發(fā)酵乳和乳飲料中乳酸菌活菌數(shù)ATP檢測方法的開發(fā)與應(yīng)用

摘 要：乳酸菌活菌數(shù)作為發(fā)酵乳和乳酸菌飲料的產(chǎn)品質(zhì)量屬性，同時作為國家風(fēng)險抽檢項目，目前的檢測方法存在操作煩瑣、檢測周期長、結(jié)果滯后等缺點，無法滿足企業(yè)產(chǎn)品賣點宣稱及質(zhì)量控制，故針對發(fā)酵乳和乳飲料中乳酸菌活菌數(shù)的快速檢測方法進(jìn)行開發(fā)、研究，旨在提高檢測結(jié)果準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性及縮短檢測周期。每種微生物中的腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）含量都是基本恒定的，而ATP的相對發(fā)光單位（Relative Luminescence Unit，RLU）與ATP含量呈線性關(guān)系，通過建立產(chǎn)品中乳酸菌數(shù)量與ATP的RLU（相對發(fā)光單位）的相關(guān)關(guān)系開發(fā)乳酸菌快速檢測方法。通過試驗證實該方法與國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法具有一致性，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測產(chǎn)品中乳酸菌數(shù)活菌數(shù)，為生產(chǎn)銷售流通中的質(zhì)量監(jiān)測提供一種快捷方便的方法。

關(guān)鍵詞：乳酸菌總數(shù)；腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）；發(fā)酵乳；發(fā)酵乳飲料；快速檢測

Development and Application of ATP Detection Method for Lactobacillus Viable Count in Fermented Milk and Milk Beverage

WANG Hui1， WEI Liming2， LIU Chao2， YU Dongwei3， LU Gang3*

（1.Mengniu Hi-Tech Dairy Products （Beijing） Co.， Ltd.， Beijing 101100， China; 2.Mengniu Dairy （Tianjin） Co.， Ltd.， Tianjin 301700， China; 3.Inner Mongolia Mengniu Dairy （Group） Co.， Ltd.， Hohhot 011500， China）

Abstract： As the product quality attribute of fermented milk and lactic acid bacteria beverage， and as a national risk sampling project， the current detection method has the shortcomings of cumbersome operation， long detection cycle and lagging results， which cannot meet the selling point claim and quality control of enterprises， so the rapid detection method for the number of live lactic acid bacteria in fermented milk and milk beverage is developed and studied， aiming to improve the accuracy， stability and shortening of the detection cycle. The research data showed that the ATP content in each microorganism was basically constant， and the RLU （relative luminescence unit） of ATP was linearly related to the ATP content. Develop a rapid detection method for lactic acid bacteria by establishing a correlation between the number of lactic acid bacteria in the product and the relative luminescence unit （RLU） of ATP. The test proves that the method is consistent with the national standard detection method， which can quickly and accurately detect the number of lactic acid bacteria and the number of viable bacteria in the product， and provide a fast and convenient method for quality monitoring.

Keywords： total number of lactic acid bacteria; adenosine triphosphate（ATP）; fermented milk; fermented milk drink; quick detection

目前，發(fā)酵乳及乳飲料中乳酸菌活菌數(shù)的檢測均依據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)方法開展，該類方法檢測過程煩瑣、檢測周期較長、關(guān)鍵指標(biāo)結(jié)果出具時間滯后，對生產(chǎn)過程質(zhì)量控制帶來極大的不便，同時檢測結(jié)果受人員操作、培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度等因素的影響較多，結(jié)果準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性差。為降低上述缺陷帶來的質(zhì)量風(fēng)險，需要建立一種快速檢測乳酸菌活菌數(shù)的方法并應(yīng)用于產(chǎn)品質(zhì)量控制[1]。

本研究引入腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）檢測系統(tǒng)，通過測定樣品中的ATP濃度，即可推算出活菌數(shù)。隨著ATP濃度的增加，相對發(fā)光單位（Relative Luminescence Unit，RLU）越來越高，ATP濃度與RLU存在線性關(guān)系[2]。該方法操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、檢測周期短，單個樣品檢測僅需10 min。ATP生物發(fā)光法有望發(fā)展為方便、快速、經(jīng)濟(jì)的微生物檢測方法，在食品工業(yè)上將展示出廣泛的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 樣品、儀器與試劑

1.1.1 樣品

蒙牛優(yōu)益C乳酸菌飲料、蒙牛冠益乳、大果粒發(fā)酵乳，以及蒙牛杯酸發(fā)酵乳。

1.1.2 儀器

EPIC熒光儀（LUM-EPIC）；恒溫培養(yǎng)箱：（36±1）℃；天平：感量0.01 g。

1.1.3 試劑

儀器配套的檢測試劑、日常清洗試劑盒（EPIC-CLEAN）、日常監(jiān)控試劑盒（EPIC-CTRL）、96孔微孔板（EPIC-MP-96-50）、無菌生理鹽水。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

無菌生理鹽水（0.85%）：稱取氯化鈉8.5 g加入1 000 mL的蒸餾水中，加熱溶解，分裝后121 ℃高壓滅菌15～20 min。

1.2.2 樣品制備

取產(chǎn)品將其充分搖勻后，無菌操作稱取樣品25 g放入裝有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶中，充分振搖，制成1∶10的樣品勻液。吸取10倍樣品稀釋液50 μL轉(zhuǎn)移至微孔中。

1.2.3 樣品檢測

產(chǎn)品經(jīng)過前處理后，置于無菌容器中混勻，移取50 μL樣品到微孔板微孔中。使用EPIC熒光儀檢測。

1.2.4 結(jié)果計算

所有待測樣品孔檢測完成后，輸出PDF版本樣品RLU值結(jié)果，各樣品依據(jù)閾值進(jìn)行判定即可。

2 結(jié)果與分析

2.1 ATP檢測方法在發(fā)酵乳中的應(yīng)用

2.1.1 ATP信號值與乳酸菌濃度的相關(guān)性分析

為了確定ATP熒光信號強度與發(fā)酵乳中乳酸菌含量的關(guān)系，根據(jù)微生物的生長規(guī)律，選擇0 h、

24 h和48 h的樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性方程、相關(guān)系數(shù)見圖1、圖2、圖3。由圖1、圖2、圖3可知，產(chǎn)品生產(chǎn)后0 h、24 h、48 h，所有樣品的ATP信號值（RLU）與乳酸菌總數(shù)均有良好的相關(guān)性，其R2均＞0.99。

2.1.2 發(fā)酵乳閾值的設(shè)定

使用發(fā)酵乳樣品上機檢測，選擇10批次發(fā)酵乳產(chǎn)品，依據(jù)1.2的步驟處理后上機檢測，每個樣品重復(fù)檢測8次，根據(jù)檢測結(jié)果設(shè)定閾值。由表1可知，所有樣品的RLU值范圍為294～3 480，大于294的樣品乳酸菌數(shù)都大于1.0×107 cfu·g-1，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》（GB 19302—2010）要求為≥1.0×106 cfu·g-1，能夠滿足國家標(biāo)準(zhǔn)要求，故可以采用熒光值大于294作為放行標(biāo)準(zhǔn)，但是需要結(jié)合工廠實際品項及風(fēng)險考慮（實際產(chǎn)品活菌數(shù)多處于108～109 cfu·g-1），應(yīng)加嚴(yán)快檢方法的閾值設(shè)定，即采用較高的ATP（RLU）為放行標(biāo)準(zhǔn)，這樣既滿足國家標(biāo)準(zhǔn)要求，也能在滿足高效檢測的基礎(chǔ)上降低產(chǎn)品不合格放行風(fēng)險，所以對于發(fā)酵乳制品根據(jù)目前數(shù)據(jù)可以ATP（RLU）值大于3 000 RLU為放行標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.3 發(fā)酵乳ATP測定法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果比對

以發(fā)酵乳產(chǎn)品為試驗對象，通過兩種方法測定乳酸菌活菌數(shù)試驗結(jié)果見表2。說明ATP檢測方法與國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法在結(jié)果判定上具有一致性。

2.2 ATP檢測方法在乳酸菌飲料中的應(yīng)用

2.2.1 ATP信號值與乳酸菌濃度的相關(guān)性分析

為了確定ATP熒光信號強度與乳酸菌飲料中乳酸菌含量的關(guān)系，根據(jù)微生物的生長規(guī)律選擇0 h、24 h和48 h的樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖4、圖5和圖6。所有樣品的ATP信號值（RLU）與乳酸菌總數(shù)均有良好的相關(guān)性，其R2均＞0.99。

2.2.2 乳酸菌飲料閾值的設(shè)定

使用乳酸菌飲料樣品上機檢測，選擇10批次乳酸菌飲料產(chǎn)品，依據(jù)1.2步驟處理后上機檢測，根據(jù)檢測結(jié)果設(shè)定閾值。由表3可見，20種RLU值的范圍為8 918～20 345，大于8 918 RLU的樣品乳酸菌數(shù)都大于7.6×108 cfu·g-1，目前依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》（GB 19302—2010）要求為≥1.0×106 cfu·g-1，能夠滿足國家標(biāo)準(zhǔn)要求，可以采用熒光值大于8 918 RLU作為放行標(biāo)準(zhǔn)，考慮實際產(chǎn)品活菌數(shù)多處于108～109 cfu·g-1范圍（其10倍生理鹽水稀釋液熒光值處于10 000以上），故可以加嚴(yán)快檢方法的閾值設(shè)定，采用較高的ATP（RLU）為放行標(biāo)準(zhǔn)，在滿足高效檢測的基礎(chǔ)上降低產(chǎn)品不合格放行風(fēng)險，所以對于乳酸菌飲料產(chǎn)品根據(jù)目前數(shù)據(jù)可以ATP（RLU）值大于8 000 RLU為放行標(biāo)準(zhǔn)[3]。

表3可以看出，最低值8 918時產(chǎn)品乳酸菌數(shù)已達(dá)到108 cfu·g-1，滿足蒙牛乳制品（天津）有限責(zé)任公司的質(zhì)量要求及產(chǎn)品宣稱，故定8 000即可[4]。

2.2.3 乳酸菌飲料ATP測定法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果比對

以乳酸菌飲料產(chǎn)品為試驗對象，根據(jù)兩種方法測定乳酸菌活菌數(shù)試驗結(jié)果見表4。說明ATP檢測方法與國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法在結(jié)果判定上具備一致性。

2.3 影響因素分析

2.3.1 檢測時間對乳酸菌數(shù)的影響分析

將發(fā)酵乳、乳酸菌飲料按類型各自抽取3批產(chǎn)品分別在0 h、24 h、48 h進(jìn)行檢測，分析檢測時間對乳酸菌數(shù)的影響，結(jié)果見表5。0 h與24 h的乳酸菌數(shù)t值（t=0.294＜t0.05，2=4.303），24 h與48 h的乳酸菌數(shù)t值（t=0.825＜t0.05，2=4.303），0 h與48 h的乳酸菌數(shù)t值（t=0.313＜t0.05，2=4.303），兩兩之間的t值均小于t0.05，2，說明不同檢測時間下乳酸菌數(shù)之間無顯著差異。由此證明檢測時間對乳酸菌總數(shù)無明顯影響，48 h內(nèi)檢測均能保證結(jié)果的準(zhǔn)確性[5-6]。

2.3.2 游離ATP對實驗結(jié)果的影響

食品中的ATP包括游離ATP和微生物ATP，首先通過ATP降解酶酶解微生物細(xì)胞外的游離ATP，之后裂解微生物活細(xì)胞，釋放出微生物活細(xì)胞內(nèi)的ATP，游離ATP經(jīng)過處理后上機檢測，分析游離ATP對實驗結(jié)果的影響程度。由表6可知，t=0.481＜t0.05，5=2.571，說明游離ATP經(jīng)預(yù)處理后的檢測結(jié)果與正常程序獲得的檢測結(jié)果之間無顯著差異，游離ATP對檢測結(jié)果無顯著影響，無需對游離ATP進(jìn)行處理。

3 結(jié)論

本文對發(fā)酵食品中乳酸菌快速檢測技術(shù)-ATP生物發(fā)光法進(jìn)行技術(shù)可行性研究，通過與國家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比對、檢測時間和游離ATP對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性影響因素等各方面充分進(jìn)行分析論證，證明本方法具有結(jié)果準(zhǔn)確、快速、操作簡單等優(yōu)點，適用于發(fā)酵食品中乳酸菌總數(shù)的快速分析檢測。但目前本試驗只針對高含量活菌產(chǎn)品的準(zhǔn)確性和適用性進(jìn)行了驗證，其他類型的產(chǎn)品或含菌量低、菌株復(fù)雜的產(chǎn)品在準(zhǔn)確度方面仍面臨挑戰(zhàn)。使用過程應(yīng)關(guān)注以下幾個方面。①樣品若被多種菌屬污染，如同時含大腸菌群、致病菌等，該方法無法區(qū)分，統(tǒng)一計數(shù)為活菌數(shù)，易造成結(jié)果偏差或產(chǎn)品不合格誤判為合格，需同步驗證其他微生物生長情況。②該方法靈敏度高，可持續(xù)開發(fā)應(yīng)用于食品生產(chǎn)線、食品器件的清潔度評價，以及微生物檢測領(lǐng)域消毒滅菌效果驗證。③該方法可嘗試用于滅菌乳、罐頭食品的商業(yè)無菌檢測，也可開發(fā)用于生乳驗收過程菌落總數(shù)的測定。

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[5]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局.中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.含乳飲料：GB/T 21732—2008[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[6]中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.發(fā)酵型含乳飲料：NY/T 799—2004[S].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2004.

基金項目：2021—2024年呼和浩特市科技計劃項目（重大科技專項），乳制品食品安全風(fēng)險識別及品質(zhì)控制技術(shù)研究（2021-農(nóng)-重-1）。

作者簡介：王慧（1982—），女，天津人，本科，副高級工程師。研究方向：乳品檢驗分析、乳品質(zhì)量控制。

通信作者：逯剛（1978—），男，吉林長春人，碩士，高級工程師。研究方向：食品安全與風(fēng)險研究。E-mail： lugang@mengniu.cn。