基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接的半夏厚樸湯合左金丸治療慢性萎縮性胃炎機制

摘要：目的通過網(wǎng)絡藥理學和分子對接分析半夏厚樸湯合左金丸治療慢性萎縮性胃炎的潛在作用途徑及合理性。方法采用TCMSP及UniProt數(shù)據(jù)庫，篩選收集復方半夏厚樸湯合左金丸有效成分及規(guī)范靶點；利用GeneCards及OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫收集CAG靶點，通過Venny2.1平臺構建交集基因；將數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.0軟件，構建PPI蛋白互作網(wǎng)絡，篩選核心靶點，利用Metascape數(shù)據(jù)庫進行GO及KEGG富集分析。最后對前四成分和靶點分別作分子對接，反向驗證其可行性及合理性。結果篩選出7味中藥共63個有效成分，206個藥物靶點，964個疾病靶點，可映射IL6、AKT1、TP53、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、MYC 9個核心靶點，涉及β-谷甾醇、豆甾醇、黃連素、槲皮素、黃芩素等核心成分，通過作用于PI3K-Akt、IL-17、Toll樣受體、Th17細胞分化、TNF等信號通路參與調控細胞增殖、凋亡及炎癥反應過程，分子對接結果顯示核心成分與靶點具有較強結合性。結論半夏厚樸湯合左金丸通過多成分，多途徑，多方面的協(xié)調作用，保護胃黏膜，干預胃炎-胃癌的發(fā)展。

關鍵詞：半夏厚樸湯合左金丸；慢性萎縮性胃炎；網(wǎng)絡藥理學研究；分子對接；機制

中圖分類號：R573.3文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2024）03-0069-09慢性萎縮性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是一種由幽門螺桿菌（HP）感染，自身免疫等多種理化因素作用致使的胃腺體萎縮，伴或不伴異型增生或腸化的消化系疾病，其病癥狀發(fā)展隱匿，經(jīng)歷了胃炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→ 異型增生→胃癌的疾病演變模式［1］，早期胃癌一般無特異性癥狀，而進展期胃癌預后較差且我國早期胃癌診治率低［2］，因此及時控制延緩炎癥-癌癥的發(fā)展［3］極為重要。

慢性萎縮性胃炎在中醫(yī)學上是屬于“胃脘痛”、“嘈雜”、“痞滿”的范疇，中醫(yī)藥為治療慢性胃炎提供了豐富獨到的經(jīng)驗，如《素問·六元正紀大論》提出胃痛病機與肝、脾功能失健有關，而《臨證指南醫(yī)案》中又倡“泄肝安胃”，以辛開苦降佐酸為用藥要點［4］。半夏厚樸湯源自《金匱要略》含有半夏、厚樸、紫蘇、茯苓、生姜；左金丸出自《丹溪心法》含黃連、吳茱萸兩味，具有疏肝行氣、降逆化痰、和胃止痛之功效。兩方合用半夏、生姜、吳茱萸味辛多散，厚樸、黃連味苦通降；半夏、黃連相配取瀉心法之意［5］；吳茱萸引藥入肝經(jīng)，助疏利肝氣，和胃降逆，佐以茯苓調中；兩方合用瀉肝平胃，復中焦升降，則胃痛呃逆得愈?，F(xiàn)代藥物研究證實左金丸抗胃腸道潰瘍效果好，抑制胃酸分泌效果佳，具有緩解炎癥，抑制疼痛，抗菌等功效［6］。半夏厚樸湯合左金丸治療慢性胃炎效果確切，需進一步研究以明確機制。

本研究通過利用藥理學多成分-多靶點-多通路特點，研究復方的核心成分及其作用靶點及通路，預測其潛在機制，并通過分子對接進一步驗證，為進一步提高療效提供基礎，也為名老經(jīng)方的傳承提供參考。

1資料與方法

1.1半夏厚樸湯合左金丸有效成分及靶點篩選在中藥系統(tǒng)藥理學分析數(shù)據(jù)庫（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中檢索復方“半夏、茯苓、厚樸、黃連、生姜、吳茱萸、紫蘇”七位中藥的基本信息。并以口服生物利用性（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為條件進行篩選，并通過查閱文獻篩除不存在對應靶點的成分。導出復方靶點，輸入UniProt（http：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫，以物種“人”“已驗證”為條件，剔除重復及不規(guī)范靶點，獲取藥物成分參與的靶點基因。

1.2慢性萎縮性胃炎疾病靶點收集在GeneCards、OMIM、DisGeNET疾病數(shù)據(jù)庫中以關鍵詞“chronic atrophic gastritis”進行檢索，將篩除重復靶點獲取，獲得慢性萎縮性胃炎疾病的靶基因。

1.3復方治療CAG潛在靶點篩選及ppi網(wǎng)絡構建利用Venny2.1網(wǎng)絡平臺對復方及慢性萎縮性胃炎疾病靶點進行分析，根據(jù)結果做出韋恩圖，作為潛在交互靶點。將復方治療CAG的潛在靶點數(shù)據(jù)導入String數(shù)據(jù)庫中，以物種“Homo sapiens”，置信度數(shù)“0.4”為條件篩選，構建蛋白基因互作網(wǎng)絡，并將ppi網(wǎng)絡導入Cytoscape3.7.0進行可視化。采用插件CytoNCA，以自由度（degree centrality，DC）、介度（betweenness Centrality，BC）、緊密度（Closeness Centrality，CC）、度值（degree）多次中位值篩選核心靶點。

1.4潛在基因靶點GO及KEGG通路富集分析采用metascape在線平臺，以P 小于0.05為條件，對復方治療CAG潛在靶點進行富集分析，分別選取前10項及通路前10項繪制氣泡圖，進行可視化。

1.5分子對接為驗證篩選出的靶點與成分結合可能性及藥物作用最佳位置，對排名前四的核心成分與排名前四的靶點分別進一步作分子對接。經(jīng)uniprot和tcmsp數(shù)據(jù)庫查詢小分子mol.2文件及大分子pdb文件，經(jīng)pymol軟件去除蛋白質大分子水和溶劑分子，將所得pdb文件經(jīng)AutoDock tools 1.5.7軟件加全氫，導出受體pdbqt文件。再將成分小分子導入，加全氫，分配電荷及設置扭轉鍵后導出配體pdbqt文件。設置兩者半柔性對接，獲得對接分數(shù)后作可視化熱圖，并經(jīng)pymol可視化處理。

2結果

2.1半夏厚樸湯合左金丸有效成分及對應靶點經(jīng)TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢半夏厚樸湯合左金丸復方成分，經(jīng)OB≥30%、DL≥0.18篩選并篩除無靶點的成分后獲得63個有效成分，將基因靶點輸入unitprot規(guī)范后獲得1030個靶點基因，刪除重復得206個藥物作用靶點。將成分及靶點導入Cytoscape3.7.0制作中藥-成分-靶點網(wǎng)絡。見圖1。根據(jù)度值（degree）篩選出排名前十的藥物成分，度值越大代表在網(wǎng)路圖中越重要，在治療中發(fā)揮作用的可能性越大，見表1。由表可知β-谷甾醇（beta-sitosterol）是半夏、生姜、吳茱萸、紫蘇的共用成分，槲皮素（quercetin）是黃連、吳茱萸的共有成分，豆甾醇（Stigmasterol）是半夏、生姜共同成分，黃連素（berberine）是黃連、吳茱萸共用成分，充分體現(xiàn)了中醫(yī)藥學治病整體作用的特點。

2.2慢性萎縮性胃炎疾病靶點篩選結果分別在GeneCard和OMIM、DisGeNET數(shù)據(jù)庫中搜索CAG疾病靶點，分別獲得812 、86、203個基因，刪除重復值后共得到964個與人類相關的CAG靶點。

2.3藥物與疾病交靶點將復方藥物基因靶點與CAG基因靶點做韋恩圖，共得到96個共同靶點，作為藥物治療CAG的潛在靶點，見圖2。

2.4蛋白互作PPI網(wǎng)絡及核心靶點將半夏厚樸湯合左金丸與CAG的靶點基因導入到Sting數(shù)據(jù)庫中，獲得個96蛋白質節(jié)點2013條邊的PPI網(wǎng)絡，導入Cytoscape繪制PPI可視化網(wǎng)絡。見圖3。利用CytoNCA插件對PPI網(wǎng)絡進行拓撲學分析，對BC、CC、DC多次卡中位數(shù)方法，最終得到9個紅色核心基因，分別為AKT1、TP53、VEGFA、IL6、TNF 、CASP3、EGFR、 PTGS2、MYC見圖4、表2。這些核心靶點在整個網(wǎng)絡中起樞紐作用，可能在半夏厚樸湯合左金丸治療CAG過程中發(fā)揮重要作用。

2.6復方與疾病KEGG富集分析復方治療CAG的潛在靶點在KEGG上映射后，結果顯示共可獲得191條通路，取其前的10項進行可視化，圖中P值越小顏色越紅，代表富集越豐富，見圖6。結果表明復方治療CAG涉及PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、IL-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）、Th17細胞分化、TNF信號通路

（TNF signaling pathway）等經(jīng)典信號通路，還可作用于麻疹、甲型流感、利什曼病、肺結核等疾病。同時作復方-成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)路圖，見圖7。由此可知，復方治療CAG作用機制可能與細胞代謝、免疫、抑癌等多環(huán)節(jié)有關，并可干預其他系統(tǒng)疾病，體現(xiàn)中醫(yī)治病的整體特點。

2.7分子對接復方核心成分槲皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黃芩素分別與AKT1、TP53、VEGFA、IL6核心靶點分子對接，將結合能作熱圖，見圖8。結合能小于-5kcal/mol提示結合效果較好，小于-7kcal/mol表示強結合性。結果表明成分與靶點有較強的結合性，提示復方治療CAG具有良好的適配性和可行性。同時對每種成分與4個基因對接結果中的最優(yōu)項進行展示，即槲皮素與AKT1；木犀草素與TP53；β-谷甾醇與AKT1；黃芩素與TP53，見圖9。結合能最高的是β-谷甾醇與AKT1為-8.72Kcal/mol，與殘基ARG-367形成氫鍵。上述對接結果驗證了網(wǎng)絡藥理學結果。

慢性萎縮性胃炎在臨床上多以胃脘部痞滿脹痛，噯氣時作或伴反酸燒心，食欲欠佳等為主要表現(xiàn)［7］。其病機多于肝膽、脾、胃相關，因情志失調，飲食五味所傷，勞倦，先天稟賦等易致肝膽失于疏泄，脾轉運失調，中焦氣機受阻滯，不通則痛，橫逆乘于胃，致胃氣上逆；或肝郁而化熱，濕熱熏蒸，日久夾痰、瘀，使脾胃生化乏源，失于榮養(yǎng)［8］。半夏厚樸湯、左金丸為經(jīng)典方劑，半夏降逆止嘔，吳茱萸疏肝解郁，降逆止痛，紫蘇味辛行氣和胃，三者調理中焦氣機，使肝氣調達，脾胃升降得復，加以生姜增強氣機上逆止嘔功效；黃連苦寒清熱燥濕，并添性平歸脾經(jīng)之茯苓，調中健脾，使胃炎得以愈?，F(xiàn)代研究證實半夏厚樸湯具有調節(jié)胃腸動力［9］、抗炎［10］等作用，左金丸具有抑癌［11］、抗炎等作用。由于中藥的成分復雜，半夏厚樸湯合左金丸治療CAG的機制尚不清晰，用網(wǎng)絡藥理學研究復方具體機制為進一步治療提供參考。

本研究應用網(wǎng)藥探索了半夏厚樸湯合左金丸治療CAG的潛在作用機制，篩選出了半夏厚樸湯合左金丸63中有效成分，并通過蛋白互作構建“ppi網(wǎng)絡圖”及“藥物-核心靶點-成分圖”，篩選出包括IL6、AKT1、TP53、VEGFA、TNF、CASP3、EGFR、PTGS2、MYC等9個核心基因靶點及10種關鍵成分。其中多種成分是中藥所共有，該結果顯示復方治療CAG多途徑、多維度的特點。9個核心基因在蛋白互作中發(fā)揮重要樞紐作用，預測它們是復方治療CAG的主要作用靶標。據(jù)文獻報道，AKT1屬于蘇氨酸蛋白激酶，是P13K/AKT/MTOR 信號通路的重要下游效應反應物，通過調節(jié)MTOR 信號傳導參與葡萄糖代謝和蛋白質合成，增加慢性胃炎惡化風險［12］，通過抑制AKT活性，使人參具有核因子-kB靶向抗炎作用，參與胃炎、結腸炎等抗炎活動［13］。IL-6是多種免疫細胞的效應因子，IL-6的被動上調，誘導STAT3釋放活性氧（ROS）成分，引起胃黏膜上皮炎癥反應，刺激黏膜腸化加速淺表性胃炎發(fā)展［14］。而TP53、TNF基因是重要的抑癌基因，它們參與細胞增殖、分化、凋亡等環(huán)節(jié)，其基因的異常表達可加速胃黏膜凋亡，抑制黏膜修復［15-16］，并調控多種炎癥性疾?。?7］。藥物“成分-核心靶點網(wǎng)絡圖表明半夏、生姜、吳茱萸、紫蘇含有的β-谷甾醇，半夏、生姜含有的豆甾醇，黃連、吳茱萸含有的黃連素、槲皮素等成分是半夏厚樸湯合左金丸治療CAG的重要基礎。研究表明豆甾醇和β-谷甾醇同屬于植物甾醇，豆甾醇也可參與解熱抗炎，免疫機制調節(jié)、抗氧化等代謝過程，通過抑制環(huán)氧合酶-2（COX-2）和前列腺素E2（PGE2）的釋放，增強抗炎功效［18］。豆甾醇、β-谷甾醇可通過下調P13K/ATM及mTOR通路的表達，誘導細胞產(chǎn)生自噬效應，抑制胃癌細胞的產(chǎn)生，促進其凋亡［19］。還可增加氧自由基酶活性，提高機體清除自由基的能力，抑制促炎因子TNF-α的釋放，增強抗炎作用并保護胃黏膜［20］。槲皮素可通過下調MMP9基因以阻斷腫瘤壞死因子TNF所誘導的胃黏膜損傷，發(fā)揮在胃炎中的抗炎作用［21］。同時黃連素可通過調節(jié)MAPKs信號通路抑制（IL-6、IL-1β、TNF-α）炎癥因子釋放，起到抗炎作用［22］。

通路富集分析譜圖結果表明，半夏厚樸湯合左金丸治療CAG主要涉及PI3K-Akt、IL-17、Toll樣受體、TNF等信號通路及部分病毒癌癥相關通路。體現(xiàn)出治療疾病的整體性、協(xié)調性特點。Toll樣受體（TLR）的信號通路研究中，家族跨膜蛋白TLR4信號可誘導激活NF-κB蛋白，進而直接調控相關基因的轉錄，激活并提高白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、TNF-α等促炎因子的釋放水平［23］，這些因子與炎癥病變發(fā)展緊密關聯(lián)，這其中IL-1β因子的異常釋放還可減少胃酸生成分泌，加劇慢性胃黏膜萎縮壞死［24］；而TLR5激動劑則能激活PI3K-Akt通路上調NF-κB、TNF-α［25］，促使良性胃炎向惡性胃癌方向轉變；同時TLR9信號通路可以抑制Th1的轉錄分化，降低嗜中性粒細胞浸潤能力和TNF-α的表達，抑制炎癥活動［26］。 PI3K-AKT是目前治療慢性胃炎重要通路之一。研究表明，多種中藥成分可通過激活PI3K-AKT通路，降低下游NF-КB等炎癥因子表達，抑制細胞浸潤、炎癥滲出［27-28］。磷脂酰肌醇激酶PI3K參與調節(jié)基因轉錄和細胞代謝過程，其催化反應的產(chǎn)物對細胞增殖、粘附、存活起重要作用［29］。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 AKT可被 PI3K 介導的信號轉導激活，從而調節(jié)細胞存活，阻斷PI3K/Akt通路后，胃癌細胞的侵襲和生存力明顯降低［30］。IL- 17在自身免疫性疾病、殺滅病原感染、調節(jié)免疫平衡等發(fā)揮重要作用［31］，TNF通路廣泛參與抑制細胞增殖、誘導分化、抗感等生物學進程［32］。

綜上，半夏厚樸湯合左金丸可能是通過β-谷甾醇、豆甾醇、黃連素、黃芩素、槲皮素等有效成分調節(jié)IL6、AKT1、TP53、VEGFA、TNF等關鍵基因，進而作用于PI3K-Akt、IL-17、Toll樣受體、TNF等信號通路，參與調控細胞增殖、凋亡及炎癥等反應過程，抑制胃炎向胃炎的轉變。該研究為復方治療CAG提供了理論借鑒，后期將進一步實驗論證其具體機制。參考文獻：

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