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    甜糯玉米籽粒不同發(fā)育時期基因表達譜和生理生化特性分析

    2024-05-03 09:42:17高志方周玲梁帥強張體付戴惠學朱英趙涵
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2024年5期

    高志方 周玲 梁帥強 張體付 戴惠學 朱英 趙涵

    摘要:利用快中子誘變糯玉米自交系通系5,獲得在同一籽粒上表現(xiàn)甜質(zhì)與糯質(zhì)特性的玉米突變材料,命名為甜糯玉米。以甜糯玉米和通系5為研究對象,利用生理生化測定和轉(zhuǎn)錄組學技術(shù),揭示甜糯玉米在籽粒發(fā)育不同時期的代謝及基因表達差異。結(jié)果表明,在胚乳發(fā)育的各個時間點上甜糯玉米中的淀粉含量均極顯著低于通系5玉米,可溶性總糖、蔗糖含量均極顯著高于通系5玉米。甜糯玉米胚乳的糊化特征參數(shù)均極顯著低于通系5,在授粉后20 d開始呈劇烈增加趨勢。差異轉(zhuǎn)錄組學分析發(fā)現(xiàn),與通系5相比,甜糯玉米中有154個基因在胚乳中的表達顯著下調(diào)。籽粒發(fā)育不同時期的轉(zhuǎn)錄組差異表達分析發(fā)現(xiàn),4 914個基因僅在通系5的籽粒發(fā)育過程中存在差異表達,富集到生物體發(fā)育、RNA修飾等生物過程;1 829個基因僅在甜糯玉米中差異表達,富集到響應(yīng)化學物質(zhì)、響應(yīng)非生物刺激等生物過程。共同差異表達基因在2種玉米中存在動態(tài)表達趨勢差異。本研究結(jié)果為優(yōu)良甜糯玉米品種的培育與改良提供了種質(zhì)材料和遺傳信息。

    關(guān)鍵詞:甜糯玉米;籽粒發(fā)育;物質(zhì)含量;糊化特征;轉(zhuǎn)錄組學;差異表達分析

    中圖分類號:S513.01? 文獻標志碼:A

    文章編號:1002-1302(2024)05-0027-09

    鮮食玉米是指在乳熟后期至蠟熟初期采摘果穗,用于加工或直接食用的玉米[1]。根據(jù)品質(zhì)類型,我國鮮食玉米可分為甜玉米、糯玉米、甜糯玉米及其他適合鮮食的玉米類型[2-3]。甜糯玉米是近些年培育出的一種新型鮮食玉米,由糯玉米和甜質(zhì)雙隱性或多隱性基因純合體雜交而成,同一果穗上表達不同品質(zhì)類型的籽粒使玉米表現(xiàn)出既甜又糯的口感[4-6]。甜糯玉米因其獨特的口感風味,深受廣大消費者喜愛,其市場需求仍在不斷增大[7]。但是現(xiàn)有甜糯玉米中甜、糯品質(zhì)在不同籽粒上的分離,導致其口感和果穗外觀略有欠缺。培育在一個籽粒上同時包含甜與糯特性的玉米品種,能夠有效改良甜糯玉米的食味品質(zhì),滿足人民的消費需求。筆者所在課題組以經(jīng)典糯玉米自交系——通系5作為受體材料,使用快中子輻射誘變技術(shù),獲得同一籽粒上表現(xiàn)甜與糯口感的玉米材料,該材料種子在授粉后甜度逐漸增強,到20 d左右時甜度最高,之后甜度降低糯性增加表現(xiàn)為糯玉米,但是其甜度比普通糯玉米要高,甜糯玉米干籽粒出現(xiàn)皺縮、頂端凹陷的表型。本研究利用生化檢測與RNA-seq技術(shù),揭示甜糯玉米籽粒不同發(fā)育時期的生理生化特性與基因表達譜,為優(yōu)良甜糯玉米品種的培育與改良提供了種質(zhì)材料和遺傳信息。

    1 材料與方法

    1.1 突變體材料獲得與純化

    以通系5糯玉米自交系為受體材料,使用劑量為1.28、2.08、3.99、10.50 Gy的快中子輻射進行誘變,篩選到籽粒頂端有明顯皺縮凹陷的突變體材料。將突變材料于江蘇省南京市江寧橫溪基地連續(xù)自交4代后獲得純合材料。

    1.2 籽粒發(fā)育不同時期樣品取樣

    通系5和甜糯玉米于2023年種植于江蘇省南京市江寧橫溪基地。取自交授粉后14、18、20、22、26 d的玉米穗(保留玉米苞衣),于取樣當天將籽粒去除種皮,收集胚乳樣品,液氮速凍后于-80 ℃儲存。取樣過程中使用的培養(yǎng)皿、樣品收集管均置于冰上,保持低溫環(huán)境。每個材料在各個時間點分別取3個生物學重復(fù)。

    1.3 樣品前處理

    將胚乳樣品在液氮環(huán)境下使用多樣品組織研磨儀(Tissuelyser-48L,凈信,中國)研磨成粉末,用于后期淀粉、蔗糖、可溶性總糖含量測定以及總RNA提?。粚⑴呷闃悠酚谡婵绽鋬龈稍餀C(FD-1A-50,博醫(yī)康,中國)中進行冷凍干燥,然后用研磨儀研磨成粉末,用于支鏈淀粉含量測定以及糊化特性分析。將通系5和甜糯玉米的干種子使用研磨儀研磨成粉末后過100目篩,用于干種子粉的糊化特性分析。

    1.4 玉米淀粉糊化特性分析

    稱取 3 g 玉米干種子或胚乳樣品粉末放入鋁筒中,加入 25 mL 蒸餾水混勻,使用快速黏度分析儀(RVA-3D,紐波特科技,澳大利亞)中標準程序1進行測定[8]。使用TCW軟件進行數(shù)據(jù)分析,每個樣品重復(fù)測定2次。

    1.5 胚乳中物質(zhì)含量分析

    1.5.1 淀粉含量測定

    使用淀粉含量檢測試劑盒(BC0705,索萊寶,中國)測定胚乳樣品中的淀粉含量。液氮環(huán)境下稱取約0.03 g胚乳粉末,按照試劑盒中標準操作流程提取和反應(yīng),使用酶標儀(Cytation5,伯騰,美國)測定反應(yīng)液在620 nm波長處的吸光度。每個時間點的6組樣品分別重復(fù)測定2次。淀粉含量計算:

    淀粉含量(mg/g)=x×V提取÷m÷1.11×F=0.811x÷m×F。(1)

    式中:x為根據(jù)標準曲線計算所得樣品濃度,mg/mL;V提取為提取后體積,0.9 mL;m為樣本質(zhì)量,g;F為樣本稀釋倍數(shù);1.11是此法測得葡萄糖含量換算為淀粉含量的常數(shù),即 111 μg 葡萄糖用蒽酮試劑顯示的顏色相當于100 μg淀粉用蒽酮試劑顯示的顏色。

    1.5.2 支鏈淀粉含量測定

    使用支鏈淀粉含量檢測試劑盒(BC4270,索萊寶,中國),測定胚乳樣品中的支鏈淀粉含量。稱取約0.005 g冷凍干燥粉末樣品,按照試劑盒中標準操作流程提取樣品中支鏈淀粉,與反應(yīng)液反應(yīng)后使用酶標儀測定530 nm 和 755 nm 處的吸光度。每個時間點的6組樣品分別重復(fù)測定2次。支鏈淀粉含量計算:

    支鏈淀粉含量(mg/g)=x×V樣總÷m=5x÷m。(2)

    式中:x為根據(jù)標準曲線計算所得樣品濃度,mg/mL;V樣總為加入試劑盒中試劑四體積,5 mL;m為樣本質(zhì)量,g。

    1.5.3 蔗糖含量測定

    使用植物蔗糖含量檢測試劑盒(BC2465,索萊寶,中國),測定胚乳樣品中的蔗糖含量。液氮環(huán)境下稱取約0.1 g胚乳粉末,按照試劑盒中標準操作流程提取和反應(yīng),使用酶標儀測定反應(yīng)液在480 nm處的吸光度,空白管、標準管和測定管的測定值分別記為 D1、D2 和 D3。每個時間點的6組樣品分別重復(fù)測定2次。蔗糖含量計算:

    蔗糖含量(mg/g)=(C標準管×V1)×(D3-D1)÷(D2-D1)÷(m×V1÷V2)= (D3-D1)÷(D2-D1)÷m。(3)

    式中:C標準管為標準管濃度,1 mg/mL;V1為加入樣本體積,0.025 mL;V2為加入提取液體積,1 mL;m為樣本質(zhì)量,g。

    1.5.4 可溶性總糖含量測定

    使用植物可溶性糖含量檢測試劑盒(BC0035,索萊寶,中國),測定胚乳樣品中的可溶性總糖含量。液氮環(huán)境下稱取約 0.1 g 胚乳粉末,按照試劑盒中標準操作流程提取和反應(yīng),使用酶標儀測定反應(yīng)液在620 nm處的吸光度。每個時間點的6組樣品分別重復(fù)測定2次??扇苄蕴呛坑嬎悖?/p>

    可溶性糖含量(mg/g)=(x×V1)÷(m×V1÷V2)=10x÷m。(4)

    式中:x為根據(jù)標準曲線計算所得樣品濃度,mg/mL;V1為加入樣本體積,0.04 mL;V2為樣本總體積,10 mL;m為樣本質(zhì)量,g。

    1.5.5 數(shù)據(jù)處理與分析

    使用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,利用Origin 2018和illustrator軟件進行相關(guān)分析作圖。

    1.6 胚乳樣品總RNA提取

    使用植物總RNA提取試劑盒(RC411-01,諾唯贊,中國)提取胚乳樣品總RNA。液氮環(huán)境下稱取0.05~0.06 g胚乳樣品粉末,按照試劑盒中提供的操作流程提取總RNA。RNA溶于無RNA酶的雙去離子水中,于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

    1.7 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建與測序

    將RNA樣品進行濃度與完整性檢測,滿足濃度≥60 ng/μL、總量≥2 μg、RNA完整性(RIN)≥5.5的建庫要求后,構(gòu)建有參普通真核轉(zhuǎn)錄組類型文庫,文庫質(zhì)檢合格后,使用Illumina測序平臺進行高通量測序[安諾優(yōu)達基因科技(北京)有限公司]。測序結(jié)果經(jīng)BCL-Convert軟件進行序列堿基識別后轉(zhuǎn)化為原始測序序列。

    1.8 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

    對原始測序序列進行過濾處理,去除接頭污染、低質(zhì)量(Q>30)以及含氮比例大于5%的初始序列,獲得高質(zhì)量的干凈序列進行后續(xù)分析[9]。使用Salmon 軟件(1.1.0版本)將過濾后的序列比對到玉米B73參考基因組(https://download.maizegdb.org/Zm-B73-REFERENCE-GRAMENE-4.0/),使用quasi-mapping方法計算基因的表達量[10-11]。以|log2FC|≥1和P<0.01為標準,用DESeq2 R包在R語言環(huán)境下(4.3.1版)分析各個發(fā)育時間點甜糯玉米相對于通系5的差異表達基因[12]。對相同材料中5個時間點進行兩兩比較,篩選|log2FC|≥1、P<0.01的基因為發(fā)育過程中差異表達的基因。

    1.9 生物信息學分析

    組間差異基因的維恩分析及圖形繪制使用bioinformatics網(wǎng)站的Venn Diagrams在線軟件完成(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/);使用pheatmap包在R語言條件下繪制差異表達基因的熱圖;使用在線AgriGO v2.0工具包對甜糯和通系5玉米發(fā)育過程中特異差異表達基因進行基因本體論(GO)富集分析,顯著富集的條目使用ggplot2(2.2.1版)包在R語言環(huán)境下繪制泡泡圖[13]。發(fā)育過程中的差異基因動態(tài)趨勢分析使用Omicshare在線工具(https://www.omicshare.com/),P<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義,趨勢的數(shù)量選擇為20。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 獲得甜糯玉米突變體材料

    利用快中子技術(shù)誘變通系5獲得1種同一籽粒同時具備甜質(zhì)與糯質(zhì)特性的玉米材料。該突變材料的植株與受體材料通系5無明顯差異,但其成熟的籽粒出現(xiàn)明顯的頂部皺縮表型(圖1)。為分析甜糯玉米種子的糯性是否與通系5玉米有差異,使用快速黏度分析儀檢測甜糯和通系5玉米干種子的糊化特性。由圖2和表1可見,2種玉米種子的糊化曲線相似,糊化特征的各個參數(shù),如峰值黏度、谷值黏度、終值黏度等,無明顯差異。對甜糯和通系5玉米籽粒進行掃描電鏡分析發(fā)現(xiàn),甜糯玉米胚乳中的淀粉粒形狀與通系5相似,均呈現(xiàn)為不規(guī)則型且無明顯的單面,但是淀粉粒體積比通系5的淀粉粒小,顆粒之間空隙更大,排列疏松(圖3)。在對該材料進行品嘗時發(fā)現(xiàn),在籽粒發(fā)育前期(授粉后20 d內(nèi)),其口感類似于甜玉米,而在后期,其糯性增加,但是甜度仍高于通系5。將該材料命名為甜糯玉米。

    2.2 籽粒發(fā)育不同階段的物質(zhì)含量分析

    玉米胚乳是淀粉等貯存物質(zhì)的主要存儲組織,為分析甜糯玉米材料與其受體材料通系5在種子發(fā)育過程中的物質(zhì)差異,選取授粉后14、18、20、22、26 d 的玉米籽粒胚乳進行測試分析。由圖4-a可見,隨授粉天數(shù)增加,甜糯和通系5玉米胚乳中淀粉含量均逐漸增加,但在每個發(fā)育時間點,甜糯玉米胚乳中的淀粉含量均極顯著低于通系5。支鏈淀粉是糯玉米種子中的主要淀粉形式,檢測甜糯和通系5玉米胚乳中的支鏈淀粉含量發(fā)現(xiàn),除授粉后 20 d 外,在其他各發(fā)育時間點上,甜糯玉米胚乳中的支鏈淀粉含量均極顯著低于通系5,尤其是在授粉后14、18 d,甜糯中的支鏈淀粉含量僅為通系5中的63.9%和62.9%(圖4-b)。

    種子中的可溶性糖含量決定玉米種子的甜度。可溶性總糖檢測結(jié)果顯示,隨授粉天數(shù)增加,甜糯和通系5玉米胚乳中的可溶性總糖含量總體呈下降趨勢(圖4-c)。在5個發(fā)育時間點上,甜糯玉米胚乳中的可溶性總糖含量均極顯著高于通系5玉米,尤其是在授粉后26 d時,通系5玉米胚乳中僅能檢測到2.5 mg/g可溶性糖,但在甜糯玉米胚乳中可溶性糖含量為34.2mg/g,即胚乳中的可溶性糖占比為3.4%。與可溶性總糖含量的結(jié)果相似,隨授粉天數(shù)的增加,玉米胚乳中的蔗糖含量總體呈下降趨勢,在5個發(fā)育時間點上,甜糯玉米胚乳中的蔗糖含量均極顯著高于通系5玉米(圖4-d)。

    2.3 籽粒發(fā)育不同階段的糯性分析

    為分析甜糯與通系5玉米籽粒在發(fā)育過程中的糯性差異,檢測了授粉后14、18、20、22、26 d的玉米籽粒胚乳樣品的糊化特性。由表2可見,甜糯玉米胚乳的糊化特征參數(shù),包括峰值黏度、谷值黏度、崩解值、終值黏度、回生值,均極顯著低于通系5。從變化趨勢分析,隨著授粉天數(shù)增加,甜糯玉米胚乳的黏度變化與通系5相似,均總體呈現(xiàn)上升趨勢,在籽粒發(fā)育中后期,峰值黏度、谷值黏度、終值黏度均呈現(xiàn)劇烈增加的趨勢(圖5)。

    2.4 甜糯與通系5玉米胚乳差異表達基因

    為分析甜糯與通系5玉米的基因表達差異,分別提取5個發(fā)育時間點的甜糯與通系5玉米胚乳樣品總RNA,進行測序后獲得RNA-seq數(shù)據(jù)。對過濾后的數(shù)據(jù)進行差異分析后發(fā)現(xiàn),在授粉后14、18、20、22、26 d的甜糯玉米胚乳中分別鑒定到1 417、3 033、3 270、4 237、3 864個差異表達基因(DEGs,|log2FC|≥1,P<0.01),其中有155個基因共同包含在5個時間點的DEGs中(圖6-A)。這些共同包含的DEGs中僅有1個在甜糯玉米胚乳中呈上調(diào)表達,其余基因均為下調(diào)表達(圖6-B)。對155個DEGs進行GO富集分析發(fā)現(xiàn),這些基因未被富集到特定通路中。約2/3的共同包含DEGs在甜糯玉米胚乳中的變化倍數(shù)超過10倍,其中大多數(shù)DEGs在通系5玉米胚乳中鑒定到較高的counts數(shù)(原始堿基計數(shù)),而在甜糯材料中很難被鑒定到。例如一種編碼賴氨酸-組氨酸轉(zhuǎn)運蛋白的基因(Zm00001d002176)在通系5玉米胚乳中鑒定到的counts數(shù)分布在280~550,而在甜糯玉米胚乳中5個時間點最多鑒定到3個counts,表明此基因的表達在甜糯玉米胚乳中被強烈抑制。

    2.5 籽粒發(fā)育不同階段的差異表達基因分析

    為解析甜糯材料的突變?nèi)绾斡绊懽蚜0l(fā)育過程,分別分析了通系5和甜糯玉米胚乳中隨發(fā)育過程發(fā)生顯著變化的基因,即在5個時間點間表達量存在差異的基因(|log2FC|≥1,P<0.01)。由圖7-A可見,在通系5中存在8 412個顯著變化的基因,其中4 914個基因僅在通系5胚乳發(fā)育過程中

    發(fā)生顯著變化,而在甜糯玉米中未發(fā)生變化。對這些基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn),這些基因編碼的蛋白可能參與生物體發(fā)育過程、生殖過程、物質(zhì)轉(zhuǎn)運過程、RNA修飾以及細胞壁組織或生物發(fā)生過程,分布于細胞的各個部位,如細胞膜、線粒體、液泡等(圖7-B)。被顯著富集的分子功能條目僅有2個,即核糖體的結(jié)構(gòu)成分和內(nèi)切酶活性。

    在甜糯玉米中,有5 327個基因的表達量隨胚乳發(fā)育過程發(fā)生顯著變化,其中1 829個基因僅在甜糯玉米中發(fā)生顯著變化。對這些甜糯特異變化基因進行GO富集分析發(fā)現(xiàn),這些基因顯著富集到響應(yīng)化學物質(zhì)、響應(yīng)非生物刺激、響應(yīng)激素、RNA生物合成過程調(diào)節(jié)、小分子生物合成等生物過程(圖7-C)。顯著富集的細胞組分和分子功能條目僅有3個,分別為細胞膜、質(zhì)體以及結(jié)合特意DNA序列的轉(zhuǎn)錄因子活性(轉(zhuǎn)錄因子活性,特異序列DNA結(jié)合)。

    在通系5和甜糯玉米的籽粒發(fā)育過程中有 3 498 個共同顯著變化基因。為分析甜糯材料的突變是否影響胚乳發(fā)育過程中特定基因的表達變化趨勢,本研究對這些共同變化基因分別在通系5和甜糯玉米中的趨勢變化進行分析。由圖8-A可見,在通系5玉米中,有2 398個基因顯著聚類到6種變化趨勢,包括在授粉后18 d出現(xiàn)最低值的P5和P6,在授粉后22 d出現(xiàn)最低值的P8,分別在授粉后20 d和18 d出現(xiàn)峰值的P11和P13以及在胚乳發(fā)育過程中持續(xù)上升的P19。在甜糯玉米中,有 2 433 個基因聚類到5個顯著變化趨勢,其中P8、P13和P19與通系5中聚類的趨勢顯著性相同,而P0(授粉后表達量持續(xù)下降)和P15(先增后降再增,隨后持平)顯著是甜糯玉米特有的。通系5和甜糯玉米雖然聚類到3個相同的動態(tài)趨勢,但在這些趨勢中包含的基因數(shù)量有較大差異,例如,通系5玉米的P13趨勢中包含703個基因,而甜糯玉米中僅包含272個基因;通系5玉米的P19中包含644個基因,而甜糯玉米P19中的基因數(shù)量高達1 199個。通過對相同基因在2種玉米中的變化趨勢所屬類型進行分析,發(fā)現(xiàn)在通系5中變化趨勢屬于P13趨勢的703個基因,在甜糯玉米中分別有177、67、57、92個轉(zhuǎn)變?yōu)镻8、P15、P17、P19趨勢;而在通系5中有124、199、92、57個分別屬于P6、P11、P13、P18趨勢的基因,在甜糯玉米中的變化趨勢都變?yōu)槌掷m(xù)上升趨勢(P19)(圖8-B)。這些結(jié)果表明,甜糯玉米的突變導致玉米胚乳發(fā)育過程中的基因表達趨勢的改變。

    3 討論與結(jié)論

    在玉米籽粒發(fā)育過程中,可溶性糖含量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢,其峰值出現(xiàn)在授粉后8~10 d,在此時,淀粉開始積累,籽粒進入灌漿期[14]。糯玉米籽粒隨著淀粉含量的增加,糯性逐漸增加[15-16]。糯玉米籽粒的糊化特性,尤其是峰值黏度、谷值黏度和終值黏度,與玉米糯性呈顯著正相關(guān)[17]。本研究中,甜糯玉米中的可溶性總糖和蔗糖含量均極顯著高于受體材料通系5(圖4)。授粉后20 d之前,甜糯玉米的糊化特性中的黏度相關(guān)指標均較低,表明其糯性較低(圖5)。因此,在授粉后20 d之前,甜糯玉米籽粒表現(xiàn)偏向于甜玉米,而在20 d之后,甜糯玉米中的淀粉含量劇烈增加,糊化特性中的黏度相關(guān)指標均劇烈升高,其糯性逐漸增加,此時可溶性總糖含量和蔗糖含量仍極顯著高于通系5,表明在20 d之后,玉米籽粒表現(xiàn)出甜與糯共存的特性。

    甜糯玉米與通系5的差異轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),有154個基因的表達在甜糯玉米胚乳中被強烈抑制(圖6),這些基因的發(fā)掘可為后期甜糯基因的定位與遺傳機理的解析提供參考。對籽粒發(fā)育不同階段的差異表達基因進行分析發(fā)現(xiàn),通系5玉米胚乳中鑒定到8 412個基因在授粉后的不同階段存在差異表達,而甜糯玉米中的差異基因有5 327個,其數(shù)量明顯少于通系5(圖7)。4 914個基因僅在通系5胚乳發(fā)育過程中顯著變化,而在甜糯玉米中未發(fā)生顯著變化,暗示這些基因可能是甜糯基因的下游基因,在甜糯基因功能缺失后,這些基因在胚乳發(fā)育過程中無法被正常動員。1 829個基因僅在甜糯玉米中存在顯著變化,這些基因顯著富集到響應(yīng)非生物刺激、響應(yīng)激素、免疫反應(yīng)、過氧化氫代謝過程等生物過程,表明甜糯基因突變可能導致大量抗逆過程被調(diào)動。

    綜上,本研究揭示了甜糯玉米在授粉后不同發(fā)育時期表現(xiàn)甜與甜糯特性差異的生理生化機制,通過籽粒發(fā)育不同時期差異轉(zhuǎn)錄組學分析,獲得甜糯玉米與其受體材料通系5的差異基因表達譜,可為后期甜糯基因定位與功能分析以及優(yōu)良甜糯玉米品種的培育與改良提供數(shù)據(jù)支撐。

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