基因突變通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑介導(dǎo)慢性胰腺炎發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展

馬立哲 孫曉茹 劉俊岑 劉牧云 孫暢

1海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200433；2中國(guó)人民解放軍海軍第905醫(yī)院消化內(nèi)科，上海 200050

【提要】 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在慢性胰腺炎發(fā)生中具有重要作用。包括PRSS1、SPINK1、CPA1、CEL等易感基因可能通過(guò)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而介導(dǎo)慢性胰腺炎的發(fā)生。本文圍繞基因突變通過(guò)該途徑介導(dǎo)慢性胰腺炎的發(fā)生進(jìn)行綜述。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是細(xì)胞的一種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有特殊膜結(jié)構(gòu)，參與蛋白質(zhì)的翻譯、翻譯后加工及質(zhì)量控制等生理過(guò)程。蛋白質(zhì)的翻譯后加工復(fù)雜且極易出錯(cuò)，許多生理或病理?yè)p傷（如葡萄糖剝奪、氧化損傷、基因突變表達(dá)錯(cuò)誤折疊蛋白、分泌蛋白合成的簡(jiǎn)單增加等）均易導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工能力達(dá)到飽和，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[1]。輕中度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行代償達(dá)到細(xì)胞自適應(yīng)的目的，而重度或長(zhǎng)期的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則使細(xì)胞從適應(yīng)程序轉(zhuǎn)至凋亡程序，以清除不可逆損傷的細(xì)胞[2-3]。

UPR信號(hào)通路主要包括3個(gè)分支，分別由跨膜蛋白肌醇依賴酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和活化轉(zhuǎn)錄因子6（activating transcription factor 6，ATF6）啟動(dòng)[4]。當(dāng)未折疊蛋白或錯(cuò)誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)過(guò)度累積超過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)負(fù)荷時(shí)，分子伴侶蛋白BiP與IRE1、PERK及ATF6解離并導(dǎo)致其活化；但也有學(xué)者提出，單獨(dú)的BiP解離并不總是能夠激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受器，未折疊蛋白質(zhì)和感受器或其他機(jī)制的直接作用也可能調(diào)節(jié)感受器的活化[5-6]。其中，IRE1、PERK從無(wú)活性的單體構(gòu)象轉(zhuǎn)變成可自磷酸化的活性寡聚體形式誘導(dǎo)下游X盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein 1, XBP1）、真核翻譯起始因子2A（eukaryotic initiation factor 2A, eIF2a）等信號(hào)的活化，而ATF6被切割成活性單體形式發(fā)揮作用[7]。激活的UPR信號(hào)試圖通過(guò)翻譯衰減、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解等多種途徑轉(zhuǎn)變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[8-9]；若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)不能被轉(zhuǎn)變或持續(xù)存在，則UPR信號(hào)可能通過(guò)增加活化轉(zhuǎn)錄因子4(activating transcription factor 4，ATF4)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein, CHOP)等的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞程序性凋亡[10]。

一、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與胰腺功能

胰腺作為人體最大的消化器官，可分泌胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多種消化酶及激素。在所有哺乳動(dòng)物中，腺泡細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成率最高，因此腺泡細(xì)胞依賴于包括UPR在內(nèi)的多種機(jī)制來(lái)維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)及蛋白的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)[11-12]。UPR系統(tǒng)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重要的保護(hù)性反應(yīng)機(jī)制，此前的多種研究已證實(shí)其各成分在腺泡細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中的作用。早期的動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)[13-15]，XBP1缺失的純合子小鼠出現(xiàn)明顯腺泡細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)育不良和酶原顆粒的減少，提示XBP1對(duì)腺泡細(xì)胞的發(fā)育至關(guān)重要；而XBP1缺失的雜合子小鼠顯示出更易感染胰腺炎的表征，且在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中，顯示出XBP1具有保護(hù)腺泡細(xì)胞免受乙醇誘導(dǎo)的胰腺損傷的效應(yīng)。PERK缺失的小鼠表現(xiàn)出胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的明顯擴(kuò)張和碎片化改變，以及胰腺β細(xì)胞和α細(xì)胞的逐步喪失，并發(fā)展為糖尿病，提示其在胰腺發(fā)育中的重要作用，但是其下游靶點(diǎn)分子CHOP的缺失可保護(hù)小鼠胰腺β細(xì)胞的形態(tài)和功能免受高脂肪飲食所造成的損傷[16-17]。

二、基因突變通過(guò)錯(cuò)誤折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制介導(dǎo)CP發(fā)生

自2009年陽(yáng)離子胰蛋白酶原（cationic trypsinogen 1，PRSS1）的突變體可能通過(guò)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)CP的發(fā)生這一機(jī)制被提出后[18]，越來(lái)越多與CP發(fā)生相關(guān)的突變基因被發(fā)現(xiàn)可能通過(guò)該途徑介導(dǎo)疾病的發(fā)生，如：羧肽酶A1（carboxypeptidase A1，CPA1）、人胰凝乳蛋白酶C (chymotrypsin C，CTRC)、絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 1型(serine peptidase inhibitor Kazal type 1，SPINK1)、羧基酯脂肪酶（carboxyl ester lipase，CEL）等[18-22]。

1.PRSS1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：2009年美、德等國(guó)家的學(xué)者率先在動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)，PRSS1突變體p.R116C和p.C139S產(chǎn)生的胰蛋白酶原水平減少至野生型的20%，但細(xì)胞裂解物中胰蛋白酶原水平與野生型接近，區(qū)別是突變型p.R116C以不溶性形式存在，且發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物XBP1在突變體p.R116C和p.C139S中顯著升高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在CP的發(fā)生中具有重要作用[18]。此后的研究又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)p.L104P、p.S127C等突變體均可能通過(guò)胰蛋白酶原的錯(cuò)誤折疊引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制介導(dǎo)CP的發(fā)生[23-24]。在諸多PRSS1突變體中，p.D22G、p.K23R、p.K23_I24insIDK等[25-27]是一類可引起胰蛋白酶原錯(cuò)誤折疊從而導(dǎo)致其提前自激活的突變體，提前激活的胰蛋白酶可能在細(xì)胞內(nèi)被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)識(shí)別為錯(cuò)誤折疊蛋白而被降解，細(xì)胞生物化學(xué)檢測(cè)中僅發(fā)現(xiàn)CHOP等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物升高，因此推測(cè)這種特殊形式的錯(cuò)誤折疊可能與CHOP水平的增高及細(xì)胞凋亡相關(guān)[25]。

2.CPA1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：CPA1前體是胰液中僅次于胰蛋白酶的第二大主要成分，約占胰液總蛋白的10%以上[28]。2013年一項(xiàng)大型研究明確了CPA1功能缺失突變與早發(fā)性CP明顯相關(guān)[19]。該研究還發(fā)現(xiàn)突變的CPA1對(duì)胰蛋白酶的激活、活性及降解無(wú)明顯影響，但存在CPA1蛋白分泌減少、細(xì)胞內(nèi)滯留及XBP1等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物水平升高，提示CPA1部分功能缺失的突變可能通過(guò)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊及其引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)CP的發(fā)生。隨后的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)CPA1突變體p.Ser282Pro、p.K374E等也可能通過(guò)該途徑介導(dǎo)CP的發(fā)生[29]。

3.CTRC與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：正常情況下，CTRC在腸道中被胰蛋白酶激活，從而發(fā)揮控制胰蛋白酶原激活和降解的作用。功能缺失的CTRC突變體引起CTRC分泌減少、酶催化活性降低、抵抗胰蛋白酶激活或胰蛋白酶降解[20]，導(dǎo)致發(fā)生CP的風(fēng)險(xiǎn)增加。部分引起CTRC分泌減少的突變（如p.Q48R、p.G61R和p.A73T）在體外實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[30]，但是由于CTRC與PRSS、CPA1相比，其在胰腺中表達(dá)水平明顯較低，且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的有害影響與錯(cuò)誤折疊的蛋白水平有關(guān)，部分學(xué)者認(rèn)為CTRC功能缺失突變僅引起較輕的蛋白毒性效應(yīng)[31]。

4.SPINK1與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：SPINK1的主要作用是延遲胰蛋白酶原的過(guò)早激活，避免胰腺的自我消化。2000年，N34S突變被發(fā)現(xiàn)是CP的強(qiáng)危險(xiǎn)因素，也是SPINK1最常見的突變之一[32]。隨后眾多研究發(fā)現(xiàn)，N34S突變對(duì)SPINK1的表達(dá)、分泌及對(duì)胰蛋白酶的抑制活性無(wú)明顯影響[33-34]。有學(xué)者提出N34S突變與胰蛋白酶的結(jié)合障礙可能是該突變的致病基礎(chǔ)[35]。而c.194+2T＞C突變體顯示出外顯子3的跳躍和SPINK1的表達(dá)缺失，提示功能缺失的SPINK1是CP發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加的重要機(jī)制[36]。最近的一項(xiàng)研究證明,SPINK1功能缺失突變導(dǎo)致其表達(dá)和分泌減少是主要的致病機(jī)制，一些罕見的直接影響其反應(yīng)位點(diǎn)的突變可能與胰蛋白酶結(jié)合受損相關(guān)[21]。該研究也提示一些罕見突變體（如R65Q）出現(xiàn)SPINK1蛋白分泌減少可能與折疊改變有關(guān)。既往研究也報(bào)道過(guò)一些罕見的SPINK1突變體（如D50E、Y54H）出現(xiàn)SPINK1分泌減少和蛋白細(xì)胞內(nèi)滯留[37-38]，提示可能通過(guò)錯(cuò)誤折疊引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激致病。因此，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在SPINK1突變介導(dǎo)CP發(fā)生機(jī)制中的作用尚待進(jìn)一步研究。

5.CEL與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激：CEL在胰腺腺泡細(xì)胞中大量存在，人CEL基因和一個(gè)串聯(lián)排列的假基因CELP位于9號(hào)染色體q34.13[39]。編碼CELP外顯子11中的單核苷酸缺失（c.1686delT、c.1785delC）導(dǎo)致一種常染色體顯性遺傳病，其特征是早發(fā)性胰腺外分泌功能不全和MODY8（青年成熟型糖尿?。ｋS后發(fā)現(xiàn)p.C563FSX673和p.C596FSX695等單核苷酸缺失的突變可能產(chǎn)生容易在腺泡內(nèi)聚集和滯留的CEL，提示其可能通過(guò)蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)CP的發(fā)生[22,40]。最近的一項(xiàng)研究[41]通過(guò)對(duì)比CEL-16R、CEL-HYB及兩種非同義單核苷酸多態(tài)性CEL-HYB變體（即錯(cuò)義突變c.1463T＞c和c.1643C＞T）的表征進(jìn)行分析顯示，CEL-HYB的錯(cuò)義突變導(dǎo)致CEL蛋白的錯(cuò)誤折疊和在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中滯留增多，同時(shí)發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物BiP升高，提示CEL可能通過(guò)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致CP的發(fā)生。

6.其他：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中新生蛋白質(zhì)的共翻譯和翻譯后修飾對(duì)蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要。過(guò)去幾年的研究證實(shí)了Nε-賴氨酸乙?；诰S持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白的穩(wěn)定性中具有重要作用，部分多肽需經(jīng)過(guò)乙酰化后才能通過(guò)分泌途徑并完全成熟[42-43]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中乙酰輔酶A轉(zhuǎn)運(yùn)體（acetyl-CoA transporter 1，AT-1）通過(guò)調(diào)節(jié)胞質(zhì)中乙酰輔酶A向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)Nε-賴氨酸乙?；^(guò)程的必須原料——乙酰輔酶A的水平，從而參與其中。最近的一項(xiàng)動(dòng)物研究證實(shí)，腺泡特異性敲除AT-1小鼠可以自發(fā)產(chǎn)生輕癥至中度重癥的CP表現(xiàn)，同時(shí)伴有廣泛的未折疊蛋白反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的上調(diào)[44]，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自身的蛋白質(zhì)翻譯及翻譯后修飾的功能障礙在CP發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

綜上所述，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在CP的發(fā)生和發(fā)展中具有重要的作用，故有希望成為CP治療的潛在靶點(diǎn)。在胰腺中大量表達(dá)的PRSS1、CPA1、CEL等蛋白，更可能因?yàn)榛蛲蛔儗?dǎo)致其表達(dá)、分泌過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)滯留，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。SPINK1、CTRC等在胰腺中非大量表達(dá)的蛋白，也可能因?yàn)榛蛲蛔儗?dǎo)致蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中折疊異常引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；但因其表達(dá)量較少，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的水平有限，因此相關(guān)基因?qū)膊“l(fā)生的作用尚待進(jìn)一步研究。

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