皮膚真菌檢查中熒光染色法與KOH 法的應(yīng)用比較分析

孫 偉

（臨沂市皮膚病醫(yī)院，山東 臨沂 276004）

真菌在自然界中分布非常廣泛，大部分對(duì)人類有益或間接有益，但是也存在少部分致病性真菌[1]。對(duì)于因致病性真菌造成的感染可按照侵犯位置的不同將其分成淺部真菌病和深部真菌病。淺部真菌病是指致病真菌或條件感染皮膚、毛發(fā)等淺表組織而引發(fā)的疾??；深部真菌病是指致病真菌或條件侵犯皮下組織、內(nèi)臟、黏膜，從而造成器官感染，如白色念珠菌。真菌感染容易傳播和交叉感染，因此需要臨床快速診斷并開展治療[2]。濕片法和染色法是快速檢測(cè)淺部真菌感染的主要方法，其中又以KOH 濕片法、熒光染色法更為常見。KOH 濕片法步驟簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)成本低，但是在常規(guī)顯微鏡下無法識(shí)別真菌與角質(zhì)細(xì)胞等雜質(zhì)，且查找相對(duì)費(fèi)事，對(duì)操作人員的水平要求也相對(duì)較高，容易造成漏診或誤診。真菌熒光染色法近些年來被廣泛地應(yīng)用于皮膚淺部真菌檢測(cè)中[3]。本次研究將兩種方式的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，旨在為尋找效果更理想的檢測(cè)方法提供參考，現(xiàn)將結(jié)果做出如下報(bào)告：

1 資料與方法

1.1 一般資料

將我院2021 年1 月至2023 年6 月皮膚科門診接收的高度疑似真菌感染的605 例患者收取標(biāo)本進(jìn)行研究，其中男性患者325 例、女性患者280 例，年齡4 ～70 歲，平均年齡（35.78±6.89）歲。取材位置：頭面部136 例、體股部164例、手足部179例、外陰48例、甲屑標(biāo)本78例。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者自愿加入研究且能夠配合；（2）檢查前12 ～24 h 避免洗澡，7 天內(nèi)未使用潤(rùn)膚劑、抗菌肥皂、洗滌劑。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）4 周內(nèi)有抗真菌藥物或含有抗真菌成分藥物使用史；（2）患有局部嚴(yán)重細(xì)菌感染；（3）長(zhǎng)期使用免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素的患者。

1.3 研究方法

收取研究對(duì)象605 例患者的標(biāo)本，分別采用熒光檢測(cè)法和KOH 濕片法檢測(cè)，對(duì)比檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)對(duì)比兩組患者的相關(guān)炎性因子和T 淋巴細(xì)胞亞群水平。

（1）試劑材料：KOH 濕片法使用的真菌熒光染色試液試劑（生產(chǎn)廠家：南京漢瑞生物科技有限公司，規(guī)格：10 mL）的主要成分：氫氧化鉀（KOH）、氫氧化鈉、氯化鈉、水溶性熒光增白劑、純化水。（2）取材：將無菌棉簽蘸取75%乙醇浸潤(rùn)及消毒皮損處，每處取兩份標(biāo)本。①皮膚癬部可先用帶柄刮刀將皮疹的邊緣刮掉，如果患處涂有藥物需要先擦掉，獲取下層皮屑，敏感部位可粘貼透明膠帶獲得，將獲取的標(biāo)本隨機(jī)放在玻璃片上；②頭部病變使用帶柄刮刀刮取獲得或斷發(fā)；③指甲（趾甲）使用帶柄刮刀獲得病變位置的甲屑或甲溝內(nèi)的分泌物；④面部病變使用帶柄刮刀收取紅色丘疹內(nèi)容物或使用透明膠紙粘取皮屑。（3）檢測(cè)步驟：①熒光檢測(cè)法。將裝有皮損標(biāo)本的載玻片置于水平位置，滴入1 滴染色液，需覆蓋或淹沒整個(gè)樣品，染色液與樣品充分融合后蓋好蓋玻片，吸去多余的染液，使用250 ～400 nm 濾鏡的熒光顯微鏡觀察。②KOH 濕片檢測(cè)法。將載玻片放置水平位置后滴入1 滴15%的KOH，需覆蓋或淹沒整個(gè)樣品，蓋好蓋玻片，使用酒精燈稍稍加熱至溶解，使用顯微鏡觀察。

1.4 結(jié)果判讀

熒光染色法：顯微鏡下呈現(xiàn)強(qiáng)熒光細(xì)胞組織可高度懷疑存在真菌成分，若可以觀察到菌體結(jié)構(gòu)，呈現(xiàn)弱熒光則可能為細(xì)菌或者其他組織。

KOH 濕片法：使用15%KOH 浸泡皮損樣本后，顯微鏡下觀察有明顯透亮或淺綠色，有孢子或者菌絲形態(tài)的則可判定為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本次研究使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件為SPSS 28.0，以n（%）表示計(jì)數(shù)資料，使用χ2檢驗(yàn)，以±s表示計(jì)量資料，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)方法的效果對(duì)比

熒光染色法檢測(cè)效果見圖1，鏡下可清晰觀察真菌的輪廓與菌絲，真菌輪廓呈現(xiàn)亮藍(lán)色，菌絲與周圍的背景容易分辨；KOH 濕片法檢測(cè)效果見圖2，背景昏暗并且較為雜亂，反差比較小，真菌的結(jié)構(gòu)與雜質(zhì)之間無法清晰鑒別。

圖1 真菌熒光鏡檢（×400）

圖2 KOH鏡檢（×400）

2.2 兩種檢測(cè)方法不同位置的檢測(cè)情況對(duì)比

熒光染色法的總陽(yáng)性率為42.48%（257/605），明顯高于KOH 檢測(cè)法的22.81%（138/605），數(shù)據(jù)對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=53.2261，P＜0.05），不同部位的檢測(cè)結(jié)果中熒光染色法的陽(yáng)性率均高于KOH 法（P＜0.05），見表1。

表1 兩種方法不同位置的檢測(cè)情況對(duì)比

2.3 兩種檢測(cè)方法在不同疾病檢測(cè)中的結(jié)果對(duì)比

熒光染色法對(duì)于不同感染的檢出率均高于KOH 濕片法，數(shù)據(jù)對(duì)比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩種檢測(cè)方法在不同疾病檢測(cè)中的結(jié)果對(duì)比

3 討論

3.1 檢測(cè)結(jié)果討論

隨著近些年來真菌感染病例的逐漸增加，臨床對(duì)于真菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性要求也逐漸增高。真菌涂片鏡檢及真菌培養(yǎng)是判斷真菌感染的金標(biāo)準(zhǔn)，也是檢驗(yàn)基礎(chǔ)。10%～20%的KOH 浮載液是真菌直接鏡檢中最常用的，KOH 可以溶解標(biāo)本的人體細(xì)胞，但是對(duì)真菌無著色效果，在檢驗(yàn)淺部的標(biāo)本（如甲屑和毛發(fā)標(biāo)本）時(shí)，由于其中含有多種纖維、皮屑以及細(xì)胞等雜質(zhì)，鏡下的視野背景多雜亂不清，不容易分辨真菌結(jié)構(gòu)[4]。有報(bào)道顯示[5]，KOH 鏡檢法的檢測(cè)陽(yáng)性率約在22%～77%之間。本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示KOH 濕片鏡檢陽(yáng)性率為22.81%，與他人研究結(jié)果相似。KOH 的鏡檢準(zhǔn)確率非常依賴樣本的數(shù)量以及操作人員的技術(shù)水平，若標(biāo)本中含有與真菌或孢子結(jié)構(gòu)類似的氣泡、纖維、脂肪等干擾物，會(huì)極大增加分辨的難度。此外，KOH 對(duì)甲屑的溶解率比較低，鏡下能見度不高也是造成該方法檢出率低的重要因素之一[6]。真菌熒光染色檢測(cè)法隨時(shí)通過特殊的熒光染料與真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)及葡聚糖特異性結(jié)合，僅需十秒鐘的反應(yīng)時(shí)間，具有較高的親和力。通過顯微鏡特定激光波段觀察，經(jīng)過熒光染色的真菌具有明亮的輪廓，與黑暗的背景有鮮明的反差，且菌絲或孢子會(huì)呈現(xiàn)藍(lán)綠色的熒光，形態(tài)結(jié)構(gòu)非常清晰，便于操作人員尋找和觀察。本次研究中熒光染色法的檢測(cè)陽(yáng)性率為42.47%，明顯高于KOH 檢測(cè)法（P＜0.05），進(jìn)一步證明了其優(yōu)勢(shì)。此外，熒光染色的原理也讓其具有廣闊的應(yīng)用范圍，無論是淺部真菌或是深部真菌病都可以檢測(cè)。與KOH 檢測(cè)相比，熒光染色法在滴加染液后等待1 min 左右即可觀察，而KOH 需要使用酒精燈加熱；熒光染料對(duì)于脂肪、氣泡不會(huì)著色，所以不會(huì)產(chǎn)生干擾，且與KOH 鏡下存在多種雜質(zhì)的背景相比，熒光染色鏡下背景多為黑色，更容易分辨真菌結(jié)果。此外，真菌熒光染色法對(duì)技術(shù)人員的操作度與熟練度要求相對(duì)較低，操作簡(jiǎn)單、快速，可以極大提高檢測(cè)人員的工作效率。本次研究中熒光染色法在馬拉色毛囊炎中的檢出率高達(dá)77.00%，正是因?yàn)闊晒馊旧軌蚩焖俚谋嬲J(rèn)孢子菌，在濕疹、皮炎等非真菌感染的疾病中，由于同樣存在馬拉色孢子菌聚集感染的情況，所以熒光染色法的檢出率也均高于KOH 檢測(cè)法。

3.2 檢測(cè)意義分析

皮膚作為人體最大的器官，總重量約占個(gè)體體重的16%。皮膚是由上皮部分和結(jié)締組織組成的，上皮部分是由外胚層分化而來，稱為表皮，而結(jié)締組織是由中皮層分化，可以分為真皮及皮下組織[7]。皮膚作為人體與環(huán)境間重要的屏障，不僅可以保護(hù)體內(nèi)器官與組織免受外界有害因素的侵襲，還可以阻止組織內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、水分以及電解質(zhì)等物質(zhì)流失。此外，人體皮膚寄居著大量的微生物群落，有細(xì)菌、病毒、真菌等，這些微生物群落不具有致病性，同時(shí)還可以抵御外界病原微生物的侵入和防止水分丟失[8]。真菌是真核領(lǐng)域的普遍微生物，種類約有五萬種，僅有200 種是人類的病原體，12 種真菌能夠造成人類90%的真菌病。大部分的真菌感染都相對(duì)較為頑固，短時(shí)間內(nèi)治好后還會(huì)反復(fù)發(fā)作，且容易傳播和交叉感染，因此臨床需要快速診斷，盡早治療。

皮膚癬菌是臨床常見的真菌感染性皮膚病，其形態(tài)有菌絲與孢子兩種，通過鏡檢可見菌絲或孢子即可高度懷疑真菌感染。KOH 濕片法是早期檢測(cè)皮膚真菌感染的主要方式，不僅試劑容易獲得，且價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單，無需使用特殊的儀器輔助檢查。但是其缺點(diǎn)也較為明顯，對(duì)于甲屑等難溶解的標(biāo)本需要很長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間，顏色與背景中的角質(zhì)細(xì)胞較難區(qū)分，顯微鏡下的清晰度也不夠，因此需要檢驗(yàn)人員的主觀判斷。熒光染色法需要使用熒光劑染色，其價(jià)格與KOH 試劑相比更高，但是檢查結(jié)果更精準(zhǔn)，在顯微鏡下可以快速找到菌絲或標(biāo)本，同時(shí)可以觀察結(jié)構(gòu)，減少了很多主觀誤差，極大提高了孢子類真菌感染的檢出率。值得注意的是，通過真菌培養(yǎng)結(jié)果證實(shí)[9]，人類的正常皮膚中存在假絲酵母菌、馬拉色菌屬等多種真菌，其中馬拉色菌屬是最常見的正常寄生菌，具有很強(qiáng)到親脂性，它的生長(zhǎng)需要脂質(zhì)化合物，因此在前額、前臂、腹股溝、肘窩等位置含量最多。因此，在這些位置發(fā)現(xiàn)孢子也無法直接作為病原菌，是否致病也需要醫(yī)生結(jié)合檢查結(jié)果與臨床癥狀進(jìn)行綜合判斷，而熒光染色結(jié)果圖文并茂，這對(duì)于輔助醫(yī)生判斷真菌的形態(tài)與感染數(shù)量有重要幫助，能夠有效降低誤診與漏診。此外，本次研究仍有不足之處，在使用KOH 濕片法檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)少數(shù)假陰性病例，主要原因是檢查面部馬拉色毛囊炎患者，特別是女性患者，大部分為使用化妝品后獲得的標(biāo)本，這無形增加了顯微鏡下辨別孢子的難度，這也提醒臨床工作人員在檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)盡量排除各種因素，才能進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，熒光染色法在皮膚真菌檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì)，不僅檢出率高，且操作簡(jiǎn)單，能夠降低因主觀判斷帶來的誤差，其結(jié)果可以為臨床醫(yī)生提供幫助，值得廣泛推廣。