超高效液相串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定果凍中胭脂紅酸

摘 要：建立了超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀測(cè)定果凍中胭脂紅酸含量的方法。樣品通過(guò)鹽酸水溶液酸化提取，并經(jīng)過(guò)HLB固相萃取柱凈化后，上機(jī)測(cè)定，基質(zhì)外標(biāo)法定量。胭脂紅酸在5～200 ng·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)＞0.999，方法的檢出限為3.36 ng·g-1，定量限為11.21 ng·g-1。在不同濃度的加標(biāo)水平下，回收率為91.2%～98.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜2%。本方法污染小，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于果凍中胭脂紅酸的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：胭脂紅酸；果凍；超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法

Determination of Carminic Acid in Jelly by Ultra High Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry

WANG Qiang

（Maanshan Institute for Food and Drug Control and Adverse Drug Reaction， Maanshan 243000， China）

Abstract： A method for the determination of carminic acid content in jelly using ultra high performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometer was established. The sample was acidified and extracted with hydrochloric acid aqueous solution， and after purification with an HLB solid-phase extraction column， it was measured on an instrument and quantified by the matrix external standard method. The linearity of carminic acid was good in the range of 5～200 ng·mL-1 with the correlation coefficient＞0.999. The limit of detection of the method was 3.36 ng·g-1， and the limit of quantification was 11.21 ng·g-1. The recoveries ranged from 91.2% to 98.2% at the spiked levels of different concentrations， and the relative standard deviations were all＜2%. The method is characterized by low contamination， simple operation， accurate results and suitable for the determination of carminic acid in jelly.

Keywords： carminic acid; jelly; ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry

胭脂紅酸為胭脂蟲紅的主要成分[1]，具有蒽醌類結(jié)構(gòu)[2]。胭脂蟲紅具有無(wú)毒、耐熱、抗光和染色能力極強(qiáng)等特性，其應(yīng)用涵蓋食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[3-5]。胭脂蟲紅雖為天然色素，但也會(huì)引發(fā)過(guò)敏和兒童多動(dòng)癥等不良反應(yīng)[6]，因此對(duì)胭脂蟲紅的使用需要加強(qiáng)監(jiān)督。目前檢測(cè)胭脂紅酸的方法有薄層色譜法[7]、毛細(xì)管電泳法[8]、高效液相色譜法[9]、超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法（Ultra High Performance Liquid Chromatography-Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）[10]等。薄層色譜法、毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法對(duì)于復(fù)雜樣品難以分離目標(biāo)物，檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確[11]。目前UPLC-MS/MS法檢測(cè)胭脂紅酸仍有不足之處，如操作復(fù)雜、試劑耗材多、凈化效果不理想等，對(duì)此本文優(yōu)化了前處理方法和色譜條件，可以簡(jiǎn)單準(zhǔn)確地檢測(cè)胭脂紅酸的含量，為市場(chǎng)監(jiān)管提供的技術(shù)支持，保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

Arium-Pro型純水機(jī)，Sartori-us（德國(guó)）；ME204E/02型天平（萬(wàn)分之一），METTLER TOLEDO（瑞士）；T25型分散機(jī)，IKA（德國(guó)）；SepLine-S4型全自動(dòng)固相萃取裝置，萊伯泰科（美國(guó)）；DMT-2500型多管渦旋混合儀，米歐儀器（中國(guó)）；SHA-BA型水浴恒溫振蕩器，諾基儀器（中國(guó)）；N-EVAP5085型氮吹儀，Organomation（美國(guó)）；HC-3018型臺(tái)式高速離心機(jī)，中科中佳（中國(guó)）；0.22 μm微孔濾膜，安譜（中國(guó)）；3500型超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，AB（美國(guó)）。

1.2 材料與試劑

胭脂紅酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，由DR提供；甲醇（質(zhì)譜純），賽默飛；鹽酸（分析純），阿拉??；甲酸（質(zhì)譜純），賽默飛；實(shí)驗(yàn)室用水均為超純水。

HLB固相萃取柱：200 mg、6 mL（60 μm）（納譜科技），分別使用6 mL甲醇和6 mL水進(jìn)行活化。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液配制

鹽酸水溶液（2 mol·L-1）：量取84 mL鹽酸至400 mL水中，混勻后，移入500 mL容量瓶中并用水定容至刻度線，搖勻。

胭脂紅酸儲(chǔ)備液（1.0 mg·mL-1）：稱取0.100 0 g標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解，并用甲醇定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，4 ℃下避光保存。

胭脂紅酸中間液（1.0 μg·mL-1）：移取100 μL"1.0 mg·mL-1胭脂紅酸儲(chǔ)備液，至100 mL容量瓶中，并用2%甲酸水溶液-甲醇（1+1，v/v）稀釋并定容至刻度線。

胭脂紅酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別移取1.0 μg·mL-1胭脂紅酸中間液5 μL、10 μL、50 μL、100 μL和200 μL至2 g（精確至0.000 1 g）的空白樣品中，配成帶基質(zhì)的5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的胭脂紅酸標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理

（1）提取。稱取2 g樣品（精確至0.000 1 g）于50 mL離心管中，加入20 mL 2 mol·L-1鹽酸水溶液，使用分散機(jī)10 000 r·min-1勻漿3 min后，于100 ℃振搖30 min。之后冷卻至室溫，超聲提取10 min，10 000 r·min-1離心10 min，上清液移入100 mL容量瓶中。重復(fù)提取一次，合并上清液，用水定容至刻度，搖勻，備用。

（2）凈化。準(zhǔn)確移取10 mL上述備用液，至活化后的HLB固相萃取柱中，控制流速為1 mL·min-1，用12 mL水進(jìn)行淋洗，抽干，用9 mL甲醇洗脫。洗脫液于40 ℃水浴中氮吹至近干，使用1.0 mL 2%甲酸水溶液-甲醇（1+1，v/v）進(jìn)行復(fù)溶，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供UPLC-MS/MS上機(jī)測(cè)定，所得圖譜見圖1。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18柱（150 mm×3.0 mm，3 μm）；柱溫：35 ℃；流速：0.5 mL·min-1；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相A：0.3%甲酸水溶液；流動(dòng)相B：甲醇；梯度洗脫程序見表1。

1.3.4 質(zhì)譜條件

掃描模式：負(fù)離子模式；監(jiān)測(cè)模式：MRM；電噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：650 ℃；霧化氣壓：55 psi；輔助氣壓：55 psi；氣簾氣壓力：40 psi；碰撞氣壓力：9 psi。胭脂紅酸的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱溫度的選擇

本文選擇25 ℃、50 ℃、100 ℃ 3個(gè)溫度作為加熱提取的溫度，按照1.3實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。

25 ℃、50 ℃、100℃鹽酸水溶液的回收率分別為15%、50%、96%。依據(jù)回收率效果，選擇100 ℃作為加熱提取的溫度。

2.2 固相萃取柱的選擇

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中比較聚酰胺SPE柱、混合型強(qiáng)陰離子SPE柱、HLB SPE柱3種固相萃取柱的凈化效果，按照1.3實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。聚酰胺SPE柱、混合型強(qiáng)陰離子SPE柱、HLB SPE柱的回收率分別為32%、57%、96%。由于聚酰胺SPE柱和混合型強(qiáng)陰離子SPE柱的洗脫液分別用到氨水[11]和磷酸，在氮?dú)鉂饪s的過(guò)程中，隨著有機(jī)試劑的揮發(fā)，氨水和磷酸濃度增加，使得目標(biāo)物分解從而導(dǎo)致回收率低下。依據(jù)回收率結(jié)果，選用HLB SPE柱作為凈化柱。

2.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

對(duì)比了甲酸水-酸化乙腈、乙酸銨-甲醇、甲酸水-甲醇作為流動(dòng)相對(duì)待測(cè)物的影響，結(jié)果表明3種流動(dòng)相對(duì)胭脂紅酸色譜峰形、響應(yīng)值、分離度的影響較小，從試劑的毒性和配制方便性考慮，最終選擇甲酸水-甲醇作為本次實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

2.4 方法的線性范圍、檢出限、定量限

胭脂紅酸在5～200 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=3 548.918 35x+5 674.592 75，相關(guān)系數(shù)＞0.999。以3倍S/N（信噪比）和10倍S/N（信噪比）對(duì)應(yīng)的含量作為方法的檢出限和定量限，得到本方法的檢出限為3.36 ng·g-1，定量限為11.21 ng·g-1。

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

如表3所示，對(duì)空白樣品進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)，樣品在50.0 ng·g-1、100.0 ng·g-1、250.0 ng·g-1加標(biāo)水平下，回收率為91.2%～98.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.70%～1.80%（n=6），表明方法的精密度和準(zhǔn)確度良好，滿足方法要求。

3 結(jié)論

本文采用鹽酸水溶液酸化提取色譜樣品，HLB SPE小柱凈化、濃縮，建立了超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定果凍中胭脂紅酸的分析方法。本方法有機(jī)試劑用量少、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，不僅為市場(chǎng)監(jiān)管提供了技術(shù)支持，保障人們的食品安全，也為食品生產(chǎn)企業(yè)胭脂紅酸質(zhì)量控制提供了參考。

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