向日葵HaFATA基因的生物信息學(xué)和表達(dá)分析

摘要? FATA編碼脂酰-酰基載體蛋白硫酯酶A，將質(zhì)體中以脂酰-ACP形式存在的脂肪酸水解成游離的脂酰-CoA和?；d體蛋白。為了解向日葵HaFATA基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及基因表達(dá)特性，對(duì)HaFATA編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)和基因表達(dá)分析。預(yù)測(cè)HaFATA為堿性且為親水性蛋白，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是無(wú)規(guī)則卷曲，預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位于葉綠體。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，HaFATA與同屬菊科的萵苣（Lactuca sativa L.）和水飛薊（Silybum marianum L.）FATA進(jìn)化關(guān)系近，序列相似性分別為90%、87%。HaFATA表達(dá)分析結(jié)果顯示，HaFATA在向日葵種子中表達(dá)最高，其次為在管狀花和葉中，在莖、舌狀花和根中不表達(dá)，在發(fā)育的種子中，HaFATA除在開(kāi)花后12 d表達(dá)相對(duì)較低，在其他6個(gè)發(fā)育時(shí)期表達(dá)均較高，表明其對(duì)于種子發(fā)育和油脂積累可能具有重要作用。

關(guān)鍵詞? 向日葵；脂酰-?；d體蛋白硫酯酶；脂肪酸；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)? S565.5?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A?? 文章編號(hào)? 0517-6611（2024）07-0096-03

doi： 10.3969/j.issn.0517-6611.2024.07.024

Bioinformatics and Expression Analysis of HaFATA Gene in Sunflower

ZHOU Fei1，2

（1.Industrial Crops Institute，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin，Heilongjiang 150086;2.Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Postdoctoral Programme，Harbin，Heilongjiang 150086）

Abstract? FATA encodes lipoacylacyl carrier protein thioesterase A，which hydrolyzes fatty acids in the form of lipoacylACP into free lipoacylCoA and acyl carrier protein in plastids.In order to understand the structure and function of the protein encoded by HaFATA gene and gene expression characteristics in sunflower，the bioinformatics of the protein encoded by HafabZ and gene expression were analyzed.It was predicted that the protein encoded by HaFATA was basic and hydrophilic.The secondary structure of the protein encoded by HaFATA was mainly irregular coil，and the subcellular localization was predicted in the chloroplast.Phylogenetic analysis showed that HaFATA was closely related to Lactuca sativa L.and Silybum marianum L.，which belong to the same family of compositae，with sequence similarity of 90% and 87%，respectively.The results of expression analysis of HaFATA showed that HaFATA expression was the highest in sunflower seeds，followed by tubular flowers and leaves，and was not expressed in stems，ligulate flowers and roots.In developing seeds，HaFATA expression was relatively low at 12 d after flowering，and was high at the other six development stages，indicating that it might play an important role in seed development and oil accumulation.

Key words? Sunflower;Lipoacylacyl carrier protein thioesterase;Fatty acid;Bioinformatics;Expression analysis

向日葵（Helianthus annuus L.）是世界上重要的油料作物之一，向日葵油中富含不飽和脂肪酸，是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的食用油。植物種子油合成和脂肪酸積累由甘油三酯和脂肪酸生物合成代謝通路上的基因調(diào)控。脂酰-?；d體蛋白硫酯酶（fatty acyl acyl carrier protien thioesterase，F(xiàn)AT）將質(zhì)體中以脂酰-ACP形式存在的脂肪酸水解成游離的脂酰-CoA和?；d體蛋白（ACP），進(jìn)而終止脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)。根據(jù)其氨基酸序列和底物偏好性分為FATA和FATB 2個(gè)亞家族，F(xiàn)ATA偏好不飽和?；?ACP，尤其對(duì)18：1-ACP活性最高，相反，F(xiàn)ATB通常對(duì)飽和酰基-ACP顯示出高活性［1］。FAT基因在脂肪酸合成代謝過(guò)程中對(duì)脂肪酸含量和組成具有重要的調(diào)控作用［2］。

目前，盡管已經(jīng)從向日葵中克隆了FATA基因［3］，但是關(guān)于該基因研究報(bào)道較少。筆者通過(guò)分析前期獲得的高油酸向日葵種子發(fā)育不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［4］，在脂肪酸生物合成代謝通路中鑒定出顯著差異表達(dá)的HaFATA基因，對(duì)該基因編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)其在高油酸向日葵不同發(fā)育時(shí)期的種子以及其他組織部位的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以期為今后該基因功能的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

向日葵高油酸保持系“L-1-OL-1”于2019年種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所試驗(yàn)基地（呼蘭區(qū)康金鎮(zhèn)）。根據(jù)開(kāi)花后不同天數(shù)于同一時(shí)間段對(duì)種子取樣，從開(kāi)花7 d起，每5 d取樣1次，取至開(kāi)花后37 d，每次取花盤最外3圈的種子，同時(shí)取向日葵開(kāi)花后7 d的根、莖、葉、管狀花、舌狀花，將材料液氮速凍后凍存于-80 ℃冰箱，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。

1.2 方法

1.2.1??? 基因的生物信息學(xué)分析。

在NCBI的BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比對(duì)和相似性搜索；利用ExPASy系統(tǒng)下的蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)工具Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)氨基酸組成、相對(duì)分子量、等電點(diǎn)和原子組成等參數(shù)；利用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；利用SOPMA在線程序（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；利用Protscale在線軟件（http：//web.expasy.org/protscale/）分析氨基酸序列的親/疏水性；利用Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在線軟件預(yù)測(cè)基因的亞細(xì)胞定位。

1.2.2??? 熒光定量PCR分析。

利用植物總RNA提取試劑盒（天根）對(duì)向日葵種子總RNA進(jìn)行提取，取0.5 μg RNA利用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA Remover（TOYOBO）合成cDNA第1條鏈。采用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（TOYOBO）試劑，Roche LightCycler 480II熒光定量PCR儀，以向日葵β-actin基因（AF282624）為內(nèi)參基因，Real-Time PCR總反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 1.2 μL，SYBR Green 10.0 μL，Primer 0.6 μL，ddH2O 7.6 μL。Real-Time PCR反應(yīng)程序：98 ℃ 2 min，98 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，68 ℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)，待PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行目標(biāo)基因的表達(dá)量分析。內(nèi)參基因β-actin引物為F：GCAAAAAGCAGCTCGTCTGT，R：AGCAGCTTCCATTCCAATCA，HaFATA熒光定量引物為F：GTGTCGGATTTTCAACGGATG，R：TCAACCACATCACTCCAAGC。

2 結(jié)果與分析

2.1 HaFATA生物信息學(xué)分析

2.1.1??? 蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)。

HaFATA基因包含有1 098 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼365個(gè)氨基酸。蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)表明：HaFATA基因編碼蛋白的原子總數(shù)為5 786個(gè)，分子式為C1788H2893N533O557S15，蛋白分子量41.25 kD，等電點(diǎn)理論值8.40，預(yù)測(cè)該蛋白是堿性蛋白。HaFATA編碼蛋白氨基酸組成見(jiàn)表1。

2.1.2??? 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

預(yù)測(cè)分析HaFATA編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：該蛋白質(zhì)有36.99%的α螺旋，3836%的無(wú)規(guī)則卷曲，20.00%的延伸鏈，4.66%的β轉(zhuǎn)角。預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HaFATA編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)為無(wú)規(guī)則卷曲（圖1）。

2.1.3??? 蛋白質(zhì)親疏水性分析和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

對(duì)HaFATA編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列進(jìn)行親疏水性分析。大于0部分多于50％為疏水性蛋白，而小于0部分多于50％為親水性蛋白，結(jié)果表明：HaFATA編碼蛋白為親水性蛋白（圖2）。Cell-PLoc 2.0軟件預(yù)測(cè)HaFATA編碼蛋白亞細(xì)胞定位于葉綠體。

2.1.4??? HaFATA基因系統(tǒng)進(jìn)化分析。

將向日葵HaFATA和同為FAT家族的FatB基因與玉米（Zea mays L.）、亞麻芥（Camelina sativa L.）等物種FATA以及擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）和甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）FATA、FATB的氨基酸序列進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建（圖3），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：向日葵HaFATA與其他物種的FATA聚在一個(gè)大分支上，與同屬菊科的萵苣（Lactuca sativa L.）和水飛薊（Silybum marianum L.）FATA進(jìn)化關(guān)系最近，序列相似性分別為90%、87%。

2.2 HaFATA基因表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，HaFATA（脂肪?；鵄CP硫酯酶A）在向日葵種子中表達(dá)最高，其次是管狀花和葉，在莖、舌狀花、根中幾乎不表達(dá)。在種子發(fā)育過(guò)程中，HaFATA除在開(kāi)花后12 d種子中表達(dá)相對(duì)較低，在其他6個(gè)發(fā)育時(shí)期表達(dá)均較高，其中在開(kāi)花后27 d種子中達(dá)最高（圖4）。

3 討論

在植物中發(fā)現(xiàn)的不同F(xiàn)AT基因家族中，F(xiàn)ATA在C18飽和與不飽和脂肪酸的輸出中起著重要作用［5］。根據(jù)紅花FATA的cDNA序列克隆得到蕪荽FATA基因并將其在大腸桿菌表達(dá)，結(jié)果表明CsFATA對(duì)C18：1-ACP的特異性最高［6］。當(dāng)山竹FATA在體外表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)C18：1-ACP的特異性最強(qiáng)，其次是C18：0-ACP，再次是C16：0-ACP［7］。從向日葵中克隆出FATA基因，純化并鑒定其編碼酶，發(fā)現(xiàn)向日葵HaFatA1 cDNA編碼一個(gè)功能性硫酯酶，偏好單不飽和?；?ACPs［3］。

FATA對(duì)植物油脂合成中脂肪酸的含量和組成起關(guān)鍵作用。目前，已從多種植物中純化出FAT，擬南芥基因組含有2個(gè)拷貝的FatA基因（At3g25110 和 At4g13050），這2個(gè)硫酯酶亞型表達(dá)相似且?guī)缀踉谒薪M織表達(dá)［8］。擬南芥fata2突變體干種子中除C24：0略有下降和C22：0水平不變外，所有其他脂肪酸增加10%～60%［9］。敲除擬南芥FATA基因2個(gè)拷貝的雙突變體植株，種子的三酰甘油（TAG）含量降低，脂肪酸組分發(fā)生了變化，亞麻酸和芥酸占脂肪酸的百分比提高［5］。甘藍(lán)型油菜中3個(gè)FATA基因BnaA.FATA.a、 BnaC.FATA.b、 BnaA.FATA.c轉(zhuǎn)化到擬南芥中，轉(zhuǎn)基因株系中的飽和脂肪酸含量顯著降低，而不飽和脂肪酸含量均顯著增加［10］。將麻瘋樹(shù)JcFATA基因干涉表達(dá)載體轉(zhuǎn)入野生型擬南芥后，與野生擬南芥相比，其脂肪酸含量都有所降低［11］。該研究發(fā)現(xiàn)，向日葵HaFATA基因在向日葵種子整個(gè)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量較高，這與前人研究結(jié)果一致［12］，表明其對(duì)于種子發(fā)育和油脂積累可能具有重要作用，但具體基因功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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基金項(xiàng)目?? 黑龍江省省屬科研院所科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（CZKYF2022-1-C037）；財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-14）。

作者簡(jiǎn)介?? 周菲（1984—），女，遼寧丹東人，助理研究員，博士，從事向日葵遺傳育種研究。