血清HBV RNA在臨床應(yīng)用中尚未解決的關(guān)鍵科學(xué)問題

黎婉瑩 申笙 劉詩 孫劍

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染后引起的慢性肝臟疾病。據(jù)估計(jì),全球約有2.96億的慢性HBV感染者,占總?cè)丝诘?.8%[1]。而我國(guó)是HBV感染的中高流行地區(qū),現(xiàn)有慢性HBV感染者7500萬例,占全球慢性HBV感染者人數(shù)的1/3[2, 3]。近年來,血清HBV RNA作為CHB的新型病毒學(xué)標(biāo)志物備受關(guān)注,我國(guó)的《慢性乙型肝炎防治指南(2022 年版)》以及歐洲肝病學(xué)會(huì)2017年的指南均提出血清HBV RNA在臨床上應(yīng)用于預(yù)測(cè)停藥后復(fù)發(fā)的可能性[4, 5],2022年我國(guó)發(fā)表的血清HBV RNA專家共識(shí)也總結(jié)了目前血清HBV RNA在臨床應(yīng)用中的進(jìn)展[6]。然而,在血清HBV RNA廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐之前,仍有一些關(guān)于血清HBV RNA的關(guān)鍵問題亟待解決,本文梳理出三個(gè)方面的關(guān)鍵科學(xué)問題:(1)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、經(jīng)多方驗(yàn)證并被廣泛認(rèn)可的血清HBV RNA檢測(cè)方法;(2)血清HBV RNA可較好地反映肝內(nèi)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)遺傳組成,但在反映cccDNA拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性方面仍有局限性;(3)HBV 前基因組RNA(pregenome RNA,pgRNA)與HCC相關(guān)性已得到初步證實(shí),但其是否驅(qū)動(dòng)HCC的發(fā)生、發(fā)展仍未明確。

一、關(guān)鍵問題一:缺乏標(biāo)準(zhǔn)化、經(jīng)多方驗(yàn)證并被廣泛認(rèn)可的血清HBV RNA檢測(cè)方法

血清HBV RNA目前缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法,主要有以下原因:第一,血清HBV RNA的種類較為復(fù)雜,研究表明其主要為pgRNA,包括全長(zhǎng)的pgRNA、內(nèi)含子缺失的剪接型pgRNA以及3’截?cái)嘈偷膒gRNA,此外還有少量HBx相關(guān)轉(zhuǎn)錄本等[7, 8]。當(dāng)前難以建立一種可以覆蓋所有種類的HBV RNA定量方法,而且尚不清楚不同種類的血清HBV RNA的臨床應(yīng)用價(jià)值是否一致。第二,不同實(shí)驗(yàn)室采用的實(shí)驗(yàn)方法不同,包括核酸提取方法、引物和探針位置的設(shè)計(jì)以及定量技術(shù)等,導(dǎo)致不同平臺(tái)建立的方法檢測(cè)的血清HBV RNA種類、檢測(cè)性能、檢測(cè)結(jié)果等不盡一致。國(guó)內(nèi)外不同平臺(tái)所建立的血清HBV RNA定量檢測(cè)方法主要有基于cDNA末端快速克隆的PCR法(rapid amplification of cDNA ends PCR,RACE-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(reverse transcription real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)、微滴數(shù)字PCR法(droplet digital PCR,ddPCR)和RNA實(shí)時(shí)熒光恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)等多種方法[9-12]。第三,目前尚缺乏血清HBV RNA國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品,使得國(guó)內(nèi)外所建立的血清HBV RNA定量方法無法進(jìn)行直接比較和均一化。我們團(tuán)隊(duì)前期研究表明,不同檢測(cè)方法,定量的血清HBV RNA水平不盡一致,而且不同方法定量結(jié)果之間的差異在不同人群中也不盡相同[13]。盡管不同方法定量的結(jié)果對(duì)抗病毒治療后乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen,HBeAg)血清學(xué)轉(zhuǎn)換的預(yù)測(cè)效能相當(dāng),但最佳截?cái)嘀祬s是不同的,且不同方法對(duì)核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analogues,NAs]停藥后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)效能也不盡一致,說明了在臨床實(shí)踐中,在未出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的血清HBV RNA定量檢測(cè)方法或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品之前,難以規(guī)范不同檢測(cè)方法在指導(dǎo)CHB 臨床診療中的應(yīng)用條件。

因此,為了推動(dòng)血清HBV RNA在臨床上的應(yīng)用,未來的策略是建立一個(gè)檢測(cè)性能和臨床應(yīng)用效能優(yōu)異且穩(wěn)定、易于推廣應(yīng)用的血清HBV RNA定量方法。該方法應(yīng)經(jīng)過國(guó)內(nèi)外不同的大型前瞻性臨床隊(duì)列進(jìn)行多方驗(yàn)證,并廣泛認(rèn)可其臨床應(yīng)用效能,如穩(wěn)定有效地預(yù)測(cè)抗病毒治療應(yīng)答、NAs停藥后復(fù)發(fā)和預(yù)測(cè)肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展等。只有定量的結(jié)果具有穩(wěn)定的臨床應(yīng)用價(jià)值,才是當(dāng)前臨床上亟需的血清HBV RNA定量方法,并且可以基于此方法,對(duì)其他平臺(tái)所建立的方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,從而推動(dòng)血清HBV RNA在臨床上的廣泛應(yīng)用,進(jìn)一步優(yōu)化CHB臨床診療與管理策略。

二、關(guān)鍵問題二:血清HBV RNA可較好地反映cccDNA遺傳組成,但在反映cccDNA拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性方面仍有局限性

檢測(cè)肝內(nèi)cccDNA的數(shù)量和轉(zhuǎn)錄活性可準(zhǔn)確反映CHB患者機(jī)體內(nèi)病毒活性和評(píng)估藥物的抗病毒效果,但cccDNA的檢測(cè)需要進(jìn)行有創(chuàng)的肝活檢,極大地阻礙了其在臨床上的應(yīng)用。因此,亟需尋找可有效反映肝內(nèi)cccDNA狀態(tài)的無創(chuàng)標(biāo)志物。HBV病毒顆粒感染肝細(xì)胞后,部分雙鏈環(huán)狀DNA(relaxed circular DNA,rcDNA)在肝細(xì)胞核內(nèi)修復(fù)形成cccDNA。cccDNA作為原始模板可以轉(zhuǎn)錄成不同類型的HBV RNA,其中pgRNA在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后,一方面會(huì)翻譯成聚合酶蛋白和核心蛋白,另一方面,pgRNA作為逆轉(zhuǎn)錄模板形成rcDNA,而未被逆轉(zhuǎn)錄的pgRNA以裸衣殼形式或者被乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBsAg)包裝成病毒樣顆粒分泌出胞[14]。因此,理論上血清HBV RNA作為肝內(nèi)cccDNA的直接下游產(chǎn)物,可有效反映其遺傳組成、拷貝數(shù)以及轉(zhuǎn)錄活性。

我們團(tuán)隊(duì)前期研究表明,CHB患者血清HBV RNA可準(zhǔn)確反映肝內(nèi)cccDNA的遺傳組成。在HBV復(fù)制過程中,由于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏校對(duì)功能,HBV突變主要發(fā)生在pgRNA逆轉(zhuǎn)錄為rcDNA這一環(huán)節(jié)。攜帶突變r(jià)cDNA可進(jìn)一步合成突變型的cccDNA,接著轉(zhuǎn)錄生成突變型的HBV RNA。因此,我們創(chuàng)新性地以拉米夫定耐藥突變位點(diǎn)(rtM204I/V)的突變作為血清HBV DNA、RNA和肝內(nèi)cccDNA的遺傳標(biāo)記,同時(shí)檢測(cè)CHB患者血清HBV DNA、RNA和肝內(nèi)cccDNA的rtM204I/V突變比率并進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)cccDNA的 rtM204I/V突變比率與血清HBV RNA的突變比率高度相關(guān)(r=0.96,P=0.0001),但與HBV DNA的突變比率無相關(guān)性[15],表明了血清HBV RNA是準(zhǔn)確反映肝內(nèi)cccDNA遺傳組成的重要無創(chuàng)標(biāo)志物。

在反映cccDNA拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性方面,血清HBV RNA在不同疾病階段的CHB患者中的表現(xiàn)不盡相同。在初治患者中,有研究發(fā)現(xiàn)血清HBV RNA與cccDNA拷貝數(shù)呈弱相關(guān)性(r=0.25～0.36)[16, 17],但也有研究報(bào)道二者相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.59～0.78[18, 19]。不同研究報(bào)道的結(jié)果不盡一致,可能與不同研究的人群臨床特征差異性大以及當(dāng)前血清HBV RNA與肝內(nèi)cccDNA的提取與檢測(cè)方法還未完善、統(tǒng)一相關(guān)。對(duì)于NAs治療后的患者,一項(xiàng)小樣本量研究(HBeAg陽性14例,HBeAg陰性17例)報(bào)道,血清HBV RNA水平與cccDNA拷貝數(shù)不存在相關(guān)性,但與cccDNA轉(zhuǎn)錄活性(胞內(nèi)HBV RNA與cccDNA的比值)顯著相關(guān)(r=0.584,P=0.001)[20]。對(duì)于PEG-IFN-α治療患者,一項(xiàng)納入30例經(jīng)PEG-IFN-α治療48周的HBeAg陽性患者的研究顯示,血清HBV RNA與cccDNA具有中度相關(guān)(r=0.728,P<0.001)[18]。但由于Peg-IFN-α一方面可以直接降解cccDNA、HBV RNA[21, 22],另一方面也能通過沉默cccDNA間接下調(diào)HBV RNA水平[23],因此Peg-IFN-α治療后兩者的相關(guān)性仍需要更多研究明確。綜上所述,對(duì)于自然史患者,血清HBV RNA可以一定程度上反映cccDNA水平,但在反映cccDNA轉(zhuǎn)錄活性方面的證據(jù)仍欠缺;對(duì)于經(jīng)治患者,目前的證據(jù)不足以支持血清HBV RNA可較好地反映cccDNA拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性,仍需大樣本量、包含不同治療手段的治療史隊(duì)列進(jìn)一步明確。

三、關(guān)鍵問題三:HBV pgRNA與HCC相關(guān)性已得到初步證實(shí),但其是否驅(qū)動(dòng)HCC的發(fā)生、發(fā)展仍未明確

近期,我們?cè)谝豁?xiàng)大樣本量、前瞻性、觀察性的長(zhǎng)期隨訪抗病毒治療CHB隊(duì)列中發(fā)現(xiàn),血清HBV RNA水平與CHB患者HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)獨(dú)立相關(guān),表明血清HBV RNA水平與血清HBV DNA水平類似,也是能反映CHB疾病進(jìn)展的血清標(biāo)志物[24]。有意思的是,最近的一項(xiàng)研究顯示,對(duì)于接受長(zhǎng)期NAs治療且血清HBV DNA檢測(cè)不到的患者,血清pgRNA水平高者的總生存率較差,肝癌切除后累積復(fù)發(fā)率較高。這項(xiàng)研究的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示,HBV pgRNA自身能直接通過系列機(jī)制促進(jìn)肝癌細(xì)胞的惡性表型[25]。由此我們不禁思考,HBV pgRNA在CHB疾病進(jìn)展過程中所扮演的究竟是一個(gè)風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)志物,還是一個(gè)疾病進(jìn)展直接驅(qū)動(dòng)因素的角色?

目前主流觀點(diǎn)認(rèn)為HBV病毒本身直接促進(jìn)HCC發(fā)生的主要機(jī)制有以下三種:(1)通過將病毒DNA整合到宿主癌基因(如TERT和CCNE1等)中,導(dǎo)致癌基因表達(dá)上調(diào)[26, 27];(2)病毒DNA的整合以及病毒蛋白的表達(dá)導(dǎo)致宿主基因組的不穩(wěn)定性[28];(3)野生型和突變/截短病毒蛋白(HBx、HBc和preS)影響細(xì)胞功能,激活致癌信號(hào)通路并使肝細(xì)胞對(duì)誘變因素敏感[28]。既往沒有文獻(xiàn)表明HBV pgRNA自身具備直接促進(jìn)HCC發(fā)生、發(fā)展的功能,僅有部分文獻(xiàn)顯示HBV pgRNA的一些剪接變異體能夠翻譯形成某些功能蛋白,這些功能蛋白能促進(jìn)HCC發(fā)生、發(fā)展[29, 30]。因此研究HBV pgRNA是否具有直接促進(jìn)HCC發(fā)生的生物學(xué)效應(yīng)之前,也需要排除這些功能蛋白的影響。

探討HBV pgRNA自身是否具有直接促進(jìn)HCC發(fā)生、發(fā)展作用,還有以下幾個(gè)方面值得深入探討:(1)大多數(shù)慢性HBV感染者從感染HBV到形成HCC需要經(jīng)歷較為漫長(zhǎng)的慢性肝炎和肝硬化階段,這也是HBV相關(guān)HCC發(fā)生、發(fā)展的主要驅(qū)動(dòng)因素。而從HBV感染自然史來看,大多數(shù)患者也需要經(jīng)歷時(shí)間較長(zhǎng)的HBeAg陽性慢性感染(免疫耐受)階段,在該階段患者肝內(nèi)病毒復(fù)制活躍,有巨量的HBV pgRNA存在,無明顯或只有輕微炎癥和纖維化,而HCC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)反而較低[31, 32]。盡管HCC發(fā)生是多因素共同作用的結(jié)果,但如果HBV pgRNA自身具有直接促進(jìn)HCC發(fā)生的生物學(xué)效應(yīng),那么如何用這種效應(yīng)去解釋自然史不同階段HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)上的差異?這種效應(yīng)與肝臟炎癥和纖維化等因素間具有何種內(nèi)在聯(lián)系?(2)肝細(xì)胞內(nèi)HBV pgRNA主要有三條去路:1)HBV pgRNA被降解;2)通過逆轉(zhuǎn)錄合成HBV DNA;3)以病毒顆?；蚵阋職ぐ刃问椒置诔霭Ｒ种破渲幸粭l去路將可能導(dǎo)致胞內(nèi)HBV pgRNA蓄積增多。目前,各類臨床試驗(yàn)在研的HBV衣殼抑制劑能抑制pgRNA包裝,從而減少其逆轉(zhuǎn)錄合成HBV DNA。目前尚未發(fā)現(xiàn)衣殼抑制劑對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)pgRNA水平的影響[33],那么衣殼抑制劑治療是否會(huì)導(dǎo)致肝內(nèi)pgRNA水平升高進(jìn)而增加HCC發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn),這值得通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。(3)HBV cccDNA不僅轉(zhuǎn)錄pgRNA,還轉(zhuǎn)錄3.5 kb長(zhǎng)度的precore mRNA。從序列上看,precore mRNA僅在5’端略長(zhǎng)于pgRNA,二者的其余序列完全一致,如果pgRNA能直接驅(qū)動(dòng)HCC發(fā)生、發(fā)展,那么precore mRNA是否也存在類似功能?這也值得通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。

綜上所述,我們認(rèn)為HBV pgRNA是否具有直接促進(jìn)HCC發(fā)生的生物學(xué)作用仍需要更多的實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行論證。從已發(fā)表的文獻(xiàn)來看,血清HBV RNA更多是扮演反映HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的血清標(biāo)志物的角色。需要注意的是,在NAs治療下,血清HBV DNA被抑制轉(zhuǎn)陰而血清HBV RNA仍檢測(cè)陽性,提示了肝內(nèi)cccDNA仍有較高的轉(zhuǎn)錄活性,這樣的患者仍有相對(duì)較高的HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

四、總結(jié)與展望

總體來說,血清HBV RNA作為新型病毒學(xué)標(biāo)志物,已經(jīng)在預(yù)測(cè)NAs停藥后復(fù)發(fā)、預(yù)測(cè)IFN治療應(yīng)答和監(jiān)測(cè)肝臟疾病進(jìn)展等方面體現(xiàn)了潛在的應(yīng)用價(jià)值。但在進(jìn)一步廣泛應(yīng)用于臨床實(shí)踐之前,開發(fā)經(jīng)過不同人群的隊(duì)列驗(yàn)證并被廣泛認(rèn)可的血清HBV RNA提取和檢測(cè)方法是亟待解決的關(guān)鍵問題之一。在臨床應(yīng)用方面,血清HBV RNA作為cccDNA的下游產(chǎn)物,可以較好地反映cccDNA遺傳組成,但在反映cccDNA的拷貝數(shù)和轉(zhuǎn)錄活性上有待在更大樣本量和不同臨床場(chǎng)景中研究。近年有研究發(fā)現(xiàn),血清HBV RNA可預(yù)測(cè)HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn),但HBV RNA本身是否具有直接的促癌作用仍需要進(jìn)行更深入的臨床和基礎(chǔ)研究。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：黎婉瑩、劉詩和申笙負(fù)責(zé)撰寫論文及文獻(xiàn)收集;孫劍負(fù)責(zé)擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。