草地貪夜蛾與黏蟲腸道微生物的多樣性分析

易春燕 劉旭 王燕平 劉昌華 劉虹伶 呂玉梅 文維書 雷賢富 張翠翠

摘要：通過比較分析對食用玉米葉的草地貪夜蛾與黏蟲體內(nèi)腸道共生菌進(jìn)行比較分析，研究玉米葉內(nèi)生細(xì)菌的組成與草地貪夜蛾和黏蟲腸道微生態(tài)的相互關(guān)系。選用玉米葉飼養(yǎng)的草地貪夜蛾和黏蟲，通過16S rDNA全長擴(kuò)增子測序，比較分析其腸道菌群多樣性和豐富度。由α多樣性研究結(jié)果可知，草地貪夜蛾和黏蟲腸道菌群多樣性、物種豐富度比較接近；β多樣性分析結(jié)果也表明，草地貪夜蛾和黏蟲腸道菌群落結(jié)構(gòu)相似性較高。KEGG通路功能預(yù)測結(jié)果表明，草地貪夜蛾和黏蟲腸道菌群中均以代謝功能占比最高，主要涉及糖類代謝、氨基酸代謝和能量代謝。同樣取食玉米葉的草地貪夜蛾和黏蟲的腸道細(xì)菌在門水平上的核心菌群相同，在屬水平上的優(yōu)勢菌屬豐度和物種多樣性差異不大，群落結(jié)構(gòu)相似度高，菌群功能差異不顯著，其原因可能是物種遺傳特點(diǎn)相似、取食食物和生長環(huán)境中微生物種類相同。

關(guān)鍵詞：草地貪夜蛾；黏蟲；玉米葉；腸道微生物；多樣性；豐度

中圖分類號：S433.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）05-0140-06

草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda），又名秋黏蟲、行軍蟲，屬鱗翅目（Lepidoptera）、夜蛾科（Noctuidae），是原產(chǎn)于美洲的重要的農(nóng)業(yè)入侵害蟲，危害禾本科、豆科和菊科等76科353種植物，具有飛行能力強(qiáng)、繁殖速度快、遷徙速度快等特點(diǎn)。該蟲于2019年1月11日入侵我國云南?。?-4］，隨后迅速擴(kuò)散至26個(gè)?。ㄊ?、區(qū)），對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的威脅。黏蟲（Mythimna seperata）屬鱗翅目（Lepidoptera）夜蛾科（Noctuidae），是一種多食性、暴發(fā)性害蟲，喜食禾本科作物［5-8］。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾與黏蟲形態(tài)相近，常在我國重要的糧食作物玉米上分布，防治不及時(shí)的區(qū)域蟲害發(fā)生嚴(yán)重，影響玉米產(chǎn)量。

有人就草地貪夜蛾與黏蟲的幼蟲和成蟲的形態(tài)差異進(jìn)行了很多研究，為草地貪夜蛾的準(zhǔn)確鑒別和田間調(diào)查提供依據(jù)［9-12］。與草地貪夜蛾、黏蟲外部生態(tài)學(xué)、生物學(xué)研究相比，關(guān)于兩者腸道微生物差異的研究還比較少。大量微生物棲居在昆蟲腸道內(nèi)，形成腸道的微生態(tài)系統(tǒng)，而昆蟲腸道的微生物種類和豐富度因食物、地區(qū)和生長發(fā)育等不同而出現(xiàn)差異，同一地區(qū)以相同食物為食的不同昆蟲間腸道微生物有較大差異［13-15］。徐天梅等發(fā)現(xiàn)，從云南2個(gè)不同地區(qū)采集的草地貪夜蛾腸道內(nèi)可培養(yǎng)的優(yōu)勢菌屬種類有一定的相似性之處［16］。顧偌鋮等采用分離培養(yǎng)鑒定法研究草地貪夜蛾與黏蟲腸道菌群時(shí)發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾和黏蟲雖然生長在相同的環(huán)境中且食用相同的食物，但腸道細(xì)菌組成差異很大［17-18］。草地貪夜蛾、黏蟲的生態(tài)位和寄主范圍相似，這可能使得這2個(gè)物種的腸道微生物具有一定的相似性，兩者同時(shí)入侵將加重危害程度。

本研究比較草地貪夜蛾、黏蟲腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異，預(yù)測其腸道代謝途徑的功能，以獲得它們在腸道微生物和代謝途徑方面的異同，并探討2種害蟲與玉米葉內(nèi)生菌間的關(guān)系，研究結(jié)果將為探索腸道微生物在生物防治方面的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2022年8月從四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院新都基地將草地貪夜蛾與黏蟲采回室內(nèi)，在智能光照培養(yǎng)箱（鴻科GHP-160 中國）中以恒溫（27±1） ℃、相對濕度75%、光—暗周期為16 h—8 h的條件，采用室外種植的玉米葉片在養(yǎng)蟲盒中飼養(yǎng)，分別記為Sf組和Ms組，各取4個(gè)平行。

1.2 腸道解剖

將收集的9日齡試蟲轉(zhuǎn)移至新的離心管中，在飼養(yǎng)環(huán)境下饑餓處理24 h，使試蟲體內(nèi)的腸道菌群達(dá)到相對穩(wěn)定的水平。將饑餓處理后的試蟲采用無菌水清洗1遍，置于75%乙醇中浸泡2 min，然后用無菌水沖洗去除殘留的乙醇。在無菌條件下完整地取出腸道，置于無菌離心管中，采用液氮速凍，于 -80 ℃ 冰箱內(nèi)保存、待用。

1.3 試蟲腸道共生菌群與玉米葉內(nèi)生菌16S rDNA全長擴(kuò)增子測序

采用CTAB法提取試蟲腸道菌群與玉米葉內(nèi)生菌的基因組DNA，測定DNA濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。PCR全長擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，構(gòu)建SMART bel文庫，PacBio上機(jī)進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PacBio下機(jī)數(shù)據(jù)通過美國太平洋生物科學(xué)公司（PacBio）SMRT分析軟件導(dǎo)出bam文件。按barcode區(qū)分樣本后進(jìn)行操作分類單元（OTU）聚類和物種分類分析。根據(jù)OTU聚類結(jié)果，對每個(gè)OTU的代表序列進(jìn)行物種注釋，得到對應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況；對OTU進(jìn)行樣品復(fù)雜度分析（α多樣性指數(shù)），得到樣品內(nèi)物種豐富度、Shannon指數(shù)、辛普森指數(shù)、Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)、覆蓋度和譜系多樣性指數(shù)；對OTU進(jìn)行多序列比對（β多樣性指數(shù)），得到不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異，以無度量多維標(biāo)定法（NMDS）降維圖展示；用LEfSe分析方法對分組樣品的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，以LDA值分布柱狀圖展示。采用KEGG數(shù)據(jù)庫預(yù)測草地貪夜蛾與黏蟲幼蟲腸道菌群功能，通過對每個(gè)OTU進(jìn)行KEGG功能注釋，獲得OTU在KEGG各功能水平的注釋信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌群OTU物種注釋及相對豐度差異

由圖1可知，草地夜貪蛾（Sf）共獲得56 276條有效的細(xì)菌序列和185個(gè)OTU，通過物種注釋后獲得16門和118屬；黏蟲（Ms）共獲得44 591條有效的細(xì)菌序列和232個(gè)OTU，通過物種注釋后獲得11門和93屬；玉米葉（Zml）共獲得51 927條有效的細(xì)菌序列和43個(gè)OTU，通過物種注釋后獲得5門和19屬。草地貪夜蛾、黏蟲和玉米葉片共注釋到19個(gè)門和158個(gè)屬。

由圖2可知，在門分類水平，變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和酸桿菌門（Acidobacteria）是Sf組和Ms組細(xì)菌菌群的主要門。厚壁菌門是Sf組和Ms組中相對豐度最高的門，其在Ms4組中的相對豐度顯著高于其余各組。變形菌門是Sf組和Ms組中的第二大門，其在Ms2組的相對豐度顯著高于其余各組。另外，酸桿菌門在Ms1組的相對豐度顯著高于其余各組，擬桿菌門在Sf2組的相對豐度顯著高于其余各組。玉米葉內(nèi)共生菌主要是藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）（91.07%），其次是厚壁菌門（6.48%）和變形菌門（2.36%），其余門的相對豐度均低于0.1%。

在屬分類水平中，腸球菌屬（Enterococcus）、蒼白桿菌屬（Ochrobarctrum）和沙雷氏菌屬（Serratia）是Sf組和Ms組細(xì)菌菌群的主要屬。由圖3可知，Sf組腸道中腸球菌屬的相對豐度（35.23%）明顯高于Zml和Ms組腸道中的相對豐度（分別為0.01%和30.02%）；在Ms組腸道中沙雷氏菌屬的相對豐度（16.57%）明顯高于Zml和Sf組腸道中的相對豐度（分別為0.01%和7.21%）；而unidentified_Cyanobacteria在Zml和Sf組中均檢測出一定的相對豐度，而在Ms組中未被檢測出。

2.2 草地貪夜蛾與黏蟲腸道微生物豐富度與多樣性分析

對不同樣品在97%一致性閾值下的α多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。由表1可知，草地貪夜蛾腸道菌群的Chao1指數(shù)（79.94）和ACE指數(shù)（81.04）稍低于黏蟲的Chao1指數(shù)（85.56）和ACE指數(shù)（87.91），但不顯著（P>0.05）；草地貪夜蛾與黏蟲的香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普森（Simpson）指數(shù)分別為2.76、2.90和0.73、0.70，各組之間存在差異但不顯著（P>0.05），說明菌群中優(yōu)勢種的集中程度相近。采用Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)來評估草地貪夜蛾與黏蟲腸道細(xì)菌菌群的豐富度和多樣性（表1），Sf組和Ms組細(xì)菌菌群的豐富度存在差異但不顯著（P>0.05）。兩者的譜系多樣性指數(shù)差異不顯著，表明兩者腸道菌群間親緣關(guān)系復(fù)雜度差異不顯著。

對草地貪夜蛾與黏蟲腸道菌群的相異系數(shù)進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖4）表明，它們之間的加權(quán)Unifrac距離和未加權(quán)Unifrac距離分別為0.31和0.65，表明草地貪夜蛾與黏蟲腸道菌群的差異較小。無度量多維標(biāo)定法（NMDS，non-metric multi-dimensional scaling）分析結(jié)果表明各樣本間有些差異，但草地貪夜蛾與黏蟲二者之間的腸道群落結(jié)構(gòu)沒有表現(xiàn)出明顯的分組，相似性較高。

采用Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)評估草地貪夜蛾與黏蟲腸道細(xì)菌菌群的豐富度和多樣性，由表1可知，Sf組和Ms組細(xì)菌菌群的豐富度存在差異，但不顯著（P>0.05）。

2.3 草地貪夜蛾與黏蟲腸道微生物組成差異分析

為找到草地貪夜蛾和黏蟲腸道微生物各分類水平下具有統(tǒng)計(jì)差異的生物標(biāo)志物，本研究做組間t檢測，但各水平均無顯著差異的物種（P>0.05）。故又采用LEfse分析，在組間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的Biomarker。由圖5可知，黏蟲具有顯著差異的為變性菌綱；草地貪夜蛾腸道細(xì)菌具有顯著差異的為蒼白桿菌。

2.4 菌群基因功能預(yù)測

采用KEGG數(shù)據(jù)庫對草地貪夜蛾、黏蟲的腸道菌群測序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著分析，共注釋到6種KEGG一級功能通路。由表2可知，草地貪夜蛾和黏蟲腸道菌群間的各通路無顯著性差異（P>0.05）。其中， 代謝功能通路的豐度占一級功能通路的1/2，說明草地貪夜蛾和黏蟲腸道菌群主要參與代謝反應(yīng)。對二者腸道菌代謝通路的二級通路進(jìn)行注釋，共注釋到12種代謝功能通路（表3）。這些二級通路對應(yīng)的功能中，糖類代謝在二者腸道中的占比為：草地貪夜蛾23.37%、黏蟲22.05%，氨基酸代謝在二者腸道中的占比為：草地貪夜蛾18.45%、黏蟲19.79%。由此可知，草地貪夜蛾和黏蟲均以糖類代謝和氨基酸代謝為最主要的代謝通路，雖然存在數(shù)量上的差異，但趨勢上基本相同。

3 討論

腸道微生物的主要功能是幫助宿主消化食物、幫助宿主降解有毒有害物質(zhì)、增強(qiáng)宿主免疫、提高宿主環(huán)境適應(yīng)性、調(diào)節(jié)宿主行為等［19-23］，大量微生物與昆蟲共生，與宿主協(xié)同進(jìn)化，直接或間接地在宿主生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用。昆蟲腸道微生物結(jié)構(gòu)受遺傳、食物、生存環(huán)境和物種差異等因素影響［24］。在對取食不同寄主植物的3種植食性葉蜂的腸道菌群研究中發(fā)現(xiàn)，3種葉蜂的腸菌群組成與其各自的寄主植物密切相關(guān)［25］，同樣取食椰子樹的椰心葉甲與椰子織蛾，兩者腸道菌群、代謝通路方面存在一定差異［26］。

本研究采用16S rDNA擴(kuò)增子測序法對草地貪夜蛾、黏蟲的腸道菌微生物多樣性進(jìn)行系統(tǒng)分析，共注釋到19門23綱43目77科158屬。草地貪夜蛾和黏蟲的腸道細(xì)菌均以厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢菌門，之前有人也發(fā)現(xiàn)鱗翅目昆蟲腸道微生物主要以變形菌門、放線菌門和厚壁菌門為主［19，27-28］。玉米葉內(nèi)共生菌主要是藍(lán)細(xì)菌門（91.07%），但玉米葉內(nèi)生菌中的厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門及放線菌門是在草地貪夜蛾和黏蟲腸道中檢測到的共有細(xì)菌，表明這些微生物可能源于植物內(nèi)生菌。其中，梭桿菌門、軟壁菌門、浮霉菌門僅在草地貪夜蛾和黏蟲腸道中存在，說明這些微生物不是源于植物內(nèi)生菌，可能是從環(huán)境中獲得的。

有研究表明，鱗翅目昆蟲幼蟲在相同環(huán)境中生長，如果取食相同食物，其腸道微生物的優(yōu)勢屬相同，雖然菌株略有不同，但菌群組成相似度卻很高，推測與其取食食物相同及均歸屬于鱗翅目有關(guān)［29］。本研究的對象草地貪夜蛾和黏蟲均屬鱗翅目昆蟲，其生活環(huán)境、取食食物均相同，α多樣性分析表明，兩者腸道細(xì)菌群多樣性、豐富度比較接近，同時(shí)，β多樣性分析結(jié)果也發(fā)現(xiàn)二者腸道菌群結(jié)構(gòu)相似度較高，這與前人研究結(jié)果［29］相一致。顧偌鋮等就重慶地區(qū)取食高粱的草地貪夜蛾與黏蟲的腸道細(xì)菌進(jìn)行比較，分離鑒定結(jié)果顯示，雖然草地貪夜蛾和玉米黏蟲生長在相同環(huán)境、取食相同的食物，但它們的腸道細(xì)菌組成差異很大，這與本研究結(jié)果不同，可能是因?yàn)槠溲芯康氖且巴夥N，且采用的培養(yǎng)條件單一，而本研究采用實(shí)驗(yàn)室玉米葉片飼養(yǎng)多代草地貪夜蛾和黏蟲，也從側(cè)面顯示腸道共生菌與宿主有協(xié)同進(jìn)化的關(guān)系［17］。

兩者代謝通路方面雖然存在差異但不顯著，其腸道微生物的功能均以代謝為主，其中以糖類代謝和氨基酸代謝所占比例最高。另外，能量代謝也占有較高的比例，表明腸道細(xì)菌在協(xié)助草地貪夜蛾和黏蟲進(jìn)行代謝，并幫助宿主合成自身不能合成的各種物質(zhì)，進(jìn)而在適應(yīng)環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。但是總體上來看，草地貪夜蛾和黏蟲的腸道微生物在代謝通路上具有較高的一致性，可能是由于二者均屬于鱗翅目昆蟲，遺傳特性、食性、習(xí)性較一致。這些微生物在糖類代謝、氨基酸代謝或能量代謝方面可能會與其宿主發(fā)生相互作用。

本研究分析了草地貪夜蛾、黏蟲腸道細(xì)菌及玉米葉內(nèi)生菌的組成，靜態(tài)地反映了二者腸道菌群的情況，初步探究了食物對草地貪夜蛾及黏蟲腸道菌群的影響，為后續(xù)深入研究奠定了基礎(chǔ)。今后筆者將結(jié)合其他技術(shù)手段分析取食不同玉米品種，來自不同生長環(huán)境或不同地點(diǎn)的這2種害蟲腸道微生物組成，及單個(gè)菌群在草地貪夜蛾、黏蟲等宿主腸道微生態(tài)中發(fā)揮的作用。

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