基于TMT蛋白質(zhì)組學研究黃芪甲苷干預膿毒癥肺損傷作用靶點的研究

摘要：目的 采用TMT蛋白質(zhì)組學研究黃芪甲苷對膿毒癥小鼠肺組織蛋白組學的影響，為其臨床應(yīng)用治療膿毒癥提供科學依據(jù)。方法 采用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)（Cecal Ligation-Peferation，CLP）復制膿毒癥小鼠模型，隨機分為假手術(shù)組、模型組、黃芪甲苷組。H＆E染色檢測肺組織病理損傷；流式細胞術(shù)檢測B細胞表達；提取肺組織蛋白，運用TMT蛋白質(zhì)組學技術(shù)比較組間差異蛋白的表達，并進行生物信息學分析。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，模型組肺組織炎癥細胞浸潤嚴重，結(jié)構(gòu)塌陷；黃芪甲苷干預顯著減輕膿毒癥模型小鼠肺組織病理損傷。與模型組比較，黃芪甲苷藥物干預組小鼠脾淋巴細胞B細胞（B220+）表達無明顯影響（Pgt;0.05）。TMT蛋白質(zhì)組學結(jié)果分析肺組織蛋白差異成分，結(jié)果共鑒定出33個顯著性差異蛋白，黃芪甲苷干預上調(diào)17個蛋白，下調(diào)16個蛋白。GO富集分析顯示，黃芪甲苷主要干預生物功能過程，其中與膿毒癥肺損傷密切相關(guān)差異主要蛋白是介導黏膜免疫的IgA產(chǎn)生通路。結(jié)論 黃芪甲苷對膿毒癥誘導的肺損傷具有顯著作用，其效應(yīng)機制主要與干預B細胞分泌的IgA介導的黏膜免疫有關(guān)，該研究為黃芪臨床治療膿毒癥奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)組學；膿毒癥；黃芪甲苷；免疫球蛋白A

中圖分類號：R256.1"" 文獻標志碼：A"" 文章編號：1007-2349（2024）02-0083-07

Study on the Target of Astragaloside in the Intervention of Lung Injury with Sepsis Based on TMT Proteomics

ZHANG Chun-fei1， ZHANG Hao-hong1， LI Xiao-hong2， WU Zhao1， ZOU Nan-ting1， YANG Hai-hao1， JU Ming-qian1， MO Qing-yan1， WAN Chun-ping1， 2

（1. Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China;2. Chuxiong Hospital of Traditional Chinese Medicine， Chuxiong 675000， China）

【Abstract】Objective： To study the effect of Astragaloside on lung tissue proteomics of sepsis mice by TMT proteomics and to provide scientific basis for its clinical application in the treatment of sepsis. Methods： The septic mouse models were replicated by Cecal Ligation-Peferation （CLP）， and the mice were randomly divided into sham operation group， model group and Astragaloside group. Hamp;E staining was used to detect the pathological injury of lung tissue. The expression of B cells was detected by flow cytometry. Lung tissue proteins were extracted， the expression of different proteins was compared by TMT proteomic technique， and bioinformatics analysis was performed. Results： Compared with the sham operation group， the model group had severe inflammatory cell infiltration and structural collapse. Astragaloside intervention significantly alleviated the pathological injury of lung tissue in sepsis model mice. Compared with that of the model group， the expression of splenic lymphocyte B cells （B220+） in the Astragaloside intervention group had no significant effect （Pgt;0.05）. The results of TMT proteomic analysis showed that 33 different proteins were identified， among which 17 proteins were up-regulated and 16 proteins were down-regulated by Astragaloside. GO enrichment analysis showed that Astragaloside mainly interfered with biological functional processes， and the main protein closely related to lung injury in sepsis was IgA production pathway mediating mucosal immunity. Conclusion： Astragaloside has a significant effect on lung injury induced by sepsis， and its mechanism is mainly related to the intervention of IGA-mediated mucosal immunity secreted by B cells. This study lays a foundation for the clinical treatment of Astragaloside in sepsis.

【Key words】Proteomics; Sepsis; Astragaloside; Immunoglobulin A

膿毒癥是一種因感染導致的全身性炎癥反應(yīng)，是嚴重燒傷、創(chuàng)傷、感染以及外科手術(shù)常見的并發(fā)癥。隨著病情的發(fā)展，繼而引發(fā)膿毒性休克，多器官功能障礙綜合征及死亡，其中膿毒癥合并急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是膿毒癥主要并發(fā)癥以及死亡的主要原因，其中目前尚無有效的治療措施。黃芪作為治療所有“氣衰血虛”之病的常用補益中藥已使用幾千年，具有健脾補中，升陽舉陷，益衛(wèi)固表，利尿，托毒生肌等作用［1］。在臨床應(yīng)用中，黃芪在抗腫瘤免疫療法和抗感染免疫療法中應(yīng)用廣泛。最新研究已報道，黃芪甲苷具有顯著抗膿毒癥的效應(yīng)，但黃芪甲苷干預膿毒癥合并急性肺損傷的作用靶點尚未明確，值得進一步研究。

iTRAQ/TMT標記定量蛋白質(zhì)組研究，是對一個基因組表達的全部蛋白質(zhì)或一個復雜混合體系內(nèi)所有蛋白質(zhì)進行標記，利用標記試劑中的二級報告離子來對蛋白進行精確鑒定和定量，是研究藥物干預靶點一種重要手段。本研究擬通過TMT定量蛋白質(zhì)組學探究黃芪甲苷對膿毒癥肺損傷的效應(yīng)機制，從而為其臨床治療膿毒癥提供一定的科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 C57BL/6小鼠，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，7～8周齡，體重（20±2）g，雄性，合格證號：SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)于SPF級動物房，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。飼養(yǎng)條件：溫度（22±1）℃，濕度（55±5）%。飼料與水均經(jīng)過消毒處理，并由動物自由攝取。全部動物實驗均嚴格按照實驗動物有關(guān)條例實施。實驗方案通過云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會審查（DW2023-003）。

1.2 藥物與試劑 黃芪甲苷（批號：110783-201713）購自大連美侖生物iTRAQ試劑盒購自ABSCIEX；1640培養(yǎng)基（批號：412600-300）購自北京Solarbio公司；青霉素（批號：H3702081）購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司；TMT Mass Tagging Kitsand Reagents購自Thermo；Bradford蛋白定量試劑盒購自碧云天；二硫蘇糖醇DTT購自Sigma；碘代乙酰胺IAM，購自Sigma；十二烷基硫酸鈉SDS，購自國藥；尿素購自國藥；質(zhì)譜級胰酶購自Promega/V5280；碳酸氫銨購自Sigma/5330050050；LC-MS級超純水購自Thermo Fisher Chemical/W6-4；三乙基碳酸氫銨緩沖液TEAB，購自Sigma/T7408-500ML；LC-MS級乙腈購自Thermo Fisher Chemical/A955-4；LC-MS級甲酸購自Thermo Fisher Scientific/A117-50；丙酮購自北京化工廠/11241203810051；氨水購自Sigma/221228-500ML-A；Proteo Miner低豐度蛋白富集試劑盒購自Bio-Rad/1633007；三氟乙酸TFA，購自Sigma/6508-100ML。

1.3 主要儀器 EASY-nLCTM1200納升級UHPLC（購自ThermoFisher/LC140）；質(zhì)譜儀：QExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀（購自Thermo）、OrbitrapExploris480質(zhì)譜儀（購自Thermo）；分餾色譜L-3000HPLC、低溫離心機（購自Scilogex/D3024R）；冷凍干燥機（購自Labogene /ScanSpeed40）；電泳儀（購自Bio-Rad）；電泳槽（購自Bio-Rad）；電子天平（購自Sartorius/BSA124S）；渦旋混合器（購自光合/HY-6B）；酶標儀（購自Thermo/ MultiskanFC）；制冰機（購自雪科）；組織研磨儀（購自上海凈信/24孔）；超聲波細胞破碎儀（購自寧波新芝/JY92-11N）。

2 方法

2.1 膿毒癥模型的構(gòu)建 C57BL/6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5d后，術(shù)前禁食，不禁水。采用國際公認的盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)對小鼠進行膿毒癥造模［2］。具體方法如下：小鼠用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉，注射體積為10 mL/kg麻醉。麻醉后背位固定小鼠，備皮處理，沿腹中線做1 cm切口，開腹分離腸系膜及盲腸，用4號線在盲腸近端1/3處結(jié)扎，21 g號針在結(jié)扎部位中部處貫通穿刺，在穿孔處擠出少量糞便，隨后將盲腸回納入腹腔，逐層縫合關(guān)腹。術(shù)后每只小鼠肌注青霉素2×104U以預防切口感染的同時，立即皮下注射37℃生理鹽水5 mL/100 g（補充術(shù)中液體丟失）和0.05 mg/kg丁基原啡因（每6h 1次，持續(xù)2d），作為對照假手術(shù)組找出盲腸后不穿刺迅速將盲腸回納入腹腔，其余同上述操作。

2.2 分組和給藥 術(shù)后2h，30只小鼠隨機分為3組：假手術(shù)組、模型組、黃芪甲苷組。黃芪甲苷組灌胃黃芪甲苷10 mg/kg。假手術(shù)組和膿毒癥模型組灌服等體積生理鹽水；將小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室，隨時觀測小鼠狀態(tài)和體征，給藥24 h后處理取材。

2.3 H＆E染色檢測肺組織病理損傷 取右肺葉上葉組織約0.5 cm×0.3 cm×1 cm大小的，浸于4%多聚甲醛中12 h，梯度乙醇進行組織脫水，液態(tài)石蠟包埋，4 μm切片，載玻片撈片后烘烤2 h。再用二甲苯、乙醇處理脫蠟，蘇木素浸染，1%鹽酸乙醇分化，伊紅浸染，再次進行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后采用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。

2.4 流式細胞術(shù)檢測脾臟B細胞表達水平 取小鼠脾臟，載玻片研磨脾臟，濾膜過濾，4℃1200rpm離心5min，棄掉上清，紅細胞裂解液裂解紅細胞，加入2%FBS的1640培養(yǎng)基終止裂解。PBS洗兩次后，加入10%FBS1640培養(yǎng)基。配密度為2×106個/mL的細胞，加入熒光標記的B220抗體，4℃孵育15min，洗液洗1次，流式細胞儀進行檢測，F(xiàn)lowjo軟件分析結(jié)果。

2.5 總蛋白提取與蛋白定量 精密稱取適量肺組織樣品，在裝有液氮的研缽中將樣本研磨至粉末。加入適量的SDT（含100mMNacl）和DTT溶解，振蕩混勻，冰水浴超聲5min使其充分裂解。95℃反應(yīng)8～15min，冰浴2min，于4℃、12000 g離心15min，取上清加入足量IAM溶液，放置在黑暗條件下反應(yīng)1h。在-20℃條件下加入4倍量經(jīng)-20℃預冷的丙酮沉淀，沉淀時間2h以上，4℃、12000 g離心15min，收集沉淀。之后加入1mL-20℃預冷丙酮重懸并清洗沉淀，收集沉淀，風干，沉淀即總蛋白。加入適量Dissolved Buffer（DB buffer），徹底溶解蛋白沉淀。采用Brad fold蛋白定量試劑盒對蛋白定量。

2.6 蛋白酶解脫鹽 將蛋白樣品取出，加入DB蛋白溶解液補足體積到100μL，加入胰酶和100mM TEAB緩沖液，攪拌均勻后在37°C條件下酶切4h，再加入胰酶和CaCl2酶切過夜。加入甲酸調(diào)節(jié)pH小于3，攪拌均勻后于室溫、12000 g離心5min，取上清緩慢通過C18除鹽柱，之后使用清洗液連續(xù)清洗3次，再加入適量洗脫液，收集濾液，凍干。

2.7 TMT肽段標記與分級 加入100μL 0.1M TEAB緩沖液復溶，并加入41μL乙腈溶解的TMT標記試劑，常溫下顛倒混勻2h。之后終止反應(yīng)加入終濃度8%氨水，取等體積標記后的樣品混合，除鹽后凍干。之后制備流動相A液（2%乙腈、98%水、氨水調(diào)節(jié)PH到10）和B液（98%乙腈、2%水）。將凍干粉溶解在A液中，4℃14000 g離心20min。使用L-3000HPLC系統(tǒng)，柱溫設(shè)為45°當時間為0min時，流速為1mL/min，97%的流動向A，3%的流動相B；10min時，流速為1mL/min，95%的流動向A，5%的流動相B；30min時，流速為1mL/min，80%的流動向A，20%的流動相B；48min時，流速為1mL/min，60%的流動向A，40%的流動相B；50min時，流速為1mL/min，50%的流動向A，50%的流動相B；53min時，流速為1mL/min，30%的流動向A，70%的流動相B；54min時，流速為1mL/min，0%的流動向A，100%的流動相B。每分鐘收集1管，合并為10個餾分凍干，加入0.1%甲酸。

2.8 液質(zhì)檢測及數(shù)據(jù)分析 餾分上清使用EASY-nLCTM1200納升級UHPLC系統(tǒng)，預柱（4.5cm×75m，3μm），分析柱（25cm×150μm，1.9μm），55℃柱溫箱，流動相A液（100%水、0.1%甲酸）和B液（80%乙腈、0.1%甲酸）進行梯度洗脫。使用Orbitrap Exploris 480（加FAIMS）質(zhì)譜儀，Nanospray FlexTM（ESI）離子源，數(shù)據(jù)依賴型采集模式采集參數(shù)，生成質(zhì)譜檢測原始數(shù)據(jù)。搜素庫軟件ProteomeDiscoverer2.4（PD2.4，Thermo）分別搜索每個run的結(jié)果譜圖，保留可信的譜肽和蛋白，并做FDR驗證。T-test檢驗對蛋白質(zhì)定量結(jié)果進行統(tǒng)計分析，標記實驗組和對照組之間定量差異顯著的差異表達蛋白（DEP）。利用InterProScan軟件進行GO功能注釋、Perl module軟件進行富集分析、R Package pheatmap軟件進行聚類熱圖分析。

2.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0和GraphPad Prism9.5.1軟件對數(shù)據(jù)進行分析，全部計量數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示，2組間均數(shù)差異性比較采用t檢驗，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析。Plt;0.05表明差異具有顯著性意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪甲苷對膿毒癥模型小鼠肺組織損傷程度影響 如圖1所示：假手術(shù)組小鼠肺部組織結(jié)構(gòu)正常，少量細胞間隔滲出，肺泡結(jié)構(gòu)完整；病理模型組小鼠炎癥細胞浸潤嚴重，有毛細血管擴張出血；與病理模型組比較，黃芪甲苷干預組顯著減輕小鼠肺部組織病理損傷程度提示黃芪甲苷對膿毒癥小鼠誘導肺損傷具有保護效應(yīng)。

3.2 黃芪甲苷對膿毒癥模型小鼠脾臟B淋巴細胞（B220+）表達的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與膿毒癥病理模型組比較，黃芪甲苷藥物干預組小鼠脾淋巴細胞B細胞（B220+）表達無明顯影響（Pgt;0.05），提示黃芪甲苷干預并不影響B(tài)淋巴細胞表達，可能主要影響B(tài)細胞功能，如圖2。

3.3 TMT蛋白質(zhì)組學差異蛋白分析 TMT蛋白質(zhì)組學結(jié)果分析肺組織蛋白差異成分結(jié)果顯示，結(jié)果共鑒定到63318條肽段，7085個蛋白，其中7057個蛋白質(zhì)可以定量。按照表達倍數(shù)變化1.2倍數(shù)以上且Plt;0.05的標準進行顯著性差異表達蛋白質(zhì)的篩選。其中33個蛋白質(zhì)的表達具有顯著性差異，黃芪甲苷干預顯著上調(diào)17個蛋白，顯著下調(diào)16個蛋白。結(jié)果見圖3。差異蛋白表達聚類熱圖見圖4。

3.4 差異蛋白GO富集分析 為揭示鑒定到的差異蛋白的功能、特征等，我們從GO方面進系統(tǒng)的解析。GO可以分為分子功能Molecular Function（MF），生物功能Biological Process（BP）和細胞組成Cellular Component（CC）三個部分。差異蛋白GO功能富集結(jié)果顯示，在模型組（M）組和黃芪甲苷（H）組中差異蛋白與全部蛋白在BP、CC、MF三個部分的富集趨勢并不一致，差異蛋白主要分布在BP過程中。BP中與膿毒癥密切相關(guān)的機制有細胞對刺激的反應(yīng)（cellular response to stimulus）、核苷酸的切除修復（nucleotide-excision repair）、ATP合成偶聯(lián)質(zhì)子傳遞（ATP synthesis coupled proton transport）。在CC類中主要集中在核心TFIIH復合物（core TFIIH complex）。在MF中主要聚焦在三磷酸鳥苷結(jié)合（GTP binding），結(jié)果見圖5。

3.5 差異蛋白KEGG富集分析 對2組差異蛋白分別進行KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要富集于用于 IgA 生產(chǎn)通路、不飽和脂肪酸的生物合成、帕金森病等通路（見圖6）。

4 討論

最新研究結(jié)果表明，黃芪皂苷不僅具有顯著的免疫增強活性，而且還有優(yōu)良的抗炎作用［3］，能夠顯著抑制細菌脂多糖（LPS）誘導巨噬細胞炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β和NO）產(chǎn)生，下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 激活和AP-1 DNA結(jié)合活性［4］。在抗感染方面，黃芪甲苷對柯薩奇B3病毒有明顯的抑制作用，臨床用于病毒性心肌炎的治療，其作用機制與誘導Th1細胞因子IFN-γ轉(zhuǎn)錄及分泌相關(guān)［5］。上述研究表明黃芪皂苷在抗炎，免疫增強以及抗感染等方面有明顯藥理作用，同時這些藥理作用對改善膿毒癥患者體內(nèi)免疫抑制狀態(tài)以及清除病原體等方面也有重要治療作用，然而黃芪皂苷抗膿毒癥確切的作用機制尚未明確，仍缺乏有效作用靶標的深入研究，這一定程度阻礙傳統(tǒng)黃芪臨床應(yīng)用于治療膿毒癥。

TMT是一種基于肽段層面的體外標記技術(shù)，其原理是標志物特異性標記多肽的氨基端，然后再進行質(zhì)譜分析。因此，本研究采用此方法篩選黃芪甲苷干預膿毒癥作用靶點，結(jié)果共鑒定出33個顯著性差異蛋白，黃芪甲苷干預上調(diào)17個蛋白，下調(diào)16個蛋白。GO富集分析顯示，黃芪甲苷主要干預生物功能過程，其中與膿毒癥肺損傷密切相關(guān)差異蛋白主要是介導黏膜免疫的IgA產(chǎn)生相關(guān)通路。

研究表明，膿毒癥患者體內(nèi)有不同程度免疫功能紊亂的情況。IgA在血清總的免疫球蛋白內(nèi)占比約15%，具有較強的抑制毒素、抑制病毒及抑菌的效果［6］。而B細胞在抗原的刺激下可以分化為漿細胞，漿細胞合成分泌免疫球蛋白抗體，包括IgA。流式結(jié)果顯示，黃芪甲苷干預并不影響B(tài)淋巴細胞表達。最新研究表明，與假手術(shù)組比較，膿毒癥病理模型小鼠血清中IgA的水平明顯升高，提示IgA水平與膿毒癥發(fā)生與轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)［7］。IgA由pIgA協(xié)助從面膜上皮的基底膜側(cè)運送到根尖側(cè)，分泌進入黏膜外粘液中，pIgR在IgA分泌到胞外發(fā)揮抵抗病原微生物的過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述結(jié)果，推測黃芪甲苷可能通過影響B(tài)細胞的功能，調(diào)控IgA 生產(chǎn)，從而改善膿毒癥誘導肺損傷，確切作用機制需要進一步實驗驗證，該研究為黃芪臨床應(yīng)用膿毒癥治療、傳承與創(chuàng)新奠定理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2023-06-18）