KillerRed介導消除雞原始生殖細胞的研究

摘要：【目的】構(gòu)建特異性表達KillerRed（KR）的雞原始生殖細胞系（PGCs），為制備生殖細胞可消除的受體雞胚和提高外源PGCs在嵌合體中的基因傳遞效率提供理論參考?！痉椒ā坷胔yPBase轉(zhuǎn)座酶將KR整合到雞胚成纖維細胞系（DF-1）基因組中，建立穩(wěn)定表達CAG-KR-EGFP的DF-1細胞系（KR-DF-1）。利用綠光照射細胞，臺盼藍染色檢測DF-1的消除效率。采用CRISP/Cas9系統(tǒng)將KR定點敲入到雞生殖細胞水平的PGCs中DAZL基因的第11號外顯子中，建立生殖細胞特異表達DAZL-KR-EGFP的PGCs細胞系（KR-PGCs）。利用綠光照射細胞，臺盼藍染色檢測PGCs消除效率。實時熒光定量PCR檢測生殖細胞特異性表達基因的相對表達量。顯微注射KR-PGCs到受體雞胚，孵化產(chǎn)生嵌合體后代，PCR檢測嵌合體后代精液中是否含有KR?！窘Y(jié)果】成功構(gòu)建KR-DF-1，與野生型DF-1相比，細胞增殖無顯著差異（Pgt;0.05，下同）；綠光照射后，KR-DF-1死亡率極顯著升高（Plt;0.01，下同）；成功構(gòu)建KR-PGCs，綠光照射后，KR-PGCs死亡率極顯著升高，細胞核呈破碎狀；綠光照射12 h，KR-PGCs中SOD2和CAS3基因相對表達量極顯著升高；細胞計數(shù)結(jié)果顯示，KR-PGCs在綠光照射后出現(xiàn)負增長；KR-PGCs的特異性基因DAZL、DDX4、Pou5f3、NANOG和DNA1正常表達，仍具有遷移定植到性腺的能力，且性成熟嵌合體公雞精液能產(chǎn)生含KR的精液。【結(jié)論】成功構(gòu)建了在DAZL基因位點特異性表達KR的KR-GCs細胞系，且綠光照射后可特異性消除KR-PGCs。通過顯微注射成功獲得了含有KR-PGCs且能產(chǎn)生含KR精液的嵌合體后代。

關鍵詞：雞；原始生殖細胞；KillerRed；特異性消除；嵌合體

中圖分類號：S831.49文獻標志碼：A文章編號：2095-1191（2024）10-3136-11

Research on KillerRed-mediated elimination of chickenprimordial germ cells

ZHANG Jia-le，HUANG Zhen-wen，JIA Xiao-xuan，PENG Yu-lin，WEN Jing-er，JI Na，XU Hui-yan，LIU Xing-ting，RAN Ming-xia，LU Yang-qing*

（College of Animal Science and Technology，Guangxi University/Guangxi Key Laboratory of Livestock and PoultryBreeding and Disease Prevention and Control，Nanning，Guangxi 530004，China）

Abstract：【Objective】To construct a chicken primordial germ cell line（PGCs）that specifically expressed KillerRed（KR）in order to provide theoretical reference for preparing germ cell-eliminable recipient chicken embryos and impro-ving the gene transfer efficiency of exogenous PGCs in chimeras.【Method】KR was integrated into the genome of chicken embryo fibroblast cell line（DF-1）using hyPBase transposase，and a DF-1 cell line（KR-DF-1）stably expressing CAG-KR-EGFP was established.The cells were irradiated with green light，and the elimination efficiency of DF-1 was detected by Trypan blue staining.KR was site-specifically knocked into exon number 11 of the DAZL gene in PGCs at the chicken germ cell level using the CRISP/Cas9 system，and a PGCs cell line（KR-PGCs）specifically expressing DAZL-KR-EGFPin germ cells was established.After irradiating the cells with green light，the elimination efficiency of PGCs was detected by Trypan blue staining.Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the relative expression of genes spe-cifically expressed in germ cells.KR-PGCs were microinjected into recipient chicken embryos，and were hatched to pro-duce chimeric offspring.PCR was used to detect whether the semen of chimeric offspring contained KR.【Result】KR-DF-1was successfully constructed.Compared with wild-type DF-1，there was no significant difference in cell proliferation（Pgt;0.05，the same below）.After green light irradiation，the death rate of KR-DF-1 was extremely significantly increased（Plt;0.01，the same below）.KR-PGCs were successfully constructed.After green light irradiation，the mortality rate of KR-PGCs was extremely significantly higher than that of other groups.After green light irradiation，the nuclei were frag-mented.After green light irradiation for 12 h，the relative expression levels of SOD2 and CAS3 genes in KR-PGCs were extremely significantly increased；cell counting results showed that KR-PGCs showed negative growth after green light ir-radiation；the specific genes DAZL，DDX4，Pou5f3，NANOG and DNA1 of KR-PGCs were normally expressed，andthey still had the ability to migrate and colonize to the gonads，and the semen of sexually mature chimeric roosters could produce semen containing KR.【Conclusion】The KR-PGCs cell line which expresses specifically at the DAZL gene loci issuccessfully constructed，and KR-PGCs can be specifically eliminated after green light irradiation.Throughmicroinjec-tion，chimeric offspring with KR-PGCs in the gonads and capable of producing KR sperm are successfully obtained.

Key words：chicken；primordial germ cells；KillerRed；specific elimination；chimera

Foundation items：National Key Research and Development Program of China（2021YFD1300100）

0引言

【研究意義】禽類具有特殊的生殖系統(tǒng)和胚胎發(fā)育方式，操作受精卵產(chǎn)生基因編輯雞具有一定挑戰(zhàn)性，常用于生產(chǎn)基因編輯雞的方法有逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法（Bosselman et al.，1989）、原始生殖細胞（Primor-dial germ cells，PGCs）介導法（Vick et al.，1993）和DNA顯微注射法（Love et al.，1994）等。隨著PGCs體外培養(yǎng)體系的不斷優(yōu)化，越來越多有利于維持PGCs干性和種系傳遞能力的特定因子及有利于提高培養(yǎng)基支持性的物質(zhì)被添加到培養(yǎng)體系中（Naito et al.，2015；Whyte et al.，2015；Chen et al.，2018；Szc-zerbaetal.，2020；Dehdilani et al.，2023）。研究表明，富集培養(yǎng)基能增強PGCs特異性標記物和轉(zhuǎn)錄因子的表達，提高PGCs的增殖效率，可用于體外長期培養(yǎng)PGCs，且不影響PGCs遷移并定植到性腺的能力（Dehdilani et al.，2023）。高效的擴增體系有利于縮短細胞培養(yǎng)時間，維持PGCs原有的特性和遷移能力，進而提高產(chǎn)生嵌合體的效率。外源PGCs注射到受體雞胚后會與內(nèi)源PGCs競爭生存物質(zhì)和空間，導致外源PGCs定植到性腺的效率下降（Qin et al.，2024），限制了PGCs介導的基因編輯技術在制備基因編輯雞領域中的應用。減少內(nèi)源PGCs是提高外源PGCs在受體雞胚性腺中定植效率和嵌合體雞產(chǎn)生外源配子概率的途徑之一（Ballantyneetal.，2021）。因此，制備能特異性消除內(nèi)源PGCs的受體雞對提高PGCs介導的基因編輯雞的制備具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】常用的消除內(nèi)源PGCs的方法有伽馬射線照射法、白消安處理法和通過基因編輯在生殖細胞中引入自殺基因等。其中，伽馬射線照射法會顯著降低胚胎孵化率，白消安處理法存在致死、不育和胚胎畸形等副作用（Bishop and Wassom，1986）。因此，在生殖細胞中引入自殺基因是特異性最高、副作用最小的內(nèi)源生殖細胞消除方法。生殖細胞中DEAD-Box解旋酶4（DEAD-Box helicase 4，DDX4）基因?qū)儆陔uVasa同源物（CVH），對其譜系的形成至關重要，利用類轉(zhuǎn)錄激活子效應核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease，TALEN）介導的DDX4基因大型缺失會導致雌性PGCs發(fā)育異常和卵巢不育（Taylor et al.，2017）；DAZL基因位點表達caspase-9蛋白與FK506結(jié)合蛋白（FKBP），并通過藥物誘導FKBP二聚化，隨后激活相鄰的caspase-9蛋白能特異性誘導內(nèi)源PGCs凋亡（Ballantyneetal.，2021）；利用CRISPR-Cas12a（Cpf1）家族核酸酶MAD7打靶DDX4基因能造成DNA雙鏈斷裂，在引入硝基還原酶（Nitroreductase，NTR）基因后能產(chǎn)生NTR基因編輯雞，在NTR基因編輯雞胚中同時注射外源PGCs和甲硝唑（Metronidazole，Mtz）能顯著促進內(nèi)源PGCs凋亡，增加性腺中外源PGCs占比（Chen et al.，2023）。這些研究為特異性消除內(nèi)源PGCs和提高種系嵌合體效率提供了新策略，但均需添加外源藥物，可能會影響雞胚的正常發(fā)育（Berg etal.，1999；Carere and Balthazart，2007）?！颈狙芯壳腥朦c】Kill-erRed（KR）是一種由水螅色素蛋白anm2CP（與綠色熒光蛋白同源）進一步開發(fā)而成的熒光蛋白（Bulina et al.，2006）。KR具有光毒性，受到綠光照射后能通過I型光動力反應與氧分子相互作用而形成超氧陰離子O2-，進而產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species，ROS）并激活細胞凋亡相關通路（Carpentier et al.，2009；Pletnevetal.，2009）；但KR的光毒性效應不會擴散到鄰近細胞（Kobayashi et al.，2013；Williamset al.，2013）。因此，KR介導的內(nèi)源PGCs消除方法無需添加外源藥物，是一種較理想的消除內(nèi)源PGCs的手段，而利用KR的光毒性消除雞細胞系或特異性消除雞PGCs的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】在雞胚成纖維細胞系（DF-1）水平上驗證KR光毒性可普遍應用于消除雞細胞系，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建生殖細胞水平上特異性表達KR的PGCs細胞系，探究KR光毒性能否用于特異性消除雞PGCs，進而通過PGCs移植制備PGCs特異性表達KR的嵌合體后代，為制備綠光照射消除內(nèi)源PGCs的雞胚模型提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

DF-1購自ATCC細胞庫，雞PGCs源自本課題組前期分離培養(yǎng)的PGCs細胞系（Xie et al.，2019）。主要試劑：DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker、限制性內(nèi)切酶BamH I和Mlu I、Xfect質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒購自日本TaKaRa公司；DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒購自天根（北京）生化科技有限公司；PCR預混試劑、RT-qPCR預混試劑、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術股份有限公司；總RNA提取試劑盒、無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自美國Omega公司；0.4%臺盼藍購自北京索萊寶科技有限公司；DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；0.05%胰蛋白酶-EDTA購自美國ThermoFisher Scientific公司；DMEM高糖液體培養(yǎng)基購自武漢博士德生物工程有限公司。主要儀器設備：血球計數(shù)板購自上海求精生化試劑儀器有限公司；400 mW/cm2 531 nm綠色激光器購自井岡山市龍市鎮(zhèn)宏都超耐電子。

1.2試驗方法

1.2.1表達載體構(gòu)建本研究中，光照處理組記為Light，對照組記為Cont。帶有質(zhì)膜定位信號的KR基因委托深圳華大基因科技有限公司合成。CMV-hyPBase轉(zhuǎn)座酶表達載體由本課題組保存。DF-1細胞采用hyPBase轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)隨機整合插入KR載體，相關載體構(gòu)建：利用Mlu I和BamH I將XP61載體進行雙酶切，并將KR片段與XP61骨架相連接，最終獲得CAG-KR-EGFP表達載體。PGCs使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點敲入KR供體，相關載體構(gòu)建：利用EcoR V將pMD18-T載體進行單酶切，通過In-Fusion克隆方案在KR片段前后各設計與載體同源的15 bp，并將KR片段克隆到pMD18-T載體上，最終獲得DAZL-KR-EGFP表達載體。靶向定位雞原始生殖細胞標志基因DAZL的sgRNA設計：參考NCBI數(shù)據(jù)庫中雞DAZL基因序列數(shù)據(jù)（Gene ID：374054），針對DAZL基因的11號外顯子設計用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲入的sgRNA表達載體。測序均委托深圳華大基因科技有限公司完成，利用SnapeGene進行序列比對。

1.2.2細胞系建立與純化利用Xfect質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒將CAG-KR-EGFP和CMV-hyPBase表達載體轉(zhuǎn)染DF-1細胞。利用DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑盒將DAZL-KR-EGFP和sgRNA表達載體轉(zhuǎn)染雞PGCs。轉(zhuǎn)染后DF-1細胞和PGCs均同時呈現(xiàn)紅色熒光和綠色熒光，利用顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。持續(xù)培養(yǎng)14 d后，利用流式細胞儀分選帶有熒光的陽性細胞，繼續(xù)培養(yǎng)建系以獲得穩(wěn)定表達CAG-KR-EGFP的DF-1細胞系（KR-DF-1）和穩(wěn)定表達DAZL-KR-EGFP的PGCs細胞系（KR-PGCs）

1.2.3 RNA提取與實時熒光定量PCR檢測收集野生型PGCs（WT-PGCs）和KR-PGCs細胞懸液，利用總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系20μL：RNA 500 ng，2×ES Reaction Mix 10μL，EasyScript?RT/RI Enzyme Mix 1μL，gDNA Remover 1μL，Ran-dom Primer 1μL，RNase-free H2O補足至20μL。反轉(zhuǎn)錄程序：25℃10 min；42℃30 min；85℃5 s。PCR反應體系20μL：cDNA模板10 ng，2×Easy Taq?PCRSuperMix 10μL，上、下游引物各1μL，ddH2O補足至20μL。PCR擴增程序參照2×Easy Taq?PCRSuperMix試劑盒說明設定。實時熒光定量PCR反應體系20μL：cDNA模板10 ng，上、下游引物各1μL，2×PerfectStart?Green qPCR SuperMix 10μL，ddH2O補足至20μL。實時熒光定量PCR反應程序參照PerfectStart?Green qPCR SuperMix試劑盒說明設定。以ACTB為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。擴增引物序列信息見表1。

1.2.4細胞照射利用20倍物鏡下汞燈綠光照射PGCs和DF-1細胞，分別照射10、20和40 min。照射前后采集圖像，統(tǒng)計紅色熒光細胞數(shù)量。采用400 mW/cm2 531 nm綠色激光器進行細胞淬滅照射。PGCs照射程序：將PGCs重懸為密度為2×106個/mL的細胞懸液，吸取100μL至96孔細胞培養(yǎng)板，照射6 h。DF-1細胞照射程序：將DF-1細胞重懸至密度為3×106個/mL的細胞懸液；吸取100μL細胞懸液至96孔細胞培養(yǎng)板中照射12 h。照射前后采集圖像，分析照射對PGCs和DF-1細胞活性的影響。

1.2.5細胞計數(shù)采用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，步驟如下：無水乙醇擦洗計數(shù)板，風干后蓋上蓋玻片；吸取10μL 1.2.4中的PGCs和DF-1細胞懸液滴加到細胞計數(shù)板中；10倍物鏡下統(tǒng)計計數(shù)室邊緣四大象限內(nèi)的細胞數(shù)量；4個象限內(nèi)細胞數(shù)量的平均值記為1次重復，壓線細胞記錄左側(cè)和上側(cè)的細胞數(shù)量，重復3次。細胞密度按照以下公式計算：

細胞密度（個/mL）=4個象限方格細胞平均數(shù)×104。1.2.6細胞染色利用臺盼藍染色統(tǒng)計細胞死亡率，步驟如下：0.4%臺盼藍與細胞懸液按1∶9比例混勻（臺盼藍工作濃度為0.04%）；染色5min后吸取10μL懸液到血細胞計數(shù)板中進行細胞計數(shù)。細胞死亡率按照以下公式計算：

細胞死亡率（%）=死亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100

采用Hoechst 33342進行細胞核染色，步驟如下：細胞照射后，1500 r/min離心3 min；收集細胞并加入Hoechst 33342重懸染色10 min；離心后棄上清液，100μL培養(yǎng)液重懸細胞；吸取10μL懸液滴加到載玻片上，顯微鏡下采集圖像；細胞核不圓潤、松散、破碎的記為陽性細胞。陽性細胞率按照以下公式計算：

陽性細胞率（%）=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100

1.2.7細胞顯微注射PGCs顯微注射步驟如下：收集細胞懸液，1500 r/min離心3 min，棄上清液；培養(yǎng)液重懸并計數(shù)；調(diào)整細胞密度，加入10%臺盼藍混勻；吸取100μL混液滴加到培養(yǎng)皿上形成細胞液滴；加入礦物油密封細胞液滴；細胞靜置沉淀10min；在消毒后孵化2.5 d的雞胚氣室上開洞，鑷子撕掉蛋殼薄膜；顯微注射1×104個細胞至雞胚心臟中；滴加含青鏈霉素的PBS，石蠟膜密封繼續(xù)孵化；孵化10.5 d時解剖部分雞胚分離性腺，顯微鏡下觀察；其余雞胚繼續(xù)孵化。

1.2.8精液PCR檢測利用背部按摩法人工采集公雞精液于1.5 mL微量離心管中，混勻后吸取10μL提取DNA進行PCR。PCR反應體系與擴增程序同1.2.3，KR精液鑒定引物F：5'-AGGCACCTGTACTGT GAAACC-3'，R：5'-GAACTTCTGGCCGTTCACCT-3'，擴增片段長度383bp。

1.3統(tǒng)計分析

使用GraphPad Prism 10.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并制圖，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1 KR-DF-1細胞系構(gòu)建結(jié)果

將KR片段插入含CAG啟動子的XP61骨架中，構(gòu)建持續(xù)表達KR的表達載體CAG-KR-EGFP（圖1-A）。對構(gòu)建的CAG-KR-EGFP表達載體進行測序，測序結(jié)果顯示，表達載體中包含KR序列，表明載體構(gòu)建成功（圖1-B）。隨后，將CAG-KR-EGFP表達載體轉(zhuǎn)染DF-1細胞，轉(zhuǎn)染14 d后通過流式細胞分選儀分選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的DF-1細胞，繼續(xù)培養(yǎng)以獲得純化的KR-DF-1（圖1-C）。繪制KR-DF-1細胞和野生型DF-1（WT-DF-1）細胞增殖曲線，結(jié)果（圖1-D）顯示，2種細胞增殖曲線基本一致，無顯著差異（Pgt;0.05，下同）。表明KR的整合不影響DF-1細胞的正常增殖。

2.2綠光照射對消除KR-DF-1的影響

為驗證綠光照射能否選擇性消除KR-DF-1，將WT-DF-1與KR-DF-1按1∶1比例混養(yǎng)，并在20倍物鏡下汞燈綠光照射。細胞形態(tài)觀察結(jié)果顯示，隨著照射時間的增加，KR-DF-1細胞形態(tài)收縮，一些原本貼壁的細胞逐漸懸浮并匯聚成細胞團（圖2-A），且KR-DF-1的紅色熒光細胞占比極顯著降低（Plt;0.01，下同）（圖2-B）。20倍鏡下汞燈只能照射到少部分貼壁細胞，為更準確獲得綠光照射下KR-DF-1的消除效率，采用具有更大照射面積（400 mW/cm2、531 nm）的綠色激光器照射，結(jié)果顯示，在531 nm綠光下照射12h后，KR-DF-1的紅色熒光幾乎完全淬滅（圖2-C）；臺盼藍染色結(jié)果顯示，KR-DF-1 Light組死亡細胞占比極顯著高于Cont組（圖2-D），與紅色熒光淬滅結(jié)果相符。表明綠光照射能有效消除KR-DF-1。

2.3 KR-PGCs細胞系構(gòu)建結(jié)果

DAZL基因在遷移的PGCs和性腺生殖細胞中均高度表達（Kito etal.，2010；Lee et al.，2016），為獲得特異性表達KR的PGCs，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)將DAZL-KR-EGFP表達載體敲入到DAZL基因的第11號外顯子中以構(gòu)建KR-PGCs（圖3-A）。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PGCs后采用流式細胞儀分選純化KR-PGCs并繼續(xù)培養(yǎng)，建立KR-PGCs細胞系，結(jié)果顯示，KR-PGCs細胞均帶有紅色熒光（圖3-B）。提取KR-PGCs細胞系總RNA，對插入位點含有KR供體的左右同源臂進行PCR檢測和測序分析，結(jié)果顯示，擴增獲得條帶大小約為250和150bp，與預期結(jié)果相符（左同源臂233 bp和右同源臂159bp）。測序結(jié)果也顯示插入位點含有預期的KR供體序列（圖3-C）。表明KR-PGCs細胞系構(gòu)建成功。

2.4綠光照射對消除KR-PGCs的影響

顯微鏡下觀察綠光照射對KR-PGCs紅色熒光淬滅的影響，結(jié)果（圖4-A）顯示，KR-PGCs經(jīng)400mW/cm2、531 nm的綠色激光器照射6h后，KR的紅色熒光幾乎完全淬滅。臺盼藍染色統(tǒng)計綠光照射后不同時間點KR-PGCs的死亡率，結(jié)果（圖4-B）顯示，隨著時間的增加，KR-PGCs死亡率逐漸增加，光照12和24 h的死亡率極顯著高于其他組。統(tǒng)計綠光照射后細胞的數(shù)量變化并分析綠光照射對細胞增殖的影響，結(jié)果（圖4-C）顯示，KR-PGCs Light組細胞數(shù)在第2 d顯著少于KR-PGCs Cont組（Plt;0.05，下同），第4和6d細胞數(shù)量均極顯著低于其他組，其他組間細胞增殖趨勢相近且無顯著差異，表明綠光照射對KR-PGCs增殖存在負面影響。此外，在0～6 d，WT-PGCs Cont組和KR-PGCs Cont組細胞數(shù)差異不顯著，表明KR的敲入不影響PGCs增殖。細胞凋亡率統(tǒng)計結(jié)果顯示，綠光照射后，KR-PGCs Light組細胞凋亡率極顯著高于KR-PGCs Cont組、WT-PGCs Cont組和WT-PGCs Light組（圖4-D），且核碎片化程度加重（圖4-E）。實時熒光定量PCR結(jié)果（圖4-F和4-G）顯示，綠光照射12 h，KR-PGCs Light組抗氧化基因SOD2和促凋亡基因CAS3的相對表達量均極顯著高于其他組。表明綠光照射能有效消除KR-PGCs。

2.5 KR-PGCs定植到性腺與生精能力驗證結(jié)果

PCR結(jié)果顯示，KR-PGCs和WT-PGCs中的PGCs特異性基因DAZL、DDX4、Pou5f3、NANOG、DND1在mRNA水平均有表達，而體細胞水平的WT-DF-1未見表達（圖5-A），表明KR-PGCs能表達生殖細胞特異性基因。將KR-PGCs移植到受體雞胚中，鑒定KR-PGCs的遷移能力。結(jié)果顯示，將帶紅色熒光和綠色熒光的KR-PGCs注射到受體雞胚的血液循環(huán)系統(tǒng)后，能在受體雞胚性腺中觀察到顆粒分明的細胞熒光（圖5-B），表明KR-PGCs仍具備遷移并定植到性腺的能力。此外，同一批注射的雞胚成功孵化獲得生殖細胞特異性表達KR的嵌合體后代（圖5-C）。精液PCR鑒定結(jié)果表明，性成熟的KR嵌合體公雞可產(chǎn)出含有KR的精液（圖5-D）。

3討論

隨著PGCs體外培養(yǎng)體系和移植技術的優(yōu)化（秦潔等，2006；陳美娟等，2016；Dehdilani et al.，2023），PGCs介導的基因編輯技術逐漸成熟（Kim et al.，2023）。由于受體雞胚PGCs的內(nèi)源競爭，移植的外源PGCs存在種系遺傳效率低等問題，限制了PGCs介導的基因編輯技術在制備基因編輯雞領域中的應用。因此，制備內(nèi)源PGCs消除的基因編輯雞模型有利于提高外源移植PGCs的嵌合體效率。研究發(fā)現(xiàn)，通過基因編輯技術引入自殺基因是目前較理想的內(nèi)源PGCs消除方法，包括通過二聚化配體激活的iCaspase9介導法（Ballantyne et al.，2021；孫玲玲，2023）和通過甲硝唑激活的NTR介導法（Chen et al.，2023）等，這些方法均是通過藥物傳遞系統(tǒng)選擇性誘導細胞凋亡壞死，進而達到消除內(nèi)源PGCs的目的。但外源藥物的添加會影響胚胎的正常生長發(fā)育（Berg etal.，1999；Carere and Balthazart，2007）。KR可通過照射綠光產(chǎn)生有限空間范圍的ROS（Kobayashi et al.，2013；Williamset al.，2013），利用該特點能特異性消除內(nèi)源PGCs，且不損傷鄰近細胞。

雞體細胞水平的永生化雞胚成纖維細胞系DF-1具有更低的培養(yǎng)成本和更高的轉(zhuǎn)染效率，能快速在體細胞水平驗證KR光毒性效應是否能用于雞細胞系的消除。研究表明，長時間低強度光照能使表達KR的細胞出現(xiàn)凋亡特征，而短時間高強度的光照則會導致細胞直接壞死（Serebrovskaya et al.，2014）。本研究中，通過hyPBase轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)完成了KR在雞體細胞DF-1基因組上的整合，使KR在DF-1的基因組中出現(xiàn)多個拷貝數(shù)，CAG持續(xù)表達的啟動子也加強了KR的表達水平。此外，定點在雞生殖細胞PGCs的DAZL基因敲入KR，KR在PGCs的基因組中表達量最多為2個拷貝。研究發(fā)現(xiàn)，通過充分的綠光照射淬滅KR的熒光，可充分發(fā)揮KR的ROS毒性（Bulina et al.，2006）。本研究中，KR-DF-1在紅色熒光淬滅后0 h直接死亡，而KR-PGCs則是在紅色熒光淬滅后0、12和24 h細胞死亡率逐漸增加。在綠光照射時，KR-PGCs細胞數(shù)量呈現(xiàn)第2 d先增長，第4 d后負增長和第6d再增長趨勢，可能是由于綠光照射細胞數(shù)量過多，所使用的培養(yǎng)基能促進體外培養(yǎng)4～6 d的PGCs快速增殖（Xie et al.，2019），導致部分未凋亡壞死的細胞仍能恢復增殖所致。光照后的KR-PGCs細胞核呈現(xiàn)破碎狀態(tài)，出現(xiàn)凋亡的特征（Cummings and Schnelmann，2021），提示部分細胞可能通過細胞凋亡途徑被消除。

本研究發(fā)現(xiàn)，綠光照射后極顯著提高了KR-PGCs的死亡率、抑制了其增殖活性并增加了CAS3和SOD2基因的相對表達量。CAS3是細胞凋亡相關基因，參與多個細胞凋亡途徑的調(diào)節(jié)。在細胞凋亡過程中，caspase-9作為高度特異性蛋白酶只切割有限的蛋白，而caspase-3和caspase-7參與大部分蛋白的切割（Slee et al.，1999）；KR在綠光照射后能通過增強細胞色素C/caspase-3信號通路激活細胞凋亡（Li et al.，2019）。本研究與Li等（2019）的研究結(jié)果相符，表明KR介導的細胞自殺體系也能應用于內(nèi)源PGCs的消除。超氧化物歧化酶（SOD）是細胞中主要的抗氧化酶，在清除超氧化物過程中起重要作用（Miao and Clair，2009），SOD2是SOD家族成員，主要存在于線粒體基質(zhì)中（Slot et al.，1986）。本研究結(jié)果表明，綠光照射12h后，KR-PGCs中SOD2基因相對表達量極顯著上調(diào)，提示KR-PGCs可能產(chǎn)生了氧化損傷，部分細胞可能通過抗氧化機制保護自身免受KR光毒性效應帶來的損傷。研究表明，caspase-3是有效殺死細胞的caspase效應器，可抑制ROS的產(chǎn)生（Brentnall et al.，2013），在綠光照射12 h后，KR-PGCs中促凋亡的CAS3基因相對表達量極顯著升高，可能是綠光照射增強了KR-PGCs的氧化損傷，進而導致了細胞凋亡。

利用KR的光毒性效應誘導細胞凋亡已應用在光動力療法領域（Liu et al.，2021），但利用KR誘導消除受體雞胚內(nèi)源PGCs的研究鮮見報道。本研究通過在生殖細胞特異性基因DAZL的第11號外顯子末端插入KR成功構(gòu)建了特異性表達KR的PGCs細胞系，且KR的敲入不影響PGCs的正常增殖活性和生殖細胞特性基因的表達。證明了充分照射綠光后能有效減少KR-PGCs的數(shù)量，最后對KR-PGCs進行移植獲得PGCs特異性表達KR的嵌合體公雞，且KR嵌合體公雞能正常產(chǎn)生含KR的精液，為制備PGCs特異性表達KR的純合子基因編輯雞奠定了基礎。

4結(jié)論

成功構(gòu)建了在DAZL基因位點特異性表達KR的KR-GCs細胞系，且綠光照射后可特異性消除KR-PGCs。通過顯微注射成功獲得了含有KR-PGCs且能產(chǎn)生含KR精液的嵌合體后代。

參考文獻（References）：

陳美娟，陳東陽，謝龍，陸振萍，楊蒙蒙，莫麗芬，盧克煥，陸陽清.2016.受體胚齡對雞原始生殖細胞移植后歸巢的影響［J］.南方農(nóng)業(yè)學報，47（6）：1014-1018.［Chen M J，Chen D Y，Xie L，Lu Z P，Yang M M，Mo L F，Lu K H，Lu Y Q.2016.Effect of recipient embryos age on homing of chicken primordial germ cell after transplantation［J］.Jour-nal of Southern Agriculture，47（6）：1014-1018.］doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2016.06.1014.

秦潔，蔡琳琳，李碧春，韓威，周冠月，吳宏，孫思宇.2006.雞胚胎原始生殖細胞的體外培養(yǎng)［J］.中國獸醫(yī)學報，26（4）：444-447.［Qin J，Cai L L，Li B C，Han W，Zhou G Y，Wu H，Sun S Y.2006.In vitro culture of chicken embryo-nic primordial germ cells［J］.Chinese Journal of Veteri-nary Science，26（4）：444-447.］doi：10.3969/j.issn.1005-4545.2006.04.031.

孫玲玲.2023.利用iCaspase9特異性誘導雞原始生殖細胞消除的研究［D］.南寧：廣西大學.［Sun LL.2023.Studyon the specific induction of elimination of chicken primordial germ cell by iCaspase9［D］.Nanning：Guangxi University.］doi：10.27034/d.cnki.ggxiu.2023.002714.

Ballantyne M，Woodcock M，Doddamani D，Hu T J，Taylor I，Hawken R J，McGrew M M.2021.Direct allele introgres-sion into pure chicken breeds using Sire Dam Surrogate（SDS）mating［J］.Nature Communications，12（1）：659.doi：10.1038/s41467-020-20812-x.

Berg C，Halldin K，F(xiàn)ridolfsson A K，Brandt I，Brunstr?m B.1999.The avian egg as a test system for endocrine disrup-ters：Effects of diethylstilbestrol and ethynylestradiol on sex organ development［J］.Science of the Total Environ-ment，233（1-3）：57-66.doi：10.1016/s0048-9697（99）00179-5.

Bishop J B，Wassom J S.1986.Toxicological review of busul-fan（Myleran）［J］.Mutation Research，168（1）：15-45.doi：10.1016/0165-1110（86）90020-5.

Bosselman RA，Hsu R Y，Boggs T，Hu S，Bruszewski J，Ou S，Kozar L，Martin F，Green C，Jacobsen F，Nicolson M，Schultz J A，Semon K M，Rishell W，Stewart R G.1989.Germline transmission of exogenous genes in the chicken［J］.Science，243（4890）：533-535.doi：10.1126/science.2536194.

Brentnall M，Rodriguez-Menocal L，De Guevara R L，Cepero E，Boise L H.2013.Caspase-9，caspase-3 and caspase-7 have distinct roles during intrinsic apoptosis［J］.BMC Cell Biology，14：32.doi：10.1186/1471-2121-14-32.

Bulina M E，Chudakov D M，Britanova O V，YanushevichY G，Staroverov D B，Chepurnykh T V，Merzlyak E M，Shkrob M A，Lukyanov S，Lukyanov K A.2006.A genetically encoded photosensitizer［J］.Nature Biotechnology，24（1）：95-99.doi：10.1038/nbt 1175.

Carere C，Balthazart J.2007.Sexual versus individual differen-tiation：The controversial role of avian maternal hormones［J］.Trends in Endocrinology and Metabolism，18（2）：73-80.doi：10.1016/j.tem.2007.01.003.

Carpentier P，Violot S，Blanchoin L，Bourgeois D.2009.Struc-tural basis for the phototoxicity of the fluorescent protein KillerRed［J］.FEBS Letters，583（17）：2839-2842.doi：10.1016/j.febslet.2009.07.041.

Chen Y C，Chang W C，Lin S P，Minami M，Jean C，Hayashi H，Rival-Gervier S，Kanaki T，Wu S C，Pain B.2018.Three-dimensional culture of chicken primordial germ cells（cPGCs）in defined media containing the functional polymer FP003［J］.PLoS One，13（9）：e0200515.doi：10.1371/journal.pone.0200515.

Chen Y C，Saito D，Suzuki T，Takemoto T.2023.An inducible germ cell ablation chicken model for high-grade germline chimeras［J］.Development，150（18）：dev202079.doi：10.1242/dev.202079.

Cummings B S，Schnellmann R G.2021.Measurement of cell death in mammalian cells［J］.Current Protocols，1（8）：e210.doi：10.1002/cpz 1.210.

Dehdilani N，Yousefi Taemeh S，Rival-Gervier S，Montillet G，Kress C，Jean C，Goshayeshi L，Dehghani H，Pain B.2023.Enhanced cultivation of chicken primordial germ cells［J］.Scientific Reports，13（1）：12323.doi：10.1038/s41598-023-39536-1.

Kim Y M，Woo S J，Han J Y.2023.Strategies for the generation of gene modified avian models：Advancement in avian germline transmission，genome editing，and applications［J］.Genes，14（4）：899.doi：10.3390/genes 14040899.

Kito G，Aramaki S，Tanaka K，Soh T，Yamauchi N，Hattori M A.2010.Temporal and spatial differential expression of chicken germline-specific proteins cDAZL，CDH and CVH during gametogenesis［J］.The Journal of Reproduc-tion and Development，56（3）：341-346.doi：10.1262/jrd.09-218a.

Kobayashi J，Shidara H，Morisawa Y，Kawakami M，Tanahashi Y，Hotta K，Oka K.2013.A method for selective ablation of neurons in C.elegans using the phototoxic fluorescent protein，KillerRed［J］.Neuroscience Letters，548：261-264.doi：10.1016/j.neulet.2013.05.053.

Lee H C，Choi H J，Lee H G，Lim J M，Ono T，Han J Y.2016.Dazl expression explains origin and central formation of primordial germ cells in chickens［J］.Stem Cells and Deve-lopment，25（1）：68-79.doi：10.1089/scd.2015.0208.

Li X，F(xiàn)ang F，Gao Y，Tang G，Xu W Q，Wang Y H，Kong R X，Tuyihong A，Wang Z C.2019.ROS induced by KillerRed targeting mitochondria（mtKR）enhances apoptosis caused by radiation via Cyt c/Caspase-3 pathway［J］.Oxidative Medicine and Cellular Longevity，2019（4528616.doi：10.1155/2019/4528616.

Liu J X，Wang F，Qin Y，F(xiàn)eng X L.2021.Advances in the genetically engineered KillerRed for photodynamic therapy applications［J］.International Journal of Molecular Sciences，22（18）：10130.doi：10.3390/ijms221810130.

Love J，Gribbin C，Mather C，Sang H.1994.Transgenic birds by DNA microinjection［J］.Nature Biotechnology，12（1）：60-63.doi：10.1038/nbt0194-60.

Miao L，St Clair D K.2009.Regulation of superoxide dis-mutase genes：Implications in disease［J］.Free Radical Bio-logyamp;Medicine，47（4）：344-356.doi：10.1016/j.freerad-biomed.2009.05.018.

Naito M，Harumi T，Kuwana T.2015.Long-term culture of chicken primordial germ cells isolated from embryonic blood and production of germline chimaericchickens.Ani-mal Reproduction Science［J］，153：50-61.doi：10.1016/j.anireprosci.2014.12.003.

Pletnev S，Gurskaya N G，Pletneva N V，Lukyanov K A，Chu-dakov D M，Martynov V I，Popov V O，Kovalchuk M V，Wlodawer A，Dauter Z，Pletnev V.2009.Structural basis for phototoxicity of the genetically encoded photosensi-tizerKillerRed［J］.The Journal of Biological Chemistry，284（46）：32028-32039.doi：10.1074/jbc.M109.054973.

Qin H M，Jia X X，Huang Z W，Zhi Y F，Ji N，Lan M Y，ZhangL，Liu X T，Xu H Y，Lu Y Q.2024.Establishing an induced infertile chicken line for efficient germline trans-mission of exogenous PGCs［J］.Journal of Integrative Agriculture.doi：10.1016/j.jia.2024.08.009.

Serebrovskaya E O，Ryumina A P，Boulina M E，Shirmanova M V，Zagaynova E V，Bogdanova E A，Lukyanov S A，Lukyanov K A.2014.Phototoxic effects of lysosome-associated genetically encoded photosensitizer KillerRed［J］.Journal of Biomedical Optics，19（7）：071403.doi：10.1117/1.Jbo.19.7.071403.

Slee EA，Harte M T，Kluck R M，Wolf B B，Casiano CA，New-meyer D D，Wang H G，Reed J C，Nicholson D W，Alnemri E S，Green D R，Martin S J.1999.Ordering the cytochrome c-initiated Caspase cascade：Hierarchical acti-vation of Caspases-2，-3，-6，-7，-8，and-10 in a Caspase-9-dependent manner［J］.The Journal of Cell Biology，144（2）：281-292.doi：10.1083/jcb.144.2.281.

Slot J W，Geuze H J，F(xiàn)reeman BA，Crapo J D.1986.Intracellu-lar localization of the copper-zinc and manganese superoxi-de dismutases in rat liver parenchymal cells［J］.Labora-tory Investigation，55（3）：363-371.

Szczerba A，Kuwana T，Paradowska M，Bednarczyk M.2020.In vitro culture of chicken circulating and gonadal primor-dial germ cells on a somatic feeder layer of avian origin［J］.Animals，10（10）：1769.doi：10.3390/ani 10101769.

Taylor L，Carlson D F，Nandi S，Sherman A，F(xiàn)ahrenkrug S C，McGrew M J.2017.Efficient TALEN-mediated gene tar-geting of chicken primordial germ cells［J］.Development，144（5）：928-934.doi：10.1242/dev.145367.

Vick L，Li Y，Simkiss K.1993.Transgenic birds from trans-formed primordial germ cells［J］.Proceedings.Biological Sciences，251（1332）：179-182.doi：10.1098/rspb.1993.0026.

Whyte J，Glover J D，Woodcock M，Brzeszczynska J，Taylor L，Sherman A，Kaiser P，McGrew M J.2015.FGF，insulin，and SMAD signaling cooperate for avian primordial germ cell self-renewal［J］.Stem Cell Reports，5（6）：1171-1182.doi：10.1016/j.stemcr.2015.10.008.

Williams D C，Bejjani R E，Ramirez P M，Coakley S，Kim S A，Lee H，Wen Q，Samuel A，Lu H，Hilliard M A，Hammar-lund M.2013.Rapid and permanent neuronal inactivation in vivo via subcellular generation of reactive oxygen with the use of KillerRed［J］.Cell Reports，5（2）：553-563.doi：10.1016/j.celrep.2013.09.023.

Xie L，Lu Z P，Chen D Y，Yang M M，Liao YY，Mao W R，Mo L F，Sun J J，Yang W H，Xu H Y，Lu K H，Lu Y Q.2019.Derivation of chicken primordial germ cells using an indi-rect co-culture system［J］.Theriogenology，123：83-89.doi：10.1016/j.theriogenology.2018.09.017.

（責任編輯蘭宗寶）