痰常規(guī)培養(yǎng)和RT-PCR對鏈球菌和克雷伯菌肺炎的鑒別價值

曾燕 張金平 劉揚(yáng)成 張傳圣

【摘要】 目的 探討鏈球菌和克雷伯菌肺炎診斷中痰常規(guī)培養(yǎng)和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain

reaction，RT-PCR）的應(yīng)用價值。方法 選取2022年6月—2022年12月在會昌縣中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院就診的78例疑似鏈球菌肺炎患者與克雷伯菌肺炎患者作為研究對象，結(jié)合臨床癥狀、影像學(xué)和培養(yǎng)法檢測結(jié)果，確診單一病原體感染肺炎。對患者進(jìn)行痰常規(guī)培養(yǎng)和RT-PCR檢測，比較2種檢測方法的陽性檢出率和診斷價值。結(jié)果 RT-PCR檢測在肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae，S.pn）、肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae，Kpn）中的檢出率較痰常規(guī)培養(yǎng)更高（P＜0.05）；RT-PCR檢測在S.pn、Kpn診斷中的靈敏度和陰性預(yù)測值較痰常規(guī)培養(yǎng)更高（P＜0.05）。結(jié)論 在鏈球菌和克雷伯菌肺炎診斷過程中，RT-PCR檢測的應(yīng)用能夠提高陽性診斷率，為后續(xù)治療提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】 痰常規(guī)培養(yǎng)；熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)；肺炎鏈球菌；肺炎克雷伯菌

文章編號：1672-1721（2024）04-0106-03? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ?中國圖書分類號：R563.1

肺炎鏈球菌（S.pn）、肺炎克雷伯菌（Kpn）感染是導(dǎo)致肺炎發(fā)生的重要原因之一。前者屬于革蘭陽性球菌，可導(dǎo)致腦膜炎、支氣管炎等疾病的發(fā)生。后者屬于革蘭陰性桿菌，正常人群攜帶率約為10%，可導(dǎo)致肺部感染的發(fā)生[1]。有資料顯示，發(fā)展中國家5歲兒童中，S.pn所導(dǎo)致的肺炎病死率達(dá)到500萬人/年。廣譜抗生素是治療肺炎的有效方法，但濫用容易導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生，不利于疾病治療，會增加患者病死風(fēng)險，因此，應(yīng)在疾病發(fā)生早期進(jìn)行及時明確的診斷[2]。痰常規(guī)培養(yǎng)在臨床中的應(yīng)用較為廣泛。近幾年，隨著分子生物學(xué)檢驗實驗室在縣級醫(yī)療和疾控機(jī)構(gòu)的普及，RT-PCR檢測方法逐漸得到應(yīng)用，但臨床對于2種檢測方式在S.pn和Kpn中的應(yīng)用價值未進(jìn)行探討?；诖?，本研究對78例患者進(jìn)行研究，旨在探討不同檢測方式對鏈球菌和克雷伯菌肺炎陽性檢出率和診斷價值的影響，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年6月—2022年12月會昌縣中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院收治的78例肺炎患者作為研究對象，其中男性42例、女性36例；年齡2～87歲，平均年齡（42.39±3.27）歲；合并吸煙史者35例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批，患者及其家屬知情并簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡2～87歲；存在發(fā)熱、胸痛、咳嗽、咳痰、呼吸困難或呼吸音異常等癥狀；影像學(xué)檢測肺部存在異常；臨床資料完整。

排除標(biāo)準(zhǔn)：病毒性感染肺部疾病者；合并惡性腫瘤者；免疫抑制者；合并其他肺部疾病者。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集

患者使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉注射液（北京天壇生物制品股份有限公司，國藥準(zhǔn)字S10870001）漱口，同時使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉注射液對口腔殘留物質(zhì)進(jìn)行沖洗，將深處痰液咳出，置于無菌盒中。若患者無法順利咳出痰液，則使用15 mL 45 ℃質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉注射液對患者進(jìn)行霧化或無菌操作以吸痰取樣。取樣后立即將樣本送至實驗室進(jìn)行檢測。通過顯微鏡觀察標(biāo)本是否合格，其中鱗狀上皮細(xì)胞≤10個/低倍視野、多核白細(xì)胞≥25個/低倍視野為合格。樣本不合格則需重新采樣送檢。分取部分痰液進(jìn)行痰常規(guī)培養(yǎng)，另取1 mL標(biāo)本轉(zhuǎn)移到環(huán)氧己烷滅菌螺口管中進(jìn)行RT-PCR檢測。若超過24 h不能及時檢測，需置-80 ℃條件下保存。

1.3.2 痰常規(guī)培養(yǎng)

按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》進(jìn)行痰常規(guī)培養(yǎng)，取痰液膿性部分，分別接種于血平板（廣州市迪景微生物科技有限公司，粵械注準(zhǔn)20172400071）、伊紅美藍(lán)瓊脂平板（廣州市迪景微生物科技有限公司，粵械注準(zhǔn)20152400485）、巧克力瓊脂平板（廣州市迪景微生物科技有限公司，粵穗械備20150086號）中，放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)時間為24 h，溫度36 ℃，CO2含量5%。經(jīng)革蘭染色（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，粵珠械備20170095）鏡檢，初步觀察后，用全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)（湖南邁瑞醫(yī)療科技有限公司，湘械注準(zhǔn)20172220232）、革蘭陰性菌鑒定及藥敏試條（溫州市康泰生物科技有限公司，浙械注準(zhǔn)20152400399）、革蘭陽性菌鑒定及藥敏試條（溫州市康泰生物科技有限公司，浙械注準(zhǔn)20152400298）對克雷伯菌和鏈球菌進(jìn)行鑒定。

1.3.3 RT-PCR檢測

吸取4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的氫氧化鈉溶液加入待測樣本螺口管內(nèi)，充分搖勻，室溫下靜置30 min，后取0.5 mL混合液，置入離心管，加入0.5 mL氫氧化鈉，靜置10 min，設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，5 min后加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的氯化鈉注射液，離心5 min，在沉淀物中加入DNA提取液（天根生化科技有限公司，2022WO117），沸水浴10 min，離心5 min，將其作為反應(yīng)模板。陰性對照，取3 mL水樣，離心機(jī)離心2 min，將DNA提取液加入沉淀物中，沸水浴10min，設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速13 000 r/min，5 min后取上層清液。稀釋陽性對照品為標(biāo)準(zhǔn)品。按試劑盒說明（17∶3）配置PCR反應(yīng)體系，漩渦混勻器上混勻，按每個反應(yīng)體系為20 μL，分裝到8聯(lián)管內(nèi)，提取樣本、封蓋、離心，利用PCR儀（ABI 7500型擴(kuò)增儀）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增試劑為廣州達(dá)安生物科技有限公司生產(chǎn)（20220826/20220718），擴(kuò)增條件為50 ℃×2 min、95 ℃×15 min、94 ℃×15 s、55 ℃×45 s，循環(huán)40次。

1.4 觀察指標(biāo)

整個過程中，主要觀察指標(biāo)如下。（1）比較2種檢測方法的陽性檢出率；（2）比較2種檢測方式的診斷效能，即對靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值進(jìn)行對比。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以百分比表示，采用χ2檢驗，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痰常規(guī)培養(yǎng)和RT-PCR檢測陽性檢出率比較

與痰常規(guī)培養(yǎng)相比，RT-PCR在S.pn、Kpn中的陽性檢出率更高（P＜0.05），見表1。

2.2 痰常規(guī)培養(yǎng)和RT-PCR檢測診斷價值比較

與痰常規(guī)培養(yǎng)相比，RT-PCR檢測在S.pn、Kpn診斷中有著更高的靈敏度和陰性預(yù)測值（P＜0.05），見表2。

3 討論

Kpn、S.pn是導(dǎo)致肺炎發(fā)生的主要致病菌[3]。Kpn是一種條件致病菌，屬于呼吸道的菌群之一，是臨床中發(fā)現(xiàn)最早的可導(dǎo)致肺炎發(fā)生的革蘭陰性桿菌。身體虛弱人群尤其住院患者更易感染Kpn。Kpn經(jīng)呼吸道感染，住院患者使用呼吸器、人工導(dǎo)管或霧化過程中容易發(fā)生交叉感染，從而導(dǎo)致肺炎的發(fā)生。Kpn可導(dǎo)致嬰幼兒發(fā)生肺炎、腸炎、敗血癥等。隨著臨床抗菌藥物的使用，耐藥菌逐漸增多，革蘭陰性桿菌肺炎（gram-negative bacillary pneumonia，GNBP）發(fā)生率增加。這也是導(dǎo)致社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）和醫(yī)院獲得性肺炎（hospital-acquired pneumonia，HAP）發(fā)生的重要原因，病死率較高[4]。S.pn在自然界分布廣泛，其中大部分在人體鼻咽部定植，對健康人群無明顯危害，但對于免疫力較低的嬰幼兒及老年人群，極易導(dǎo)致呼吸道感染等疾病的發(fā)生，已成為現(xiàn)階段世界范圍內(nèi)主要致病原之一。隨著光譜抗生素的不當(dāng)使用甚至濫用，耐藥菌感染越來越普遍，細(xì)菌耐藥性逐漸加強(qiáng)，尤其是革蘭陰性菌。在疾病發(fā)生早期盡快明確致病菌，合理選用抗生素，臨床對癥治療，對患者康復(fù)有著極為重要的意義。

呼吸道標(biāo)本培養(yǎng)是臨床常見的檢測方式，包括胸腔積液培養(yǎng)、肺泡灌洗液培養(yǎng)、痰常規(guī)培養(yǎng)等。取灌洗液或胸腔積液對細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)是現(xiàn)階段肺炎診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對疾病診斷有著確定性的意義，但這種操作方式具有一定創(chuàng)傷性，對醫(yī)生操作技術(shù)水平要求較高，存在并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險，因此未普遍應(yīng)用[5]。

痰常規(guī)培養(yǎng)是臨床應(yīng)用較多的病原學(xué)檢測方式，通過對下呼吸道分泌物進(jìn)行培養(yǎng)分析，能夠反映感染情況，為后期用藥提供指導(dǎo)。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)，痰常規(guī)培養(yǎng)存在一定局限性，檢測需要較長時間，在有氧環(huán)境下細(xì)菌一般在6～8 h開始生長，厭氧菌一般需2～4 d。對于不典型病原體，在肺炎發(fā)生早期檢測中不能及時得到準(zhǔn)確的結(jié)果。檢測結(jié)果受藥物使用及標(biāo)本采集質(zhì)量影響較大。有研究人員發(fā)現(xiàn)，在使用過抗生素患者中，S.pn分離率明顯下降[6]。

PCR又名體外擴(kuò)增，是一種新型檢測方式，用時較短，結(jié)果準(zhǔn)確率高，有效彌補(bǔ)了常規(guī)培養(yǎng)方式的不足，它在基因表達(dá)中的應(yīng)用更有利于疾病診斷，在多種遺傳疾病、傳染性疾病、下呼吸道感染中的應(yīng)用效果較好。實時熒光定量PCR與PCR原理相同，是檢測領(lǐng)域的新技術(shù)，在保留PCR檢測優(yōu)勢的同時，解決了檢測過程準(zhǔn)確定量和靈敏度的問題，能夠重復(fù)進(jìn)行檢測，并監(jiān)控檢測過程[7]。

有研究人員對慢性肺部疾病患者痰液進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果顯示S.pn檢出率較低[8]。本研究中，痰常規(guī)培養(yǎng)S.pn、Kpn的陽性檢出率、靈敏度和陰性預(yù)測值較低，這與上述研究結(jié)果相一致。究其原因，細(xì)菌痰培養(yǎng)結(jié)果受多種因素影響，標(biāo)本獲取、培養(yǎng)過程中的相關(guān)操作均會影響檢測準(zhǔn)確性，以及部分患者存在抗生素使用情況，導(dǎo)致培養(yǎng)結(jié)果呈現(xiàn)假陰性。痰液中細(xì)菌的分布是不均勻的，在檢測痰液膿性部分時，可能存在標(biāo)本選取不當(dāng)或生長不良的情況，降低檢測陽性率。S.pn為苛養(yǎng)菌，痰培養(yǎng)所需時間較長，從樣本送檢到出具報告一般需要2～3 d?；颊呤褂每股刂委熂案鞣N原因?qū)е旅舾行韵陆?，不利于快速給予準(zhǔn)確的臨床用藥指導(dǎo)。本研究中，RT-PCR檢測中S.pn、Kpn的陽性檢出率、靈敏度和陰性預(yù)測值較痰常規(guī)培養(yǎng)更高，提示RT-PCR檢測的應(yīng)用價值較高。究其原因，RT-PCR在S.pn、Kpn檢測中更能體現(xiàn)自身優(yōu)勢，通過少量呼吸道分泌物便可明確病原菌，更適用于S.pn、Kpn等導(dǎo)致的缺乏特異性癥狀的感染診斷中。RT-PCR檢測中Kpn、S.pn陽性檢出率較高，但仍未完全檢出，原因可能為：采集標(biāo)本不當(dāng)，影響檢測準(zhǔn)確性；細(xì)菌檢測標(biāo)本不同，國外在進(jìn)行RT-PCR檢測時多通過防污染毛刷、肺泡灌洗等方式獲取標(biāo)本，國內(nèi)多從痰液中獲取標(biāo)本；細(xì)菌DNA未能成功提取；相關(guān)致病菌數(shù)量過多。

綜上所述，RT-PCR檢測在鏈球菌和克雷伯菌肺炎診斷中的陽性檢出率較高，靈敏度和陰性預(yù)測值較痰常規(guī)培養(yǎng)更高，診斷價值較好，可推廣使用。

基金項目：贛州市科技計劃項目（20222ZDX7846）

參考文獻(xiàn)

[1] 司雪菲.100例肺炎克雷伯桿菌急性下呼吸道感染病人痰液細(xì)菌培養(yǎng)及對抗菌藥物耐藥性分析[J].疾病監(jiān)測與控制，2020，14（3）：178-180.

[2] 賈曉蕓，陳宏君，吳林媛.呼吸道病原核酸檢測法在小兒肺炎鏈球菌感染中的臨床應(yīng)用[J].嶺南急診醫(yī)學(xué)雜志，2021，26（4）：412-414.

[3] BAUTISTA L，PILL-PEPE L，KAPOOR N，et al.Addition of lauryldimethylamine N-Oxide （LDAO） to a copper-free click chemistry reaction improves the conjugation efficiency of a cell-free generated CRM197 variant to clinically important streptococcus pneumoniae serotypes[J].ACS Omega，2022，7（39）：34921-34928.

[4] BAVARO D F，BELATI A，DIELLA L，et al.Prompt and appropriate antimicrobial therapy improves outcomes of NDM-producing and KPC-producing klebsiella pneumoniae bloodstream infections in patients hospitalized for COVID-19：a comparative retrospective case-series[J].Antibiotics（Basel），2022，11（11）：1519.

[5] 程弘夏，付敏，周立，等.多重RT-PCR方法對人肺炎鏈球菌菌種、血清型及耐藥性的鑒別檢測[J].信陽師范學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2018，31（1）：32-39.

[6] 李媛，熊櫻，易佰城，等.應(yīng)用實時熒光PCR快速檢測血培養(yǎng)標(biāo)本中的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2021，42（8）：921-924.

[7] 胡慧，李田美，姜艷芬.蠟樣芽孢桿菌、產(chǎn)色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌三重PCR檢測方法建立與應(yīng)用[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2022，43（7）：1-6.

[8] 洪林杰，黃種杰，范洪濤，等.老年慢性阻塞性肺疾病患者合并呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎的病原菌分布變遷及耐藥性分析[J].疑難病雜志，2018，17（3）：226-229.

（編輯：郭曉添）

作者簡介：曾 燕，女，本科，主治醫(yī)師。