基于線粒體Cyt b基因序列的4個黃尾鲴養(yǎng)殖群體遺傳多樣性分析

摘要：黃尾鲴（Xenocypris davidi）是浙江省自然水域增殖放流的主要魚類，為了解人工繁育對黃尾鲴遺傳多樣性的影響，利用線粒體DNA細胞色素b基因（Cyt b）對4個養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性進行研究，旨在為黃尾鲴增殖放流策略制定和實施提供基礎數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，在編碼Cyt b的1 140 bp序列中，檢測到157個變異位點，界定了21種單倍型，其中長興、雙浦、八里店和醴陵群體的單倍型數(shù)目分別為10個、11個、7個和2個，單倍型多樣性介于0.226～0.794，核苷酸多樣性介于0.006 14～0.023 86。除醴陵群體遺傳多樣性較低外，其余3個養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性具有高單倍型數(shù)和高核苷酸多樣性的特點。4個黃尾鲴養(yǎng)殖群體間的遺傳距離為0.018 74～0.092 74，遺傳分化指數(shù)為0.808 63（Plt;0.01），其中長興和八里店群體的分化程度較低，雙浦和醴陵群體的分化程度較高，且遺傳變異主要發(fā)生在群體間。本研究結(jié)果可從分子水平為黃尾鲴的資源保護和人工增殖放流提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃尾鲴；養(yǎng)殖群體；Cyt b基因；遺傳多樣性

中圖分類號：S965.124;Q75文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）02-0342-06

Genetic diversity analysis of four cultured Xenocypris davidi populations based on mitochondrial Cyt b gene sequence

LIU Shi-li1，CHEN Da-wei1，2，ZHU Peng-can3，ZHENG Jian-bo1 ，XIA Feng-bo1，CHENG Shun1 ，JIANG Wen-ping1 ，CHI Mei-li1 ，HANG Xiao-ying1 ，LI Fei1

（1.Key Laboratory of Healthy Freshwater Aquaculture， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Key Laboratory of Freshwater Aquatic Animal Genetic and Breeding of Zhejiang Province， Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries， Huzhou 313001， China;2.Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China;3.Huzhou Rongsheng Fishery Technology Co.，Ltd.， Huzhou 313105， China）

Abstract：Xenocypris davidi is one of the main fish species that are proliferated and released into the natural waters of Zhejiang province. To understand the impact of artificial breeding on the genetic diversity of X. davidi and provide basic data for formulation and implementation of proliferating and releasing strategies for X. davidi， the mitochondrial DNA cytochrome b （Cyt b） gene was used to study the genetic diversity of four cultured populations. The results showed that 157 variation sites were detected in the 1 140 bp sequence that encoded the Cyt b gene， and 21 haplotypes were defined. Among them， the haplotype numbers in Changxing， Shuangpu， Balidian and Liling populations were 10， 11， 7 and 2， respectively. The haplotype diversity ranged from 0.226 to 0.794， and the nucleotide diversity ranged from 0.006 14 to 0.023 86. The Liling population had low genetic diversity， while the other three cultured populations were characterized by genetic diversity with large haplotype number and nucleotide diversity. The genetic distances among four cultured populations of X. davidi ranged from 0.018 74 to 0.092 74， and the genetic differentiation index was 0.808 63 （Plt;0.01）， among which the genetic differentiation degrees between Changxing and Balidian populations were low， and the genetic differentiation degrees between Shuangpu and Liling populations were high. Moreover， genetic differentiation mainly occurred between populations. The study results can provide reference for resource protection and artificial proliferation and releasing of X. davidi at molecular level.

Key words：Xenocypris davidi；cultured population； Cyt b gene；genetic diversity

黃尾鲴隸屬于鯉科（Cyprinidae）鲴亞科（Xenocyprinae）鲴屬（Xenocypris）[1-2]，是一種分布于中國黃河、長江、閩江、珠江等流域的中小型淡水經(jīng)濟魚類。黃尾鲴食性較廣，以藻類及植物碎片、有機物碎屑為餌料，兼食浮游動物和底棲動物，能夠凈化水質(zhì)，具有很高的經(jīng)濟價值和生態(tài)功能價值[3]。目前，黃尾鲴已被列為浙江省主要增殖放流的魚類之一。當前，有關(guān)黃尾鲴的研究報道主要與黃尾鲴的生物學參數(shù)、生長特性以及繁育、養(yǎng)殖技術(shù)等有關(guān)。

線粒體DNA細胞色素b基因（Cyt b）進化速率適中，替換、缺失和插入等突變能夠穩(wěn)定持續(xù)遺傳，適用于種間、種內(nèi)的遺傳分析[4]，被廣泛應用于水生動物遺傳多樣性分析[5-10]。劉士力等[7]以Cyt b基因序列作為分子標記，對馬口魚（Opsariichthys bidens）甌江、錢塘江野生群體和八里店養(yǎng)殖群體進行了研究，為其種質(zhì)資源的保護和利用提供了數(shù)據(jù)支持。Wu等[8]利用Cyt b序列對太平洋中部8個大眼金槍魚（Thunnus obesus）群體進行分析，結(jié)果表明，大眼金槍魚的遺傳變異主要發(fā)生在群體內(nèi)，并且可能在11萬年前出現(xiàn)過一次明顯的種群擴張。趙文浩等[9]利用線粒體Cyt b序列對車爾臣河和渭干河的8個地理群體共174尾葉爾羌高原鰍（Triplophysa yarkandensis）進行了遺傳學多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明，塔里木河2條支流的葉爾羌高原鰍的群體內(nèi)部遺傳變異占整個遺傳變異的96.57%，存在顯著的群體間基因交流現(xiàn)象，可將這8個葉爾羌高原鰍群體歸為一個保護管理單元進行資源保護。李大命等[10]利用Cyt b基因序列對太湖流域大銀魚（Protosalanx chinensis）野生群體的遺傳多樣性進行了分析，結(jié)果表明，太湖大銀魚種群的遺傳多樣性較高，有較高的適應生存環(huán)境、進化潛能以及較高的遺傳育種改良潛力。

關(guān)于黃尾鲴遺傳資源的分子研究還不多。張峻德等[11]利用線粒體CO I基因序列對千島湖3個碼頭的48尾黃尾鲴的遺傳資源狀況進行了分析，共發(fā)現(xiàn)4個單倍型，且富文和臨岐2個碼頭的黃尾鲴群體遺傳分化顯著。張宏等[12]利用線粒體CO I基因進行遺傳多樣性分析得出，千島湖黃尾鲴群體和涇縣、南昌縣群體的遺傳分化顯著。郭愛環(huán)等[13]基于微衛(wèi)星標記對錢塘江上游黃尾鲴增殖放流效果進行了評估，研究結(jié)果為浙江省內(nèi)陸水域水生生物的增殖放流活動提供了數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。

Xiao等[14]利用線粒體Cyt b序列分析了鲴亞科的黃尾鲴和其他6個種的進化關(guān)系。李琳等[1]利用Cyt b和CO I序列評估了黃尾鲴與其他鲴亞科各物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和分化時間。黃尾鲴具有較高的生態(tài)價值與經(jīng)濟價值，目前采用Cyt b基因序列對黃尾鲴進行群體遺傳多樣性的研究還不多。因此，通過線粒體Cyt b基因序列研究黃尾鲴群體的種群結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性狀況，分析其遺傳變異，可為其種群的保護提供參考。本研究擬對4個黃尾鲴養(yǎng)殖群體的線粒體細胞色素b基因全長進行擴增，對這4個群體的遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，以期為黃尾鲴的人工增殖放流策略的制定和實施、資源保護與合理開發(fā)提供基礎數(shù)據(jù)和依據(jù)。同時，本研究擬獲得的黃尾鲴線粒體Cyt b基因序列，可為其他黃尾鲴群體Cyt b基因序列的研究提供參考數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

本研究所用黃尾鲴于2022年采自浙江長興、雙浦、八里店和湖南醴陵的4個黃尾鲴養(yǎng)殖基地，每個群體隨機選取32尾，共計128尾。剪取適量黃尾鲴尾鰭，用無水乙醇固定，儲存于4 ℃冰箱中，用于后續(xù)的群體遺傳學分析。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取、基因擴增與測序使用苯酚-三氯甲烷抽取法提取黃尾鲴尾鰭組織的DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。參照黃尾鲴線粒體基因組序列（登錄號： KF039718）應用Primer Premier 6.0軟件設計Cyt b擴增和測序的引物Cyt b-F和Cyt b-R。Cyt b-F：5′-GACTTGAAGAACCACCGTTG-3′；Cyt b-R：5′-CTCCGATCTTCGGATTACAAGAC-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系和反應條件參照文獻[15]。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，合格后送生工生物工程（上海）股份有限公司采用上下游引物進行雙向測序。

1.2.2序列分析利用BioEdit 7.0軟件進行序列比對，并對照原始序列峰圖進行人工校對。應用Mega 7.0軟件對堿基的含量進行計算，并采用鄰接法基于Kimura’s 2-Parameter模型建立系統(tǒng)進化樹。運用DnaSP 5.0軟件計算單倍型多樣性指數(shù)（h）、單倍型數(shù)、變異位點數(shù)和核苷酸多樣性指數(shù)（π）。在TCS 1.21中用最大簡約法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡圖。通過DnaSP 5.0軟件分組計算并保存成arp格式后，采用Arlequin 3.1軟件進行分子方差分析（AMOVA），計算各群體間的遺傳分化指數(shù)（Fst）。

2結(jié)果與分析

2.1黃尾鲴Cyt b基因堿基組成與變異分析

本研究對4個黃尾鲴養(yǎng)殖群體128個樣本的Cyt b基因進行了擴增和測序，得到了128條長度為1 154 bp的同源序列，提交GenBank后獲得登錄序列號：OQ599605～OQ599732。選擇其中1 140 bp編碼Cyt b的序列用于下一步分析。結(jié)果顯示，在1 140個位點中存在變異位點157個，簡約信息位點156個，分別占分析位點的13.8%和13.7%。堿基平均發(fā)生轉(zhuǎn)換的概率（Ts）與發(fā)生顛換的概率（Tv）的比值（Ts/Tv）為7.96。4種堿基在128條序列中平均含量為29.2% （A）、14.6% （G）、27.8% （T）和28.4% （C），其中G的含量最低，A+T的含量為57.0%，明顯高于C+G的含量。醴陵黃尾鲴養(yǎng)殖群體堿基含量和其他3個浙江養(yǎng)殖群體有一定差異（表1）。

在128個樣本中發(fā)現(xiàn)了21個單倍型（H1～H21），雙浦黃尾鲴養(yǎng)殖群體具有11個單倍型，其中9個單倍型是該群體獨有的，另外2個單倍型分別與長興和八里店黃尾鲴養(yǎng)殖群體共享。長興和八里店黃尾鲴養(yǎng)殖群體的單倍型數(shù)目分別為10個和7個，其中長興黃尾鲴養(yǎng)殖群體包含八里店黃尾鲴養(yǎng)殖群體的所有單倍型，且另外3種單倍型為其特有單倍型。醴陵黃尾鲴養(yǎng)殖群體僅有2個單倍型，且是該群體獨有的（表2）。

2.2黃尾鲴Cyt b基因遺傳結(jié)構(gòu)分析

使用DnaSP（version 5.0）軟件計算黃尾鲴4個養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性參數(shù)，結(jié)果（表3）顯示，4個群體的單倍型（0.226～0.794）和核苷酸（0.006 14～0.023 86）的多樣性程度具有明顯分化。醴陵群體只有2個單倍型，單倍型多樣性（h）和核苷酸多樣性（π）分別僅為0.226、0.006 14；雙浦群體的單倍型數(shù)最多，有11個；八里店群體π最高，達0.023 86。

利用分子方差分析（AMOVA）法對4個黃尾鲴養(yǎng)殖群體Cyt b基因序列的遺傳差異進行分析，結(jié)果表明，黃尾鲴養(yǎng)殖群體間的Fst為0.808 63（Plt;0.01），有80.86%的遺傳變異來自群體間，其余的遺傳變異來自群體內(nèi)（19.14%）。

2.3各群體遺傳距離分析

利用Mega 6.0軟件計算4個黃尾鲴養(yǎng)殖群體的遺傳距離。由表4可知，各黃尾鲴養(yǎng)殖群體間遺傳距離為0.018 74～0.092 74，遺傳距離差距較大。其中長興與八里店黃尾鲴養(yǎng)殖群體的遺傳距離最近，為0.018 74；雙浦和醴陵黃尾鲴養(yǎng)殖群體的遺傳距離最遠，為0.092 74（圖1）。運用Arlequin計算各黃尾鲴養(yǎng)殖群體間的Fst，F(xiàn)st為0.040 18～0.905 01。除了長興與八里店黃尾鲴養(yǎng)殖群體之間的遺傳分化指數(shù)較低外，其他任意2個黃尾鲴養(yǎng)殖群體間的遺傳分化指數(shù)均在0.500 00以上。

黃尾鲴養(yǎng)殖群體的單倍型網(wǎng)絡關(guān)系（圖2）顯示，所研究的4個黃尾鲴養(yǎng)殖群體的單倍型具有一定的分化。醴陵、長興、雙浦和八里店黃尾鲴養(yǎng)殖群體的單倍型大致形成了3個部分。單倍型H1～H8形成了第一部分，以長興和八里店黃尾鲴養(yǎng)殖群體的個體為主。第二部包括H9～H19，雙浦黃尾鲴養(yǎng)殖群體中的個體主要集中于這一部分。醴陵黃尾鲴養(yǎng)殖群體中的個體均屬于第三部分。

3討論

線粒體DNA因其分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、進化速度快、母性遺傳等特征，已成為魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)演化關(guān)系分析的重要工具[16-17]。其中，線粒體Cyt b基因在線粒體DNA中進化速度適中，作為重要的蛋白質(zhì)編碼基因被廣泛應用于遺傳結(jié)構(gòu)分析中。本研究中獲得的128個樣本的Cyt b基因核苷酸分析結(jié)果顯示，A+T的含量（57.0%）高于G+C的含量（43.0%），4種堿基中G的含量最低（14.6%）。這與大銀魚（Protosalanx hyalocranius）[18]和棘頭梅童魚（Collichthys lucidus）[19]Cyt b基因序列中的研究結(jié)果一致，在這2種魚中，A+T的含量均高于G+C的含量，且G的含量最低。

長興黃尾鲴養(yǎng)殖群體種源來自于八里店，但其親本是由歷年多次采購的苗種培育而成。Cyt b序列分析結(jié)果表明，長興與八里店黃尾鲴養(yǎng)殖群體堿基組成更為接近，長興黃尾鲴養(yǎng)殖群體包含了八里店黃尾鲴養(yǎng)殖群體的所有單倍型，遺傳距離也是各黃尾鲴養(yǎng)殖群體之間最小的，兩群體間僅存在輕度

遺傳分化，這與實際情況一致。而醴陵黃尾鲴養(yǎng)殖群體明顯具有不同的苗種來源，其與另外3個黃尾鲴養(yǎng)殖群體間的遺傳距離較遠且遺傳分化指數(shù)較高。通過分析發(fā)現(xiàn)醴陵黃尾鲴養(yǎng)殖群體遺傳多樣性相對較低，僅有2種單倍型，且絕大部分的個體屬于其中1種單倍型。提示該批次黃尾鲴養(yǎng)殖群體可能由少量母系個體繁殖而來，逃逸至天然水域，容易對自然群體種質(zhì)的遺傳多樣性造成影響。

在本研究中，醴陵黃尾鲴養(yǎng)殖群體h值（0.226）低于0.500，π值（0.006 14）略高于0.005 00，根據(jù)Grant等[20]的標準，群體符合魚類第2種單倍型與核苷酸多樣性組合，即低h和高π類型。造成這個結(jié)果的原因可能是群體由于瓶頸效應后的快速擴增和變異的積累。其他3個群體屬于高h和高π類型。黃尾鲴絕對懷卵量為1.2×105～1.7×105粒/尾，人工繁殖技術(shù)水平已經(jīng)獲得突破。人工繁殖采用的親本數(shù)量受到訂單需求的影響，有采用較少親本進行繁殖的可能。在避免人工養(yǎng)殖群體逃逸對野生資源產(chǎn)生影響的同時，制定科學的繁育策略預防群體遺傳多樣性降低也是非常重要的。

評估群體分化的主要指標有群體間的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)。根據(jù)Shaklee等[21]的研究結(jié)果，魚類種群間遺傳距離為0.002～0.065，平均遺傳距離為0.050，本研究中部分群體間的遺傳距離高于0.065。這一方面可能是由于Shaklee等[21]提出的這個標準是基于蛋白質(zhì)電泳分析結(jié)果，其所包含的多態(tài)性位點較少；另一方面說明本研究所分析的部分黃尾鲴養(yǎng)殖群體間存在顯著的遺傳分化。Wright[22]采用遺傳分化指數(shù)（Fst）作為衡量群體間遺傳分化程度的標準，得出長興和八里店群體間遺傳分化指數(shù)小于0.05，表明存在輕度分化。本研究中其他任意2個群體間的遺傳分化指數(shù)均大于0.5，屬于極高度分化。本研究中，種群間的遺傳距離分析與Fst的分析結(jié)果相符。不同養(yǎng)殖群體間存在極高度分化，表明在放流時選擇合適的種苗來源是比較重要的。

張峻德等[11]利用線粒體CO I基因序列對千島湖水庫3個碼頭共48尾黃尾鲴的遺傳多樣性進行了分析，僅發(fā)現(xiàn)4種單倍型，CO I序列核苷酸和單倍型多樣性均低于本研究中除醴陵外的其他3個黃尾鲴養(yǎng)殖群體。這說明Cyt b基因序列具有更高的序列多樣性。因此，采用Cyt b基因序列進行遺傳多樣性分析可以作為CO I基因序列分析的重要補充，為黃尾鲴的增殖放流及種質(zhì)資源保護提供技術(shù)支持。目前GenBank中黃尾鲴Cyt b基因序列數(shù)量較少，本研究獲得的4個養(yǎng)殖群體的Cyt b數(shù)據(jù)是黃尾鲴種質(zhì)數(shù)據(jù)的重要補充。本研究結(jié)果為黃尾鲴的種質(zhì)資源放流評估、種群關(guān)系研究、保護和利用提供了重要參考依據(jù)。

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（責任編輯：陳海霞）