潛能進行評估,依據(jù)評分級別進行選擇移植、培養(yǎng)、冷凍或者丟棄[3-4]。然而,根據(jù)形態(tài)學評分判斷D3胚胎的發(fā)育潛能還存在一定局限性,并不具有普遍適用性。因此,為了獲得更高的IVF成功率,特別是對于經(jīng)歷了因胚胎質(zhì)量差而放棄周期的患者,探尋新的技術(shù)方法尤為重要。近年來,人們把目光聚焦到ART的另一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)—囊胚培養(yǎng)[5-6]。囊胚培養(yǎng)因其能通過延長胚胎培養(yǎng)時間進一步篩選出發(fā)育潛能更高的胚胎,而被廣泛應用于臨床上。囊胚培養(yǎng)越過了胚胎基因組激活階段,經(jīng)歷了細胞融合、囊腔形成與擴大,并淘汰了一些發(fā)育潛能較差的胚胎[7]。另外,囊胚移植還有利于增加子宮內(nèi)膜和胚胎發(fā)育的同步性,顯著提高臨床妊娠率和胚胎著床率,降低多胎妊娠率[4,8]。因此,目前眾多中心都采取將受精后D3胚胎繼續(xù)行囊胚培養(yǎng)至D5/D6天冷凍做移植的臨床策略。本研究針主要對ART助孕中移植、冷凍后剩余胚胎行囊胚培養(yǎng)與移植的患者分析其妊娠結(jié)局,旨在為ART周期中胚胎質(zhì)量差的患者爭取更多的妊娠可能性。

1 資料與方法

1.1 研究對象對2021年11月至2023年4月在本院生殖中心接受IVF/ICSI-ET治療的631例新鮮周期患者的一般資料和促排卵效果進行分析,并對受精后D3卵裂期胚胎按照患者意愿分配處理:即胚胎移植、冷凍、丟棄或囊胚培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)至D5/D6觀察囊胚形成,對囊胚進行移植、冷凍或丟棄。同時,本時間段內(nèi)接受凍融周期即D3卵裂期或D5/D6囊胚期移植患者的的妊娠結(jié)局進行比較。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審查通過,所有患者均簽署知情同意書。

新鮮周期:納入標準:(1)常規(guī)IVF和ICSI受精的患者;(2)受精后有D3胚胎可移植、冷凍、囊胚培養(yǎng)或丟棄的患者。排除指標:(1)超數(shù)排卵但未行陰道B超下取卵術(shù)的患者;(2)行陰道B超下取卵但未獲取到卵子的患者;(3)一般資料統(tǒng)計不完整的患者。

凍融周期:納入標準:(1)復蘇D3卵裂期胚胎移植的患者;(2)復蘇D5/D6囊胚移植的患者。排除指標:(1)解凍復蘇過程中胚胎崩解或退化的患者;(2)解凍復蘇后要求取消移植的患者。

1.2 分組依據(jù)新鮮周期:對受精后D3卵裂期胚胎根據(jù)是否行囊胚培養(yǎng)及是否形成囊胚分為:未養(yǎng)囊組、養(yǎng)囊成功組和養(yǎng)囊失敗組;又根據(jù)移植胚胎的時期分為:卵裂期移植組和囊胚移植組。凍融周期:冷凍復蘇D3卵裂期胚胎培養(yǎng)17 h后移植,根據(jù)移植前胚胎時期分為卵裂期移植組 (移植前2枚均為卵裂期)、混合期移植組 (移植前1枚為卵裂期,另1枚為囊胚期)、以及冷凍復蘇D5/D6囊胚的囊胚移植組。

1.3 方法

1.3.1 一般資料 對2021年11月至2023年4月在本院生殖中心接受IVF/ICSI-ET治療的631例新鮮周期患者的一般資料,主要包括女方年齡、女方身體質(zhì)量指數(shù)(ballistic missile intercept,BMI)、不孕年限和促排卵效果(如Gn天數(shù)、Gn總量、HCG日LH和E2水平)、獲卵數(shù)、受精卵數(shù)、胚胎發(fā)育情況以及移植胚胎類型與臨床妊娠結(jié)局進行分析比較。同時,對本時間段內(nèi)接受冷凍復蘇D3卵裂期或D5/D6囊胚期移植助孕患者的妊娠結(jié)局進行比較。

1.3.2 促排卵治療方案及授精 所有患者均采用本中心常規(guī)使用的促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin-releasing hormone antagonis,GnRH-a,達必佳,德國)和重組卵泡刺激素(FSH,果納芬,默克雪蘭諾,意大利)的標準長或短方案進行控制性促排卵,當陰道B超監(jiān)測到2個或以上直徑≥18 mm卵泡時,肌肉注射10 000 U HCG(麗珠制藥,中國珠海),36 h后在陰道B超監(jiān)測下采卵。取卵當日根據(jù)男方精液質(zhì)量選擇IVF或ICSI受精方式。授精18～20 h觀察原核數(shù)目。

1.3.3 胚胎培養(yǎng)與胚胎評估 胚胎培養(yǎng):在Quinn’s-1026(SAGE,Amercica)培養(yǎng)液中加入10%人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA,SAGE,Amercica)配成卵裂期胚胎培養(yǎng)液,在37 ℃,6% CO2和最合適濕度培養(yǎng)箱中平衡過夜,受精后胚胎在此培養(yǎng)液中培養(yǎng)到D3。

胚胎評估:根據(jù)形態(tài)學參數(shù)對D3胚胎進行質(zhì)量評估,將早期胚胎分為4級。Ⅰ級:細胞卵裂球均勻,胞質(zhì)無碎片或少量碎片(<10%)。Ⅱ級:細胞大小略不均勻,胞質(zhì)少許碎片(10%～20%)。Ⅲ級:細胞大小明顯不均勻,胞質(zhì)明顯碎片(21%～50%)。Ⅳ級:細胞大小嚴重不均勻,胞質(zhì)嚴重碎片(>50%以上)。

1.3.4 囊胚培養(yǎng)方式和囊胚分級標準 囊胚培養(yǎng):移植或/和冷凍后剩余胚胎經(jīng)患者同意后行囊胚培養(yǎng),均簽署囊胚培養(yǎng)知情同意書,將20% HSA加入Quinn’s-1029(SAGE,Amercica)配成囊胚培養(yǎng)液,放置在相同條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至D5/D6天,觀察囊胚形成情況。

囊胚發(fā)育分級標準:采用Gerdner標準對囊胚進行評估分級[9]。根據(jù)囊胚發(fā)育、內(nèi)細胞團發(fā)育及滋養(yǎng)層細胞發(fā)育情況綜合判定囊胚等級。首先根據(jù)囊胚腔的大小以及是否孵出,將囊胚劃分為1～6期;接著依據(jù)細胞數(shù)目以排列方式對內(nèi)細胞團發(fā)育進行分級(針對3～6期的囊胚):A級為細胞分裂數(shù)目多且排列密集;B級為細胞分裂數(shù)目較少且排列較為松散;C級為細胞分裂數(shù)目極少;最后依據(jù)上皮細胞層細胞數(shù)目以及排列方式對滋養(yǎng)層細胞進行分級(針對3～6期的囊胚):A級為較多細胞組成且排列緊密;B級為部分細胞組成但排列較為松散;C級為稀疏細胞組成。在臨床上一般僅對3BC以上的囊胚進行冷凍或者移植,但若形成4CC囊胚則根據(jù)患者意愿對其進行酌情處理。囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數(shù)。

1.3.5 胚胎及囊胚冷凍、解凍 卵裂期胚胎及囊胚冷凍和解凍均使用Kitazato公司冷凍液和解凍液。囊胚冷凍前對其進行激光打孔皺縮。按照試劑說明書對胚胎進行冷凍及復蘇,復蘇后對卵裂期胚胎透明帶進行削薄,對囊胚進行激光輔助孵化。胚胎移植日前一天解凍再培養(yǎng)17 h;囊胚則在移植日當天提前2～4 h解凍。

1.3.6 臨床妊娠與臨床妊娠率 移植14 d后檢測患者血清中HCG濃度,陽性者4～6周后行B超監(jiān)測,見孕囊或者心血管搏動,則為臨床妊娠。臨床妊娠率=臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料用例數(shù)(n)表示;符合正態(tài)分布定量資料用“均數(shù)±標準差”表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,三組間比較采用單因素方差分析,定性資料比較采用卡方檢驗和Fisher’s精確檢驗,以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 未行囊胚培養(yǎng)組與養(yǎng)囊成功組及失敗組患者基礎(chǔ)一般資料、獲卵及胚胎發(fā)育情況比較結(jié)果顯示,631例患者中有1.74%患者未獲取到卵子,42.95%患者未行囊胚培養(yǎng),而21.55%(136/631)患者養(yǎng)囊失敗,僅有33.76%(213/631)患者養(yǎng)囊成功。養(yǎng)囊失敗組和成功組中共有2213枚胚胎培養(yǎng)形成676枚囊胚,表明囊胚培養(yǎng)可以最大限度提高胚胎利用率,有利于增加患者的移植機率,顯著降低患者的經(jīng)濟損失。

對三組患者一般資料統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),女方年齡、Gn天數(shù)、Gn總量及HCG日激素水平均存在顯著性差異(表1)。其中養(yǎng)囊成功組患者年齡更小,不孕年限和Gn使用天數(shù)更短,Gn用量更少,HCG日LH水平更低,HCG日E2水平更高,提示養(yǎng)囊成功組患者卵巢反應度高,卵巢儲備功能好。對獲卵及受精后胚胎發(fā)育潛能分析發(fā)現(xiàn),三組之間獲卵數(shù)、卵子成熟度和胚胎發(fā)育能力均存在統(tǒng)計學差異(表2)。養(yǎng)囊成功組患者獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、兩原核(two pronucleus,2PN)數(shù)及2PN卵裂數(shù)、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均高于未養(yǎng)囊組和養(yǎng)囊失敗組患者。養(yǎng)囊成功組囊胚形成率41.68%(676/1622),而養(yǎng)囊失敗組有591枚胚胎培養(yǎng)后未形成囊胚。

表1 三組患者一般資料比較

表2 三組患者胚胎發(fā)育能力比較

圖1 新鮮周期胚胎培養(yǎng)方式比例

2.2 囊胚培養(yǎng)與移植和卵裂期移植患者資料及胚胎發(fā)育能力比較比較IVF/ICSI-ET治療周期中選擇囊胚培養(yǎng)與移植患者和D3卵裂期移植患者的一般資料發(fā)現(xiàn),與D3移植組相比,囊胚移植組患者女方年齡、不孕年限、Gn總量及HCG日LH水平顯著降低,HCG日E2水平顯著增加(表3),獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、卵裂數(shù)及優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均顯著上升(表4),表明囊胚移植組患者卵巢儲備功能好,卵子質(zhì)量高,胚胎發(fā)育潛能強,預示著良好的妊娠結(jié)局。

表3 囊胚培養(yǎng)與移植和卵裂期移植患者一般資料比較

表4 囊胚培養(yǎng)與移植和卵裂期移植患者胚胎發(fā)育能力比較

2.3 囊胚培養(yǎng)與移植和卵裂期移植患者妊娠結(jié)局比較IVF/ICSI-ET治療周期中D3天選擇囊胚培養(yǎng)與移植患者21例,平均移植數(shù)1.33(28/21)枚,選擇D3卵裂期移植患者293例,平均移植數(shù)1.70(500/293)枚。在本生殖中心新鮮周期中卵裂期移植占絕大部分93.31%(293/314)。比較兩組妊娠結(jié)局發(fā)現(xiàn),囊胚期移植組與卵裂期移植組之間胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、多胎妊娠率、異位妊娠率均無顯著性差異,但囊胚移植組多胎妊娠率和異位妊娠率更低(表5)。

表5 囊胚培養(yǎng)與移植和卵裂期移患者妊娠結(jié)局比較

2.4 凍融周期移植不同時期胚胎妊娠結(jié)局比較凍融周期中,D3卵裂期胚胎解凍后培養(yǎng)17 h,觀察移植前胚胎增殖情況,仍為卵裂期移植有323例;一枚為卵裂期另一枚為囊胚期移植有33例,復蘇D5/D6囊胚移植有177例,比較三組平均移植胚胎數(shù)、胚胎種植率、臨床妊娠率均存在統(tǒng)計學差異,流產(chǎn)率、多胎妊娠率及異位妊娠率無明顯差異(表6)。囊胚移植組平均移植胚胎數(shù)更少,胚胎種植率及臨床妊娠率更高,流產(chǎn)率和異位妊娠率較低,表明囊胚移植可以提高胚胎植入率,降低不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率。

表6 凍融周期移植三組患者妊娠結(jié)局比較

3 討論

ART治療周期中,隨著促排卵方案不斷完善及胚胎實驗室培養(yǎng)體系改進,胚胎數(shù)量和質(zhì)量均有了極大的提高[7]。據(jù)統(tǒng)計,在IVF-ET助孕周期中僅有30%胚胎得到利用,絕大部分胚胎被廢棄,造成嚴重的胚胎浪費[10]。然而,囊胚培養(yǎng)可以將胚胎進一步培養(yǎng),延長胚胎發(fā)育時間,從而淘汰發(fā)育不良的胚胎,篩選出更具有發(fā)育潛力的優(yōu)質(zhì)胚胎,可間接預測最終妊娠結(jié)局[7]。本研究將探討囊胚培養(yǎng)與移植在不孕癥患者治療中的作用,為提高ART成功率提供一定的理論基礎(chǔ)。

本研究對IVF/ICSI-ET治療過程中根據(jù)受精后D3天是否養(yǎng)囊及是否形成囊胚進行分析發(fā)現(xiàn),養(yǎng)囊成功組中女方年齡更年輕、Gn天數(shù)和Gn總量更少,而HCG日激素水平更穩(wěn)定,獲卵數(shù)、成熟卵數(shù)、2PN數(shù)、2PN卵裂數(shù)、可利用胚胎數(shù)和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)胚胎均高于未養(yǎng)囊組和養(yǎng)囊失敗組,表明養(yǎng)囊成功組的患者卵巢反應度高,卵子質(zhì)量高,卵巢儲備功能較好,與張小霞等研究結(jié)果一致[11]。囊胚培養(yǎng)是通過延長培養(yǎng)時間篩選出更具有發(fā)育潛能的胚胎。研究證實,取卵后體外培養(yǎng)D3天的低質(zhì)量胚胎仍具有發(fā)育至囊胚的潛能,而對于D3無可用胚胎移植的患者,利用“廢棄”胚胎行囊胚“試培養(yǎng)”也不失為一種補救治療的方法[12-14]。此外,對于高齡低儲備不孕患者行全囊胚培養(yǎng)并不會對妊娠結(jié)局造成不利影響,相反只要培養(yǎng)成囊胚可供移植,囊胚培養(yǎng)組的妊娠結(jié)局優(yōu)于不養(yǎng)囊胚組[15]。

有研究表明,囊胚培養(yǎng)與移植可以改善子宮內(nèi)膜和胚胎發(fā)育的同步性,增加子宮內(nèi)膜容受性,同時使發(fā)育潛能較好的胚胎實現(xiàn)自我篩選,提高胚胎種植率,從而提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率[16-17]。相反的是,顧亦凡等研究發(fā)現(xiàn)人類發(fā)育欠佳胚胎在卵裂期進行移植更加適合[18]。本研究發(fā)現(xiàn),囊胚培養(yǎng)與移植和卵裂期移植相比,胚胎種植率(24.32% vs 29.80%)和臨床妊娠率(38.10% vs 43.00%)無統(tǒng)計學差異,這可能是由于本生殖中心新鮮周期以移植D3卵裂期胚胎為主,囊胚移植較少。此外,與羅婷、Muller V等研究一致,囊胚移植異位妊娠率低于卵裂期移植但差異不顯著(0% vs 2.38%),可能是移植胚胎天數(shù)并不是影響異位妊娠的最主要因素[19-20]。

一項meta分析表明卵裂期胚胎冷凍復蘇移植與囊胚期胚胎冷凍復蘇移植二者妊娠結(jié)局沒有差異[21]。而呂金春等認為凍融周期中囊胚移植的臨床妊娠結(jié)局優(yōu)于胚胎組,囊胚移植胚胎種植率、妊娠率和多胎妊娠率顯著增加[22]。此外,也有其他研究表明,單囊胚移植具有較高的臨床妊娠率和著床率,且多胎率降低等優(yōu)點[19,23]。本研究發(fā)現(xiàn),凍融周期囊胚移植的胚胎種植率和臨床妊娠率均顯著高于卵裂期移植,但多胎率并沒有降低,可能與囊胚移植胚胎數(shù)有關(guān)。另外,在混合移植組中臨床妊娠率也顯著增加,流產(chǎn)率和異位妊娠率偏低,表明只要有囊胚形成均能保持較滿意的妊娠率[24]。在本生殖中心單囊胚移植策略較少,導致多胎妊娠率偏高,因此在后期要加強單囊胚移植的例數(shù),盡力降低囊胚移植帶來的多胎妊娠。

綜上所述,囊胚培養(yǎng)與移植囊胚培養(yǎng)是對胚胎的進一步篩選,可以有效提高胚胎利用率,提高胚胎種植率和臨床妊娠率,幫助患者獲得更好的妊娠結(jié)局。但是囊胚培養(yǎng)也有培養(yǎng)失敗的風險,一般囊胚形成率為40%～60%,長時間的培養(yǎng)和篩選過程,可能會導致患者無可移植囊胚,給患者造成經(jīng)濟和心理負擔。更重要的是體外培養(yǎng)時間延長也可能對印記基因有一定影響,從而影響子代遠期安全。因此要充分認識囊胚培養(yǎng)的利弊,有效發(fā)揮囊胚培養(yǎng)與移植在臨床工作中的作用,選擇合理的策略,獲得較高的臨床妊娠率,減少多胎率和異位妊娠的發(fā)生。