宏基因組測序技術(shù)（mNGS）對肺泡灌洗液病原的診斷價值

李加雄，金曉菲，盧惠倫

（廣東省深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 深圳 518000）

肺部感染是臨床上常見的疾病之一，其治療的關(guān)鍵在于迅速準(zhǔn)確地確定病原體，以便選擇合適的抗生素治療方案[1]。傳統(tǒng)的病原體檢測方法，如涂片染色、傳統(tǒng)培養(yǎng)法和PCR 檢測，雖然具有一定的準(zhǔn)確性，但仍存在較多局限性，包括檢測周期長、部分病原體難以培養(yǎng)、漏檢率較高等問題[2-3]。mNGS 作為一種高通量測序方法，已經(jīng)在病原體檢測領(lǐng)域顯示出潛在的優(yōu)勢[4]。本研究旨在評估m(xù)NGS 技術(shù)在肺泡灌洗液樣本中用于病原體檢測的診斷價值，比較其與傳統(tǒng)方法的檢出率，并分析mNGS 檢測結(jié)果對肺部感染患者臨床治療的指導(dǎo)作用。通過對病原體的快速、全面檢測，希望能夠提高肺部感染的早期診斷率，減少不必要的抗生素使用，改善患者的預(yù)后?，F(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

研究納入2021 年5 月至2023 年5 月期間收治的86例行支氣管肺泡灌洗的肺部感染患者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡在18 歲以上；伴有急性肺部感染癥狀，包括但不限于發(fā)熱、咳嗽、呼吸急促等；需要進行支氣管肺泡灌洗以明確病原體的診斷；患者或其法定監(jiān)護人已簽署知情同意書并同意參加研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：已明確診斷為非感染性肺部疾病，如支氣管哮喘、肺部腫瘤等；患有免疫抑制性疾病，如艾滋病、白血病等；已接受抗生素治療超過48 h 的患者；曾經(jīng)接受過肺移植或免疫抑制治療的患者；存在嚴重的心臟、肝臟、腎臟或其他重要器官功能不全的患者；無法提供足夠的肺泡灌洗液樣本的患者。86 例患者的男女比例為49/37；年齡37 ～78（54.38±13.27）歲；病程4 ～16（7.81±2.32）d；嚴重程度：輕度、中度和重度患者比例為31/42/13。

1.2 檢測方法

1.2.1 mNGS 檢測 回收10 mL 左右中段灌洗液置入滅菌容器，在56℃環(huán)境下對灌洗液進行干浴滅菌，取600 μL破壁，通過磁珠法提取核酸，嚴格遵循制造商的操作說明，以分離并純化DNA 和RNA。獲得DNA/RNA 后構(gòu)建文庫，以便進行高通量測序。這包括將核酸片段逐漸連接到測序適配器上，形成文庫。文庫構(gòu)建過程包括末端修復(fù)、A 尾加在3’末端、連接適配器和PCR 擴增等步驟。構(gòu)建的文庫隨后被送入Illumina MiSeq 平臺高通量測序儀，進行測序。在測序儀中，DNA/RNA 片段的堿基序列被逐一讀取。獲得測序數(shù)據(jù)后，進行一系列生物信息學(xué)分析，包括質(zhì)量控制、序列比對、物種鑒定和功能注釋，識別樣本中的病原體，確定其種屬、亞種和潛在的耐藥基因，并列出覆蓋度、Reads 數(shù)、測序深度等參數(shù)。

1.2.2 傳統(tǒng)方法檢測 回收10 mL 左右中段灌洗液進行離心處理，將顆粒物分離出來獲得上清液，取1/2 上清液制備涂片，予以Wright-吉姆薩染色，以可視化細菌、真菌或細胞。取1/2 上清液進行細菌或真菌的傳統(tǒng)培養(yǎng)，行細菌培養(yǎng)時將樣本接種到麥康凱瓊脂、哥倫比亞血瓊脂、巧克力瓊脂平板上，并在35℃條件下孵育，以促進病原體的生長。行真菌培養(yǎng)時則將樣本接種到沙保羅瓊脂平板上，置于35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)后觀察培養(yǎng)基上的菌落形成，并在自動質(zhì)譜檢測系統(tǒng)上進一步鑒定菌株。

1.3 觀察指標(biāo)

（1）比較兩種檢測方法的總檢測準(zhǔn)確率、混合感染檢測準(zhǔn)確率、耶氏肺孢子菌及結(jié)核分枝桿菌檢測準(zhǔn)確率。（2）對比mNGS 陽性組與陰性組患者的預(yù)后指標(biāo)，包括抗生素調(diào)整率、CRP 水平、平均住院時間、機械通氣時間等。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 比較病原菌檢出情況

最終診斷結(jié)果為陽性65 例，陰性21 例，其中混合感染共計49 例；共檢出164 株病原體，其中耶氏肺孢子菌、結(jié)核分枝桿菌比例為13/7。mNGS 的總檢測準(zhǔn)確率明顯高于傳統(tǒng)檢測方法（P＜0.05）；在耶氏肺孢子菌檢測準(zhǔn)確率的比較上，mNGS 檢測的準(zhǔn)確率均明顯高于傳統(tǒng)檢測方法（P＜0.05），但在結(jié)核分枝桿菌檢測準(zhǔn)確率的比較上，mNGS 與傳統(tǒng)檢測方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在真菌、細菌混合感染的檢測準(zhǔn)確率比較上，mNGS 檢測明顯高于傳統(tǒng)檢測方法（P＜0.05）。詳見表1 ～4。

表1 mNGS 檢測結(jié)果（例）

表2 mNGS 檢測結(jié)果（例）

表3 傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果（例）

表4 傳統(tǒng)方法檢測結(jié)果（例）

2.2 比較mNGS 陽性組與陰性組基線資料

mNGS 陽性組與陰性組的基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表5。

表5 兩組基線資料對比

2.3 比較mNGS 陽性組與陰性組預(yù)后指標(biāo)

在抗生素調(diào)整率、CRP 水平、平均住院時間、機械通氣時間等預(yù)后指標(biāo)的比較上，mNGS 陽性組與陰性組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表6。

表6 兩組預(yù)后指標(biāo)對比

3 討論

肺部感染患者由于病情反復(fù)，加之對抗生素藥物的濫用，其體內(nèi)病原微生物也會隨之出現(xiàn)變化，隨著疾病的進一步發(fā)展，會對患者肺部組織產(chǎn)生嚴重損害，直接影響其生活質(zhì)量，嚴重情況下還會導(dǎo)致患者死亡[5]。現(xiàn)階段，肺部感染性疾病已發(fā)展成為常見的致死性疾病之一。肺部感染的病原體較為復(fù)雜，通常混合了細菌、真菌、病毒以及寄生蟲等，予以早期針對性治療往往會收獲較為理想的治療效果[6]。但僅憑患者體征、臨床表現(xiàn)及影像學(xué)表現(xiàn)難以在早期快速、準(zhǔn)確診斷，因此，需通過實驗室檢測進行輔助診斷，以明確具體的病原體感染類型及疾病嚴重程度，避免出現(xiàn)誤診情況[7]。同時早期明確診斷也是指導(dǎo)抗感染藥科學(xué)應(yīng)用的重要依據(jù)，對改善患者病情大有裨益。

傳統(tǒng)涂片染色方法的靈敏度和特異性有限，對于病原體種類和數(shù)量的檢測準(zhǔn)確性不高；傳統(tǒng)培養(yǎng)法雖然可以培養(yǎng)出部分病原體，但是所需時間較長，且部分病原體難以培養(yǎng)；PCR 檢測雖然具有較高的靈敏度和特異性，但是需要針對不同的病原體分別設(shè)計不同的引物，且對于部分病原體可能無法檢測[8]。因此，對于肺部感染的病原體檢測，需要一種更快速、更準(zhǔn)確的方法。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，mNGS 技術(shù)為病原體檢測提供了新的途徑。mNGS 是一種高通量測序方法，可以對樣本進行全面的基因測序，從而檢測出其中的病原體種類和基因序列。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，mNGS 具有更高的靈敏度和特異性，可以檢測出更多的病原體種類和基因序列，且檢測時間較短[9]。因此，mNGS 技術(shù)的發(fā)展為肺部感染的病原體檢測提供了新的可能性。

本研究結(jié)果顯示，最終診斷結(jié)果為陽性65 例，陰性21 例，其中混合感染共計49 例；共檢出164 株病原體，其中耶氏肺孢子菌、結(jié)核分枝桿菌比例為13/7。mNGS的總檢測準(zhǔn)確率明顯高于傳統(tǒng)檢測方法（P＜0.05）。這個結(jié)果表明，mNGS 在病原體檢測中的總體性能優(yōu)于傳統(tǒng)方法。這主要歸功于mNGS 采用的高通量測序技術(shù)，使其能夠全面、快速、準(zhǔn)確地檢測出病原體。此外，mNGS 無需培養(yǎng)或染色，避免了傳統(tǒng)方法中存在的漏檢或誤診的可能性，也是提高總體準(zhǔn)確率的重要原因之一[10]。在耶氏肺孢子菌檢測準(zhǔn)確率的比較上，mNGS 檢測的準(zhǔn)確率明顯高于傳統(tǒng)檢測方法（P＜0.05）。這表明mNGS 在耶氏肺孢子菌的檢測上具有更高的準(zhǔn)確性。這可能是因為耶氏肺孢子菌是一種難以培養(yǎng)的病原體，傳統(tǒng)方法存在一定的漏檢率。而mNGS 采用高通量測序技術(shù)，能夠直接檢測出病原體基因序列，提高了檢出率和準(zhǔn)確性。但在結(jié)核分枝桿菌檢測準(zhǔn)確率的比較上，mNGS 與傳統(tǒng)檢測方法差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這個結(jié)果表明，mNGS 在結(jié)核分枝桿菌的檢測上與傳統(tǒng)方法相比沒有明顯優(yōu)勢。這可能是因為結(jié)核分枝桿菌是一種常見的病原體，傳統(tǒng)方法已經(jīng)具有一定的檢出率和準(zhǔn)確性。此外，結(jié)核分枝桿菌的基因序列較為復(fù)雜，可能給mNGS 的檢測帶來一定的難度。在真菌、細菌混合感染的檢測準(zhǔn)確率比較上，mNGS 檢測明顯高于傳統(tǒng)檢測方法（P＜0.05）。這表明mNGS 在混合感染的檢測上具有更高的準(zhǔn)確性。這可能是因為真菌和細菌的檢測需要不同的方法，傳統(tǒng)方法可能存在一定的交叉干擾或漏檢率。而mNGS 能夠同時對多種病原體進行檢測，提高了檢出率和準(zhǔn)確性。此外，mNGS 的生物信息學(xué)分析能夠?qū)y序數(shù)據(jù)進行深入挖掘和分析，更容易識別出不同的病原體種類和基因序列，也是提高混合感染檢出率的重要原因之一[11]?？傊琺NGS 在肺部感染病原體檢測中具有全面、快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點，能夠提高總體檢測準(zhǔn)確率和特定病原體檢測準(zhǔn)確率。其主要優(yōu)勢在于采用了高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法，避免了傳統(tǒng)方法中存在的漏檢或誤診的可能性，并能夠同時對多種病原體進行檢測。這些優(yōu)勢對于肺部感染患者的早期診斷具有重要意義。在抗生素調(diào)整率、CRP 水平、平均住院時間、機械通氣時間等預(yù)后指標(biāo)的比較上，mNGS 陽性組與陰性組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明mNGS 技術(shù)在指導(dǎo)個體化治療方案調(diào)整方面發(fā)揮了重要作用。通過mNGS 檢測出的病原體陽性患者需要進行更多的抗生素調(diào)整。由于mNGS 能夠準(zhǔn)確檢測出病原體種類和基因序列，醫(yī)生可以根據(jù)檢測結(jié)果選擇正確的抗生素種類和劑量，避免抗生素濫用和耐藥性的產(chǎn)生，從而更好地治療肺部感染，提高治療效果和改善患者的預(yù)后[12]。因此，mNGS 對抗生素調(diào)整具有積極的指導(dǎo)作用。CRP 是炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)之一，mNGS 能夠準(zhǔn)確檢測出病原體，從而有助于醫(yī)生更好地判斷炎癥反應(yīng)的程度和治療效果，以便及時調(diào)整治療方案。此外，由于mNGS 能夠準(zhǔn)確檢測出病原體種類和基因序列，醫(yī)生可以更好地了解病情和治療效果，從而制定更加個性化的治療方案。這也可能導(dǎo)致機械通氣及住院時間的延長，體現(xiàn)了差異化治療理念，有效避免了因漏誤診導(dǎo)致的疾病進一步惡化。

綜上所述，mNGS 技術(shù)在肺泡灌洗液樣本中用于病原體檢測具有較高的診斷價值，能夠提高陽性檢出率并對肺部感染患者的臨床治療產(chǎn)生積極的指導(dǎo)作用，有助于改善患者預(yù)后。