基因編輯豬在異種肝臟移植中的研究進(jìn)展

張家騰 李家琦 武羽 段鐘平 陳煜

終末期肝病(ESLD)泛指各種肝臟損傷導(dǎo)致的肝病晚期階段。每年約有200萬人因肝病死亡,肝移植是治療終末期肝病最有效的方法。隨著肝移植技術(shù)、免疫抑制劑和醫(yī)療保健等方面的發(fā)展,肝移植術(shù)后存活率逐步提高,其需求也在不斷增加[1]。然而,由于供肝的數(shù)量極大地受限于傳統(tǒng)觀念、倫理道德等多重社會(huì)因素的影響,器官捐獻(xiàn)者短缺已成為我國(guó)乃至全世界共同面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn),潛在的移植受者數(shù)量更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過肝臟供體數(shù)量。肝移植為第二常見的實(shí)體器官移植,但根據(jù)記錄在案的移植器官統(tǒng)計(jì),全球只有不到10%的移植需求得到滿足[1]。當(dāng)前供肝數(shù)量的匱乏已成為阻礙肝移植發(fā)展的最大問題,因此開發(fā)其他來源的肝臟替代方案至關(guān)重要,而異種肝臟移植的發(fā)展為終末期肝病患者帶來了新的希望。近年來,豬在異種器官移植領(lǐng)域的應(yīng)用不斷擴(kuò)大?；蚓庉嫾夹g(shù)進(jìn)步的同時(shí),基因編輯豬的構(gòu)建方案也在不斷優(yōu)化,這極大地推動(dòng)了異種器官移植的發(fā)展。

一、 異種器官移植的供體選擇

靈長(zhǎng)類動(dòng)物中,類人猿、黑猩猩、狒狒、猴子等,進(jìn)化程度與人類更為接近,理論上,這些高級(jí)的非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物是用于異種器官移植的理想供體來源,但由于其數(shù)量少、價(jià)格貴,繁殖周期長(zhǎng)、飼養(yǎng)困難,以及倫理等問題不適合作為異種器官移植的供體來源。小型豬是一種新型醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,廣泛應(yīng)用于心血管疾病、消化系統(tǒng)疾病的研究及器官異種移植等領(lǐng)域[2]。小型豬品種資源豐富、體型小、易繁殖、存活率高、遺傳性狀穩(wěn)定,且在遺傳學(xué)、解剖結(jié)構(gòu)、器官大小、營(yíng)養(yǎng)代謝及生理生化特征方面與人的相似性較大,具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。同時(shí),由于豬與人類在進(jìn)化上的親緣關(guān)系相距較遠(yuǎn),與使用非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物相比,受者患人畜共患病的風(fēng)險(xiǎn)較小,引發(fā)的倫理爭(zhēng)議也較少。重要的是,豬也易于進(jìn)行基因修飾,因此目前被認(rèn)為是異種器官移植的最佳供體選擇。

二、 異種器官移植面臨的問題

利用豬作為潛在的人類移植器官的供體選擇是解決當(dāng)前器官嚴(yán)重短缺問題的重要途徑,但同時(shí)也面臨著諸多挑戰(zhàn):①受體與供體之間的高免疫不相容性是異種器官移植的主要障礙。主要包括超急性排斥反應(yīng)(HAR)、急性體液異種移植排斥反應(yīng)(AHXR)、急性細(xì)胞排斥反應(yīng)(ACR)、慢性排斥反應(yīng)。②潛在的豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒(PERVs)的跨物種感染風(fēng)險(xiǎn),也是異種器官移植的必要安全考慮。③凝血功能障礙:血小板減少癥和凝血失調(diào)。

超急性排斥反應(yīng)通常發(fā)生在移植后數(shù)分鐘或數(shù)小時(shí)內(nèi),由α1,3-半乳糖基抗原介導(dǎo),當(dāng)異種移植物移植到受者體內(nèi)時(shí),移植物細(xì)胞表面抗原與受者體內(nèi)的抗體IgG和IgM結(jié)合,形成抗原抗體復(fù)合物,從而激活補(bǔ)體調(diào)控系統(tǒng),導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成、出血性壞死、內(nèi)皮細(xì)胞損傷以及IgM、IgG沉積等[3]。急性體液異種移植排斥反應(yīng),又稱急性血管排斥反應(yīng),在移植后2～3 d內(nèi)發(fā)生,其與激活內(nèi)皮的抗體和補(bǔ)體的沉積以及先天免疫細(xì)胞(例如多形核白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK cell))的浸潤(rùn)作用有關(guān)。急性細(xì)胞排斥反應(yīng),又稱急性排斥反應(yīng),其發(fā)生早期是由細(xì)胞免疫導(dǎo)致,主要由NK細(xì)胞和主要組織相容性復(fù)合物(MHC)激活T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)。ACR的形成主要取決于多肽的類型,例如,Ⅰ類MHC主要激活CD4+T細(xì)胞,Ⅱ型MHC主要激活CD8+T細(xì)胞。慢性排斥反應(yīng)即移植物血管病變,一般發(fā)生在移植術(shù)后數(shù)月或數(shù)年內(nèi),也可發(fā)生在急性排斥反應(yīng)后,以體液免疫為主,產(chǎn)生血管周圍炎癥,阻塞血管,導(dǎo)致移植物功能逐漸下降。

豬器官攜帶的病毒和微生物對(duì)移植受體存在的潛在危害性也是值得關(guān)注的一個(gè)問題。通過改善豬群的飼養(yǎng)環(huán)境,定期進(jìn)行安全監(jiān)測(cè)可以有效規(guī)避巨細(xì)胞病毒、EB病毒、西尼羅病毒、狂犬病毒等病毒感染的發(fā)生。然而豬體內(nèi)還存在一種單鏈正鏈RNA病毒,即豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒,它可以將RNA轉(zhuǎn)為DNA并整合到豬基因組中。豬體內(nèi)部分細(xì)胞可以釋放PERV顆粒,在體外感染某些人源細(xì)胞,使受體有致病和感染的可能[4]。盡管目前還未有異種器官移植感染PERV的報(bào)道,但仍舊存在病毒傳播及引發(fā)疾病的風(fēng)險(xiǎn),因此這也是需要解決的問題之一。

由于血小板丟失導(dǎo)致的致命性出血及凝血失調(diào)等問題尚未解決,豬異種肝臟移植的存活時(shí)間限制在1個(gè)月內(nèi)[5]。目前認(rèn)為,異種肝臟移植后嚴(yán)重的血小板減少是由于血小板過度活化/聚集和異常的血小板隔離/吞噬作用造成的。凝血級(jí)聯(lián)的異常激活是超急性排斥反應(yīng)的標(biāo)志特征。然而,在豬-非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物肝臟異種移植中,即使沒有發(fā)生超急性排斥反應(yīng),也會(huì)發(fā)生凝血失調(diào)。與心臟或腎臟異種移植相比,凝血失調(diào)對(duì)肝臟異種移植來說是一個(gè)更大的障礙[6]。研究顯示,肝臟異種移植中凝血失調(diào)的影響因素包括組織因子的遺傳不一致、外源性途徑的組成性激活以及凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物中的物種不相容性[6]。

三、基因編輯豬的構(gòu)建

由于免疫補(bǔ)體系統(tǒng)的激活、凝血系統(tǒng)紊亂及豬器官本身攜帶病毒等問題的存在,限制了異種器官移植的應(yīng)用。基因編輯技術(shù)的發(fā)展對(duì)解決這些問題做出了巨大貢獻(xiàn)。從最初的通過原核顯微注射、精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移和移動(dòng)遺傳元件的整合等方法隨機(jī)插入外源 DNA,再到通過體細(xì)胞中的同源重組和體細(xì)胞核移植來操縱內(nèi)源基因[7],已成功構(gòu)建了多種基因編輯豬,但上述技術(shù)在豬成纖維細(xì)胞中獲得基因敲除的效率仍非常低。

近年來,核酸酶介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)大大提高了獲得基因敲除細(xì)胞的效率,使用鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣核酸內(nèi)切酶(TALENs)和成簇的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列/Cas9系統(tǒng)(CRISPR/Cas9)等新型可編程DNA核酸酶在基因組編輯方面的應(yīng)用取得了重大進(jìn)展[8]。這些工具能夠通過靶向特定序列來精確切割DNA,并通過切斷特定基因組位點(diǎn)的雙鏈來添加、去除或替換核苷酸。特別是CRISPR/Cas9技術(shù),與其他基因組編輯工具依賴于蛋白質(zhì)-DNA相互作用不同,該技術(shù)依賴于RNA-DNA結(jié)合,這使該系統(tǒng)具有更高的靈活性和保真度,同時(shí)操作相對(duì)簡(jiǎn)單且更具有成本效益,在構(gòu)建基因編輯豬中發(fā)揮重要作用。

通過針對(duì)異種抗原分子、免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子、凝血反應(yīng)調(diào)節(jié)因子等靶基因,可構(gòu)建轉(zhuǎn)基因豬。研究發(fā)現(xiàn),豬器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞存在大量的α-1,3-半乳糖抗原,其合成由α-1,3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶(GGTA1)催化,該酶在人體中不存在,因此會(huì)被人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗α-1,3半乳糖抗體識(shí)別,從而發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。敲除該基因,獲得轉(zhuǎn)基因豬(α-1,3-galactosyltransferase gene knockout,GTKO),可有效規(guī)避此情況的發(fā)生[9]。有試驗(yàn)顯示,使用GTKO豬的心臟并結(jié)合免疫抑制劑,移植到狒狒體內(nèi),受者存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)179 d[10]。研究者們還利用其他基因如CD46、CD55、CD59、CD39、CD47等,對(duì)豬進(jìn)行基因改造,從而延遲異種移植排斥和/或急性細(xì)胞排斥、抑制補(bǔ)體活性[11]。此外,在供體豬中也已通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除了PERV,實(shí)現(xiàn)了PERV敲除豬的選育[12, 13]?？傊?利用基因修飾豬作為器官供體并合用免疫抑制劑,可以有效降低異種器官移植免疫排斥反應(yīng),這也是目前異種器官移植的主要發(fā)展途徑。

四、 基因編輯豬在異種肝臟移植中的研究進(jìn)展

基因編輯豬模型在推動(dòng)異種肝臟移植領(lǐng)域發(fā)揮了極其重要的作用[14]。2000年,有研究者使用表達(dá)CD55的轉(zhuǎn)基因豬首次進(jìn)行了基因編輯豬-狒狒原位異種肝移植,并與未修飾豬進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果顯示,使用未修飾豬進(jìn)行肝臟移植的三只對(duì)照動(dòng)物由于發(fā)生HAR,存活時(shí)間不到12 h,而使用轉(zhuǎn)基因肝臟的動(dòng)物在移植術(shù)后未發(fā)生HAR,最終狒狒存活8 d[15]。此后,又有研究人員使用表達(dá)人補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白CD55、CD59和α1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的多轉(zhuǎn)基因豬在狒狒中進(jìn)行肝臟原位異種移植,最終結(jié)果顯示未發(fā)生HAR,但由于受體發(fā)生血栓,存活時(shí)間僅為13～24 h[16]。2010年,研究者首次進(jìn)行了GGTA1基因敲除豬-狒狒異種肝臟移植的試驗(yàn),并對(duì)移植肝臟的凝血功能、解毒功能及補(bǔ)體活性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示供體肝臟可以正常發(fā)揮肝臟功能,最終由于血小板減少引發(fā)了嚴(yán)重的自發(fā)性出血,存活時(shí)間為4～7 d[17]。研究表明,GTKO豬進(jìn)行異種肝臟移植能有效延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間,而目前影響移植物存活的主要因素是血小板減少導(dǎo)致微血管病變及凝血功能紊亂[17]。2012年,有研究者使用GTKO豬進(jìn)行肝臟異種移植,并對(duì)受者進(jìn)行術(shù)后Amicar治療(適用于預(yù)防及治療血纖維蛋白溶解亢進(jìn)引起的各種出血),以抑制纖維蛋白溶解,最終將受者的生存時(shí)間延長(zhǎng)至9 d[18]。

直到2016年,有研究者利用GTKO豬,并在移植后連續(xù)輸注人凝血酶原復(fù)合物濃縮物以及添加貝拉西普進(jìn)行肝臟原位異種移植,使受者存活了25 d[19]。一年后,該研究團(tuán)隊(duì)保持其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)不變,僅用抗CD40單抗取代貝拉西普作為共刺激的主要藥物,用來延長(zhǎng)異種肝臟移植的生存時(shí)間,試驗(yàn)過程中未出現(xiàn)排斥反應(yīng)、炎癥或血栓性微血管病,最終受體由于足底潰瘍和肝功能升高需要進(jìn)行安樂死,但生存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)29 d,這也是目前豬肝異種移植的最長(zhǎng)時(shí)間記錄[5]。然而盡管基因編輯豬的技術(shù)不斷發(fā)展,但血小板減少癥和凝血失調(diào)的存在仍極大地限制了臨床前異種肝臟移植的存活時(shí)間。

五、 展望

隨著器官移植技術(shù)的不斷進(jìn)步,供體資源緊缺已成為日益嚴(yán)峻的全球性問題,嚴(yán)重阻礙了器官移植的發(fā)展。以基因編輯豬為供體的異種器官移植有望解決器官供需失衡的問題。近年來,基因編輯技術(shù)發(fā)展迅速,通過敲除異種抗原基因,轉(zhuǎn)入表達(dá)人體補(bǔ)體調(diào)節(jié)基因,敲除免疫激活因子,表達(dá)抗凝血/抗血栓調(diào)控因子,可以有效克服免疫排斥反應(yīng),同時(shí) PERV感染問題也已得到解決,將多種基因修飾豬與有前景的新藥理學(xué)策略相結(jié)合,可能會(huì)延長(zhǎng)受體的生存時(shí)間。雖然目前臨床異種移植尚未成功,但異種器官移植為解決人類器官供體資源匱乏的問題提供了新的可能,也為終末期肝病患者的治療帶來了一線曙光。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。