白藜蘆醇通過(guò)AMPK/PPARα/PGC1α影響酒精依賴致肝損傷機(jī)制研究

鄭天翼,韓智學(xué),薛繼婷,徐曉焱,張 杰,劉洪鳳,楊 勇,岳 輝

(牡丹江醫(yī)學(xué)院,黑龍江 牡丹江 157011)

酒精依賴綜合癥具有較高的發(fā)病率和死亡率,是全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題,除誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病,常伴有肝病、胰腺炎、乳腺癌、心血管疾病和多種感染等[1]。酒精依賴綜合癥特征為對(duì)酒精的渴望、耐受性、對(duì)酒精的專注失去自控能力進(jìn)而出現(xiàn)酒精戒斷綜合征[2],酒精依賴患者表現(xiàn)為強(qiáng)烈飲酒沖動(dòng);難以控制飲酒行為和酒精停止或減少出現(xiàn)戒斷狀態(tài)等[3]。已知酒精依賴臨床治療有納曲酮、阿坎酸、納美芬等抑制神經(jīng)元活性的藥物[4],存在一些副作用。以往研究表明[5-6]針對(duì)肝損傷后的治療,中藥相對(duì)安全性較高,副作用少。RES廣泛存在植物中,是一種天然多酚,可以參與改善氧化應(yīng)激損傷[7-8];研究發(fā)現(xiàn)RES-姜黃素聯(lián)合使用有顯著抑制HepG2細(xì)胞脂肪變性作用[9];RES可通過(guò)AMPK/SIRT1/Nrf2、ERK/p38、MAPK和PTEN/Akt等信號(hào)通路增加抗氧化分子的合成并影響線粒體生物發(fā)生的有關(guān)基因表達(dá)[10]。本研究旨在觀察RES對(duì)酒精依賴致肝損傷的影響,探究AMPK/PPARα/PGC1α信號(hào)通路對(duì)酒精依賴大鼠肝損傷的修復(fù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑及藥品RES(批號(hào)R8350),吐溫-20,甘氨酸,SDS和Tris購(gòu)自北京Solarbio公司;脫脂奶粉購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司;PVDF膜(0.45 μm)購(gòu)自美國(guó)Roche公司;預(yù)染彩虹蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)自上海碧云天公司;PGC1α一抗(兔抗大鼠)購(gòu)自武漢Proteintech公司;AMPK一抗(兔抗大鼠),p-AMPK一抗(兔抗大鼠),PPARα一抗(兔抗大鼠)和抗體稀釋液購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類生物公司;GAPDH一抗(兔抗大鼠)和二抗(山羊抗兔/山羊抗小鼠)購(gòu)自北京Bioss公司;RIPA,PMSF,SDS-PAGE凝膠快速配置試劑盒和超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自大連Meilunbio公司;甲醇和異丙醇購(gòu)自天津富宇精細(xì)化工公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠,雄性,體重180～220 g,6周齡,動(dòng)物許可證號(hào)【SCXK(黑)2019-003】,大鼠飼養(yǎng)于牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)鼠類實(shí)驗(yàn)室。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求。

1.3 模型制備和樣本的采集SPF級(jí)的大鼠隨機(jī)數(shù)字表法設(shè)置為空白對(duì)照(Control)組8只以及模型對(duì)照(Model)組32只單籠飼養(yǎng)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后通過(guò)給與20%酒精的雙瓶自由飲制備模型[11-12]。Control組兩瓶?jī)?nèi)均為蒸餾水100 mL;Model組一瓶是20%酒精100 mL,另一瓶是蒸餾水100 mL。飼養(yǎng)24 h后更換瓶?jī)?nèi)酒精換成蒸餾水,飼養(yǎng)過(guò)程中換水時(shí)交換水瓶位置避免飼養(yǎng)期間大鼠形成位置偏好。每24 h記錄瓶?jī)?nèi)水和酒精的消耗量,大鼠體重,飼養(yǎng)28 d。當(dāng)Model組大鼠的酒精攝入量(>3.15 g/(kg·d))和酒精偏好逐漸穩(wěn)定代表大鼠進(jìn)入酒精依賴的平臺(tái)期,即制備SD大鼠酒精依賴模型成功[13-14]。

給與RES藥物治療,將Model組32只大鼠隨機(jī)分為四組,分別為酒精依賴模型組(alcohol dependence,AD)、RES高治療組(High)組、RES中劑量治療(Middle)組和RES低劑量治療(Low)組。RES按照100、50、25 mg/(kg·d)劑量灌胃給藥,Control和AD給與1 mL/(kg·d)生理鹽水灌胃,用藥兩周。治療結(jié)束24 h期間禁食禁水,用異氟烷將大鼠麻醉,處死大鼠取肝組織備用。建模期間記錄大鼠體重,雙瓶自由飲期間記錄瓶?jī)?nèi)液體量,即飲水量和飲酒量,整理數(shù)據(jù)計(jì)算飲酒偏好(=飲酒量占總液體攝入量的百分比)。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)大鼠肝組織AMPKα、PPARα和PGC1α蛋白表達(dá)水平提取大鼠肝組織,使用RIPA裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑混合裂解獲得組織勻漿,離心取上清,NanoDrop測(cè)量蛋白濃度,按照公式5VSDS-PAGE=VSDS-PAGE+V蛋白+V水;(V蛋白×C蛋白)/(VSDS-PAGE+V蛋白+V水)=40/15加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液和三蒸水于EP管,混勻后沸水煮10 min確保蛋白變性,分裝后-20 ℃冷藏。安裝好電泳裝置每孔15 μL蛋白,電泳電壓80 V恒壓,30 min后加壓至120 V恒壓,直至目的蛋白在規(guī)定區(qū)域內(nèi)分離顯著停止電泳。轉(zhuǎn)膜條件250 mA恒流90 min,轉(zhuǎn)膜后搖床封閉4 h,孵育一抗(一抗?jié)舛?∶1000)4 ℃搖床12 h,1×TBST漂洗5次,每次6 min,孵育二抗(二抗?jié)舛?∶10000)2 h,1×TBST漂洗5次,每次6 min。加入發(fā)光顯色液通過(guò)顯影儀拍照并對(duì)結(jié)果分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel表錄入,數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0,計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,多組間比較采用單因素方差分析,以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 雙瓶自由飲期間大鼠體重變化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄大鼠體重,觀察酒精對(duì)大鼠生長(zhǎng)的影響。直至建模結(jié)束時(shí)空白對(duì)照組大鼠體重與酒精依賴模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 酒精依賴大鼠體重變化

2.2 20%酒精雙瓶自由飲大鼠模型建立結(jié)果顯示,隨著酒精依賴模型建立,用藥前酒精攝入量和大鼠的飲酒偏好兩指標(biāo)都在逐步增加,在平臺(tái)期內(nèi)趨于穩(wěn)定,代表模型建立成功。平臺(tái)期大鼠飲酒組酒精攝入量(9.07±1.12)g/(kg·d)、飲酒偏好(34.95±1.70)%。見(jiàn)表1,圖2。

表1 酒精依賴大鼠平臺(tái)期酒精攝入量和飲酒偏好

圖2 酒精依賴大鼠平臺(tái)期飲酒量和飲酒偏好

2.3 RES對(duì)酒精依賴大鼠肝組織AMPK、p-AMPK、PPARα和PGC1α表達(dá)的影響酒精依賴模型組肝組織內(nèi)p-AMPK、PPARα和PGC1α的蛋白相對(duì)表達(dá)水平相較于空白對(duì)照組顯著下降(F=8.60,4.38,11.33,P<0.05),RES高劑量組肝組織內(nèi)的p-AMPK、PPARα和PGC1α蛋白相對(duì)表達(dá)水平相較于模型組明顯升高p-AMPK(F=6.00,High組P<0.05,Middle組P<0.05,Low組P>0.05)、PPARα(F=4.41,High組P<0.05,Middle組P>0.05,Low組P>0.05)和PGC1α(F=5.93,High組P<0.05,Middle組P>0.05,Low組P>0.05),見(jiàn)圖3。

3 討論

目前國(guó)內(nèi)酒精消費(fèi)量急劇增長(zhǎng),酒精依賴患者顯著增加,酒精是誘發(fā)慢性肝病的主要驅(qū)動(dòng)因素[15]。長(zhǎng)期酒精暴露下,酒精的代謝產(chǎn)物乙醛在肝內(nèi)積累,乙醛使線粒體功能受損,分解脂肪酸能力下降,造成脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)蓄積;另一方面酒精代謝中產(chǎn)生較多活性氧(reactive oxygen species,ROS),過(guò)量的氧自由基破壞了肝細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài),致使肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化[16]。AMPK是細(xì)胞能量代謝的重要傳感器,AMPK是改善高脂飲食小鼠脂質(zhì)水平和氧化-抗氧化平衡中的調(diào)節(jié)靶點(diǎn)[17],對(duì)于細(xì)胞代謝起到了重要調(diào)控作用,通過(guò)對(duì)關(guān)鍵蛋白的磷酸化,AMPK可以調(diào)節(jié)不同代謝方向,包括哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、脂質(zhì)代謝、糖酵解和線粒體代謝,從而增加脂質(zhì)的分解代謝過(guò)程,減少其合成途徑[18]。激活A(yù)MPK可能是防止肝脂肪變性進(jìn)展的一種新保護(hù)措施,AMPK信號(hào)通路的激活可以改善HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗和脂質(zhì)積累情況[19],研究結(jié)果顯示,AMPK可以抑制脂肪合成,促進(jìn)脂肪酸的氧化[20]。以往研究表明[21-22],RES可以通過(guò)激活A(yù)MPK的表達(dá)抑制mTOR信號(hào)傳導(dǎo);RES通過(guò)AMPK/核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)信號(hào)通路減輕了心肌缺血再灌注的氧化應(yīng)激情況;RES激活A(yù)MPK后減少了神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡,RES是一種有效的AMPK激活劑,RES可以靶向AMPK抑制因阿霉素誘導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激情況并改善肝功能障礙[23-24]。AMPK是PGC-1α的上游調(diào)控因子,激活該基因后進(jìn)一步調(diào)控PPARα的表達(dá),具有調(diào)控脂肪代謝作用[25]。研究結(jié)果[26]顯示:異長(zhǎng)葉烯在肝缺血再灌注的模型內(nèi)通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK-PGC1α信號(hào)通路介導(dǎo)抗炎、抗氧化和抗細(xì)胞凋亡作用來(lái)減輕肝臟損傷。分子對(duì)接結(jié)果顯示RES通過(guò)與Tyr-722形成氫鍵直接與PGC1α結(jié)合,促進(jìn)其本身核轉(zhuǎn)位[27]。前期研究[28]結(jié)果表明,RES改善了酒精依賴大鼠肝組織的氧化應(yīng)激情況,與模型組比較,RES治療組抗氧化因子超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-PX)、過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)含量升高。

本次實(shí)驗(yàn)研究表明RES可介導(dǎo)AMPK/PPARα/PGC1α信號(hào)通路影響酒精依賴致肝損傷的修復(fù),此研究為白藜蘆醇改善酒精依賴所導(dǎo)致的肝損傷提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),拓寬了臨床對(duì)于酒精依賴患者肝損傷的治療思路。