綠豆窄葉突變體vrnl9基因的精細(xì)定位與轉(zhuǎn)錄組分析

摘要：葉片是綠豆最重要的光合作用場所，其形態(tài)結(jié)構(gòu)影響光合作用、群體結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量。篩選和鑒定綠豆葉形突變體材料，為探究葉片發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理和葉形遺傳改良奠定基礎(chǔ)。在皖科綠3號EMS（Ethyl methyl sulphonate）誘變突變體庫中鑒定出1個(gè)窄葉突變體vrnl9，并對該突變體進(jìn)行表型鑒定、基因定位和轉(zhuǎn)錄組分析。表型分析發(fā)現(xiàn)，窄葉突變體vrnl9葉片寬較野生型皖科綠3號顯著減小，葉面積和葉柄長也顯著縮減；突變體主莖退化，生育期延長10 d。在突變位點(diǎn)的定位中，本研究利用蘇綠16-10與突變體vrnl9雜交構(gòu)建的F2群體進(jìn)行遺傳分析和基因精細(xì)定位。結(jié)果表明，窄葉突變體vrnl9的窄葉表型受單個(gè)隱性核基因控制（χ2=1.40）。BSA測序分析將突變位點(diǎn)定位在第9染色體上0～3.1 Mb的區(qū)間內(nèi)，結(jié)合圖位克隆的方法，本研究將窄葉基因vrnl9定位在標(biāo)記NL-15和NL-28之間354.6 kb的區(qū)間內(nèi)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與野生型皖科綠3號相比，突變體vrnl9中有182個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生顯著改變，其中86個(gè)上調(diào)、96個(gè)下調(diào)。KEGG分析結(jié)果表明，差異表達(dá)基因顯著富集在植物激素信號傳導(dǎo)、萜類骨架的生物合成、玉米素的生物合成等代謝通路。這些研究結(jié)果為克隆窄葉基因vrnl9和解析綠豆葉片生長發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：綠豆；窄葉；vrnl9基因；基因定位；轉(zhuǎn)錄組分析

中圖分類號：S522文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2024）02-0203-10

Fine mapping and transcriptome analysis of a narrow leaf mutant gene vrnl9 in mungbean

YE Wei-jun，WU Ze-jiang，TIAN Dong-feng，ZHANG Yin，ZHANG Ling-ling，ZHOU Bin

（Crop Research Institute， Anhui Academy of Agricultural Sciences， Hefei 230031， China）

Abstract：Leaf is the most important place for mungbean photosynthesis， and its morphological structure affects photosynthesis， population structure and yield in mungbean. Screening and identification of leaf shape mutants can lay the foundation for studying molecular regulation mechanism of leaf development and genetic improvement of leaf shape in mungbean. A narrow leaf mutant vrnl9 was identified from an ethyl methyl sulfonate （EMS） induced Wankelü 3 （WK3） mutant library. Phenotype identification， gene mapping and transcriptome analysis for vrnl9 were completed. Phenotype analysis showed that the leaf width， leaf area and petiole length of vrnl9 were significantly decreased compared with wild-type WK3. The main stem of mutant degenerated and the growth period was extended by ten days. In order to map the mutation site， the F2 population constructed by the cross between Sulü16-10 and the mutant vrnl9 was used for genetic analysis and fine mapping. The narrow leaf trait of vrnl9 was controlled by a single recessive nuclear gene （χ2=1.40）. The BSA sequencing analysis showed that the mutation site was located within an interval of 0-3.1 Mb on chromosome 9. The narrow-leaf gene vrnl9 was finally narrowed down to a 354.6 kb region between the markers NL-15 and NL-28 by using map-based cloning strategy. Transcriptome analysis revealed that the expression levels of 182 genes in mutant vrnl9 were significantly changed compared with wild-type WK3， of which 86 genes were up-regulated and 96 genes were down-regulated. KEGG analysis results showed that the differentially expressed genes were significantly enriched in plant hormone signal transduction， terpenoid backbone biosynthesis， zeatin biosynthesis and other metabolic pathways. These results provide a theoretical basis for cloning vrnl9 and understanding the molecular regulation mechanism of leaf development in mung bean.

Key words：mungbean；narrow leaf；vrnl9 gene；gene mapping；transcriptome analysis

綠豆[Vigna radiata （L.） Wilczek]是豆科（Leguminosae）蝶形花亞科（Papilionaceae）菜豆族（Phaseoleae）豇豆屬（Vigna L.）中的一個(gè)種，染色體組為2n=2x=22。綠豆具有喜溫、耐貧瘠、耐蔭、生育期短、適播期長且經(jīng)濟(jì)效益高等特點(diǎn)，在高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮了重要作用。目前，綠豆主要種植在亞洲、非洲、南美洲和澳大利亞等國家和地區(qū)，年均種植面積超過6×106 hm2[1]。綠豆作為豆科作物，具有固氮能力，可培肥、改良土壤。因此，綠豆常與水稻、小麥等輪作，可以減施氮肥，減輕病、蟲危害，提高作物產(chǎn)量，增加經(jīng)濟(jì)效益[2-3]。此外，綠豆籽粒營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，可加工成綠豆糕、綠豆湯、綠豆芽菜、綠豆粉絲、綠豆酒等多種產(chǎn)品；綠豆籽粒還富含多種維生素、礦質(zhì)元素及活性物質(zhì)，具有解毒、抗過敏、抗菌抑菌、抗腫瘤等功效，綠豆屬藥食兩用作物[4-5]。綠豆籽粒中鐵元素含量較高，被亞洲蔬菜研究與發(fā)展中心認(rèn)定為富含鐵食物，適用于改善缺鐵引發(fā)的貧血癥[6]。由于綠豆主要種植在發(fā)展中國家，常被劃為小雜糧，相關(guān)的基礎(chǔ)研究較少，其基因組學(xué)和分子遺傳學(xué)研究水平落后于水稻、玉米等大宗作物[7]。隨著農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整和居民飲食觀念的改變，綠豆等雜糧作物的研究投入加大，研究水平提高，研究內(nèi)容更加深入，促進(jìn)了綠豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。Kang等[8]率先完成了綠豆全基因組測序工作，獲得第一張綠豆基因組序列草圖（431 Mb），促進(jìn)了綠豆遺傳學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展。

葉片是綠豆最重要的光合作用場所，影響群體冠層結(jié)構(gòu)和最終產(chǎn)量。因此，探究綠豆葉形調(diào)控機(jī)理不僅具有重要的理論價(jià)值，也有助于葉形和株型的遺傳改良。模式植物擬南芥和水稻中葉形調(diào)控機(jī)理研究已較為清晰，一些關(guān)鍵調(diào)控基因已被克隆。擬南芥中PIN1和水稻中NAL1與生長素極性運(yùn)輸相關(guān)，通過影響生長素的濃度調(diào)控葉片形態(tài)發(fā)育[9-10]。生長素響應(yīng)因子基因ETT/ARF3和ARF4在擬南芥葉片的背軸面生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[11-12]。水稻中生長素響應(yīng)因子基因ARF11功能缺失后，葉片變窄[13]。此外，KANADI基因家族和YABBY基因家族在擬南芥和水稻葉片的生長發(fā)育中也發(fā)揮十分重要的調(diào)控作用[14-16]。目前，對綠豆復(fù)葉形態(tài)發(fā)育和遺傳調(diào)控的研究已取得了一定進(jìn)展。遺傳分析結(jié)果表明，綠豆裂葉性狀由兩對基因控制[17]，裂葉對卵圓葉表現(xiàn)為半顯性，第3染色體上編碼A20/AN1鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子基因（Vradi03g04470）應(yīng)為裂葉性狀的調(diào)控基因[18]。王潔[19]基于大花葉和冀綠9號變異株雜交衍生的RIL群體，在第3和第10染色體上鑒定出多個(gè)調(diào)控葉片缺刻性狀的QTL，且第3染色體上編碼糖基轉(zhuǎn)移酶（LOC106757416）的基因?yàn)樽罴押蜻x基因。利用綠豆葉形突變體材料，Jiao等[20-21]克隆了2個(gè)綠豆葉片發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控基因UN和RRF1。雖然綠豆葉形調(diào)控的分子機(jī)理已有報(bào)道，但復(fù)葉發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，有多個(gè)調(diào)控基因參與。目前綠豆中已克隆的葉形調(diào)控基因仍然較少，其遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不清晰，需要定位和克隆更多的相關(guān)基因。同時(shí)，綠豆葉形遺傳調(diào)控機(jī)理的解析也為綠豆葉形的遺傳改良提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

綠豆窄葉突變體vrnl9為皖科綠3號經(jīng)EMS誘變后獲得，經(jīng)多代自交后，其窄葉表型穩(wěn)定。2019年夏季以vrnl9為母本，與正常葉形的蘇綠16-10（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育）雜交，構(gòu)建遺傳分析和定位群體。2020年夏季和2021年夏季分別將F1和F2群體種植在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)基地。

1.2性狀調(diào)查與遺傳分析

綠豆植株葉長、葉寬等表型性狀的調(diào)查測量方法按照《綠豆種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》[22]執(zhí)行，葉面積檢測三出復(fù)葉中間小葉的面積。在F1和F2代觀察群體葉片表型，F(xiàn)2分離群體中統(tǒng)計(jì)具有窄葉表型和正常葉片表型的植株數(shù)目，采用卡方檢測分離比。數(shù)據(jù)分析利用Excel和SPSS軟件完成。

1.3混池測序及數(shù)據(jù)分析

以vrnl9和蘇綠16-10雜交構(gòu)建的F2群體（包含1 293個(gè)單株）為定位群體，采用BSA（Bulked segregate analysis）法構(gòu)建突變體和野生型2個(gè)子代DNA混池，各包含30個(gè)單株。利用DNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品，貨號DP305]提取單株DNA，每個(gè)混池中各單株DNA等量混合。利用第二代測序技術(shù)（Next-generation sequencing，NGS），基于Illumina測序Nova Seq平臺對混池和雙親進(jìn)行基因組重測序。測序完成后，去除帶接頭及低質(zhì)量的序列。測序數(shù)據(jù)以Kang等[8]公布的綠豆基因組信息為參考，將野生型混池、突變混池和雙親一起檢測InDel和SNP位點(diǎn)，鑒定覆蓋全基因組的InDel和SNP位點(diǎn)。BSA-seq分析采用Fekih等[23]和Takagi等[24]提出的基于SNP-index的基因定位方法。以雙親間的SNP為參考，以蘇綠16-10的基因型為背景，分別計(jì)算兩個(gè)混池中每1個(gè)SNP位點(diǎn)的SNP-index和Delta SNP-index[23]。SNP-index分布情況以窗口形式展現(xiàn)，窗口大小設(shè)置為500 kb，步長為100 kb，計(jì)算每個(gè)窗口中SNP-index。進(jìn)行10 000次置換檢驗(yàn)，選取95%和99%置信水平作為篩選閾值。

1.4精細(xì)定位

BSA-seq分析完成后，根據(jù)雙親核苷酸序列差異，用Primer Premier 5.0軟件在窄葉性狀連鎖的候選區(qū)間設(shè)計(jì)引物，再用F2群體中隱性單株對BSA-seq的定位結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證和基因精細(xì)定位。PCR反應(yīng)總體系為10.0 μl：DNA模板（50 ng/μl）1.0 μl，2×T5 Super PCR Mix（北京擎科生物科技股份有限公司產(chǎn)品）5.0 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μl，滅菌雙蒸水3.0 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：（1）98 ℃預(yù)變性2 min；（2）然后98 ℃變性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，38個(gè)擴(kuò)增循環(huán)；（3）最后72 ℃充分延伸5 min；（4）8 ℃保存。InDel標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳完成后銀染顯色，統(tǒng)計(jì)分析各單株基因型；SNP標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，DNA測序鑒定基因型。

1.5轉(zhuǎn)錄組分析

野生型和突變體出苗21 d后，取完全展開的復(fù)葉中間葉片用于轉(zhuǎn)錄組分析，每個(gè)樣品3次重復(fù)。利用Trizol試劑盒提取葉片總RNA，質(zhì)量檢測合格后用Oligo（dT）磁珠從總RNA中富集帶有polyA結(jié)構(gòu)的mRNA，經(jīng)離子打斷，得到長度為300 bp左右的RNA片段。以獲得的RNA片段為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，然后以cDNA第一鏈為模板完成cDNA第二鏈的合成。采用PCR擴(kuò)增的方法完成文庫片段富集，文庫大小在450 bp，并利用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測。構(gòu)建好的文庫采用Novaseq-PE150平臺進(jìn)行測序，測序和數(shù)據(jù)分析工作由派森諾生物科技有限公司（上海）完成。

首先對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過濾，去除帶接頭、低質(zhì)量和較短的Read，用HISAT2軟件將篩選后的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)（Clean read）比對到綠豆的參考基因組上（https：//data.legumeinfo.org/Vigna/radiata/）。使用HTSeq統(tǒng)計(jì)比對到每1個(gè)基因上，得到Read Count值，作為基因的原始表達(dá)量，采用FPKM（Fragments per kilo base per million fragments）方法對基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[25]。利用DESeq2軟件[26]對野生型和突變體中基因的表達(dá)量進(jìn)行差異分析，差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEG）的篩選條件為：基因表達(dá)量的倍數(shù)變化（Fold change）大于2即|log2（Fold chang）|＞1，顯著性P＜0.05。根據(jù)DEG分析的結(jié)果，使用Blast2 Go軟件對DEG進(jìn)行GO功能注釋（http：//www.geneontology.org/），并利用topGO進(jìn)行GO富集分析。利用KAAS[27]對DEG進(jìn)行KEGG注釋（https：//www.kegg.jp/kegg/genome/），用KOBAS軟件進(jìn)行代謝通路富集分析。

2結(jié)果與分析

2.1突變體vrnl9的表型分析

野生型皖科綠3號和突變體vrnl9的農(nóng)藝性狀如表1所示。在苗期，與野生型相比，vrnl9的葉片明顯變窄（圖1A～圖1C）。皖科綠3號的葉片寬12.09 cm，而vrnl9的葉片寬5.86 cm，較野生型減少51.53%，差異達(dá)極顯著水平。vrnl9和野生型的葉片長沒有顯著差異，但葉片變窄導(dǎo)致vrnl9的葉面積較野生型皖科綠3號減少了34.51%。vrnl9的葉柄長也顯著降低，較野生型減少了48.72%。基因突變顯著延長了綠豆的開花期，增加了vrnl9的全生育期天數(shù)。vrnl9的主莖明顯退化（圖1D），突變體主莖高（15.20 cm）較野生型（70.60 cm）降低78.47%；主莖節(jié)數(shù)（6.57）較野生型（11.33）減少42.01%，且差異均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。突變體和野生型其他性狀如莢長、莢寬和單株莢數(shù)等相比無顯著差異。

2.2突變體vrnl9的遺傳分析

突變體vrnl9是在皖科綠3號EMS誘變M2代群體中被發(fā)現(xiàn)，子代表型分析發(fā)現(xiàn)突變表型植株的后代均表現(xiàn)為窄葉，與突變體同一個(gè)株系的部分正常表型植株后代可分離出窄葉突變體，表明突變體vrnl9的突變性狀由隱性基因控制。以突變體vrnl9為母本，蘇綠16-10為父本進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代均表現(xiàn)為正常葉片表型，F(xiàn)2群體分離出窄葉表型和正常葉形植株。在F2群體中隨機(jī)調(diào)查了244個(gè)植株的表型，其中正常表型的植株191株，窄葉表型的植株53株。經(jīng)卡方分析，正常植株與窄葉植株比例符合3∶1的理論分離比（χ2 =1.40＜χ20.05=3.84），表明突變體vrnl9的窄葉表型受1對隱性核基因控制（表2）。

2.3窄葉基因vrnl9的精細(xì)定位

在突變體vrnl9和蘇綠16-10雜交的F2代群體中各取30個(gè)窄葉表型和正常表型的單株葉片，分別構(gòu)建突變型和野生型單株的DNA混池，與親本一起進(jìn)行基因組重測序。將野生型混池、突變體混池和雙親的測序數(shù)據(jù)一起檢測InDel和SNP位點(diǎn)，共檢測到31 033個(gè)InDel和155 978個(gè)SNP位點(diǎn)。SNP-index分析結(jié)果顯示，第9染色體上0～3.1 Mb的區(qū)間內(nèi)Delta SNP-index值較基因組其他區(qū)域明顯增加，該區(qū)間內(nèi)1 410個(gè)SNP位點(diǎn)的Delta SNP-index均值為0.54，表明與窄葉性狀關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)可能位于該區(qū)間內(nèi)（圖2）。為驗(yàn)證BSA-seq定位結(jié)果，在目標(biāo)區(qū)間附近篩選了10個(gè)分子標(biāo)記，獲得親本間多態(tài)性表現(xiàn)較好的InDel分子標(biāo)記A9-2，位于定位區(qū)間的右側(cè)。利用A9-2對F2群體中21個(gè)突變表型的單株進(jìn)行基因型分析，結(jié)果表明A9-2與窄葉基因vrnl9存在連鎖關(guān)系。根據(jù)雙親間的核苷酸序列差異，在A9-2的左翼設(shè)計(jì)了多個(gè)InDel標(biāo)記，獲得多態(tài)性InDel標(biāo)記NL-5和NL-15。用這2個(gè)標(biāo)記對21個(gè)窄葉表型的單株進(jìn)行基因型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NL-5（圖3）和NL-15與vrnl9都表現(xiàn)為連鎖關(guān)系，根據(jù)交換情況將vrnl9初步定位在這2個(gè)標(biāo)記之間。為進(jìn)一步縮小候選區(qū)間，在NL-5和NL-15之間又開發(fā)了3對有多態(tài)性的SNP標(biāo)記（NL-20、NL-28、NL-23）。利用多態(tài)性分子標(biāo)記（表3）對F2群體中255個(gè)突變表型的單株進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在標(biāo)記NL-15和NL-28處均有交換發(fā)生，且兩處的交換單株不重復(fù)。因此，vrnl9被錨定在這2個(gè)標(biāo)記間354.6 kb的區(qū)間內(nèi)（圖4）。利用綠豆基因組數(shù)據(jù)庫（https：//legacy.legumeinfo.org/genomes/jbrowse/？data=Vr1.0）對候選區(qū)間的基因進(jìn)行預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)區(qū)間內(nèi)共有38個(gè)注釋基因。

2.4窄葉基因vrnl9的轉(zhuǎn)錄組分析

2.4.1差異表達(dá)基因的鑒定轉(zhuǎn)錄組測序完成后，以|log2（Fold chang）|＞1，且P＜0.05為差異表達(dá)基因的篩選條件，鑒定在突變體vrnl9和野生型皖科綠3號間差異表達(dá)的基因。結(jié)果共篩選出182個(gè)差異表達(dá)基因。與野生型皖科綠3號相比，在突變體vrnl9中基因表達(dá)量上調(diào)的有86個(gè)，表達(dá)量下調(diào)的有96個(gè)（圖5）。

2.4.2差異表達(dá)基因的GO富集分析對差異表達(dá)的基因（DEG）進(jìn)行GO富集分析，按照生物過程（Biological process）、細(xì)胞組分（Cell component）、分子功能（Molecular function）分類和富集分析。每項(xiàng)分類挑選富集最顯著的前10個(gè)GO term進(jìn)行展示（圖6）。在生物過程類別中DEG顯著富集在苯丙素響應(yīng)、細(xì)胞對脂質(zhì)的響應(yīng)、激素水平調(diào)節(jié)等生物過程；細(xì)胞組分類別中DEG顯著富集在胞外區(qū)、細(xì)胞外空間等區(qū)域；在分子功能類別中，DEG顯著富集在RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)序列特異性DNA結(jié)合和雙加氧酶活性等功能組中。

2.4.3差異表達(dá)基因的KEGG富集分析 利用KEGG數(shù)據(jù)庫對突變體和野生型中的差異表達(dá)基因（DEG）進(jìn)行功能分類和Pathway注釋，有55個(gè)差異基因可以詳細(xì)注釋到33條信號通路中（圖7）。富集分析結(jié)果表明，有30個(gè)DEG顯著富集在新陳代謝通路中，如萜類骨架的生物合成、玉米素的生物合成及角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)的生物合成等；11個(gè)DEG顯著富集在環(huán)境信息處理中，參與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和MAPK信號通路；5個(gè)DEG富集在遺傳信息處理，參與核苷酸切除修復(fù)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、RNA降解和mRNA監(jiān)測途徑；5個(gè)DEG富集在細(xì)胞過程通路中，參與過氧化物酶、胞吞作用和吞噬體途徑；4個(gè)DEG富集在生物體系統(tǒng)中，參與植物晝夜節(jié)律調(diào)控及植物-病原體互作。

3討論

EMS誘變可極大提高基因突變頻率，在功能基因組學(xué)研究中，常用于突變體的創(chuàng)制。與其他理化劑相比，EMS誘變引發(fā)的變異以點(diǎn)突變?yōu)橹?，染色體畸變較少，且創(chuàng)制的突變體變異類型豐富[28]，在擬南芥[29]、水稻[30]、小麥[31]、大豆[32]等突變體種質(zhì)創(chuàng)制中應(yīng)用廣泛。在之前的研究工作中，本團(tuán)隊(duì)利用EMS誘變的方法構(gòu)建皖科綠3號突變體庫，獲得了多個(gè)葉形、株高、生育期變異的突變體[28]。在前人的研究中，綠豆葉形突變體材料在葉片的生長發(fā)育調(diào)控機(jī)理研究中已得到應(yīng)用。綠豆單葉突變體un（Unifoliate leaf）的突變表型受單隱性核基因調(diào)控，UN基因編碼1個(gè)LFY（LEAFY）同源蛋白，該基因突變后，三出復(fù)葉變?yōu)閱稳~[20]。綠豆RRF1基因編碼CUC/NAM（CUP-SHAPED COTYLEDON/NO APICAL MERISTEM）蛋白，該基因突變后綠豆的葉軸變短，三出復(fù)葉有變?yōu)閱纹讶~的趨勢[21]。

葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)是重要的育種目標(biāo)性狀之一。多數(shù)大豆育種學(xué)家認(rèn)為窄葉有利于提高群體中、下部光照度，增加中、下部葉片的受光面積，從而提升葉片總體光合效率，達(dá)到提升產(chǎn)量的目的。皖科綠3號突變體庫中發(fā)現(xiàn)的1個(gè)窄葉突變體vrnl9，其葉寬、葉面積和葉柄長度較野生型顯著減少，主莖明顯退化，主莖節(jié)數(shù)減少，開花期和全生育期延長，表明vrnl9是1個(gè)多效基因，基因突變后影響綠豆植株整體的形態(tài)發(fā)育。

隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，基于測序技術(shù)的BSA-seq技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因定位和克隆[23]，可快速完成目的基因所在候選區(qū)間的確定。該方法在水稻[33]、玉米[34]、小麥[35]等作物中應(yīng)用較多，在花生[36]、大豆[37]、綠豆[38-39]等豆科作物中也有應(yīng)用。利用BSA-seq方法將vrnl9定位在第9染色體上0～3.1 Mb的區(qū)間內(nèi)，并利用分子標(biāo)記A9-2驗(yàn)證了BSA-seq的定位結(jié)果?；谟H本核苷酸序列差異，在定位區(qū)間內(nèi)設(shè)計(jì)了多個(gè)多態(tài)性InDel和SNP標(biāo)記，最終將vrnl9定位在標(biāo)記NL-15和NL-28之間354.6 kb的區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間包含38個(gè)預(yù)測基因。轉(zhuǎn)錄組測序是近年發(fā)展起來的用來鑒定差異表達(dá)基因的技術(shù)，常用于篩選突變體和野生型間的DEG，有利于解析農(nóng)藝性狀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[40]。本研究中，利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)共篩選出182個(gè)DEG，未發(fā)現(xiàn)葉形調(diào)控基因UN和RRF1的表達(dá)量發(fā)生顯著改變，說明vrnl9獨(dú)立于這2個(gè)基因調(diào)控綠豆葉形。轉(zhuǎn)錄組測序分析沒有在候選區(qū)間內(nèi)鑒定到DEG，表明突變體和野生型中vrnl9的表達(dá)量無顯著差異，推測是突變體中核苷酸的變異引起了蛋白功能的變化，從而導(dǎo)致表型變異。

研究結(jié)果表明植物激素如生長素、赤霉素等參與調(diào)控植物葉片的生長發(fā)育[41]。本研究中，GO分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)DEG顯著富集在激素的分泌和調(diào)節(jié)類別中，可能影響了突變體vrnl9中植物激素的合成和代謝，從而影響了葉片發(fā)育。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，有30個(gè)DEG顯著富集在萜類骨架的生物合成、玉米素的生物合成及角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)的生物合成等新陳代謝通路中。玉米素主要參與細(xì)胞分裂和組織分化，角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)也參與植物組織的構(gòu)建，這些通路中相關(guān)基因表達(dá)量的改變可能是突變體形態(tài)結(jié)構(gòu)改變?nèi)缛~片變窄、主莖退化的主要原因。此外，其他DEG參與的新陳代謝通路如植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控植物的生長發(fā)育（如萌發(fā)、開花、休眠等）、防御和環(huán)境適應(yīng)等過程[42-43]；植物MAPK信號通路參與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，生物和非生物脅迫等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[44]；植物晝夜節(jié)律通路影響植物的開花和成熟，這些通路中的DEG表達(dá)量的改變也可能影響了突變體vrnl9的生育期相關(guān)表型。由此可見，DEG參與的各通路是一個(gè)相互聯(lián)系的整體網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控突變體vrnl9的生長發(fā)育。這些研究結(jié)果為窄葉基因vrnl9的克隆奠定基礎(chǔ)，也為解析綠豆葉片發(fā)育的分子遺傳機(jī)理提供參考。

4結(jié)論

本研究從皖科綠3號EMS誘變突變體庫中獲得1個(gè)綠豆窄葉突變體vrnl9，該突變體的葉片寬較野生型顯著減小，葉面積和葉柄長度也顯著降低，主莖退化，生育期延長。遺傳分析結(jié)果表明突變體vrnl9的突變表型受單個(gè)隱性核基因控制。利用圖位克隆的方法，將窄葉基因vrnl9定位在第9染色體上標(biāo)記NL-15和NL-28之間354.6 kb的區(qū)間內(nèi)，包含38個(gè)注釋基因。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，突變體vrnl9中有182個(gè)基因的表達(dá)量發(fā)生顯著改變，其中86個(gè)表達(dá)量上調(diào)，96個(gè)表達(dá)量下調(diào)。GO功能富集分析顯示，DEG顯著富集在苯丙素響應(yīng)、細(xì)胞對脂質(zhì)的響應(yīng)、激素的分泌和調(diào)節(jié)等生物過程。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，DEG顯著富集在萜類骨架的生物合成、玉米素的生物合成及角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟質(zhì)的生物合成等代謝通路。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）