脂蛋白相關lncRNA參與炎癥反應致冠心病的分子機制

解晨曦 畢波

摘要? 目的：探討脂蛋白相關lncRNA H19（H19）參與炎癥反應導致冠心病的分子機制。方法：選取2019年1月—2022年1月100例冠狀動脈造影后新診斷為冠心病的病人和100例因不明原因的胸痛或疑似冠心病癥狀而接受冠狀動脈造影但最終被確定患有冠心病以外疾病的受試者（對照組）。收集血漿樣本，通過逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應檢測H19和miR-212-5p，并通過酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定炎性細胞因子。結果：冠心病組H19表達明顯高于對照組［2.27（1.68，3.39）和1.00（0.60，1.41），P＜0.001］；H19診斷冠心病的受試者工作特征（ROC）曲線下面積（AUC）為0.903［95%CI（0.847，0.958）］。lncRNASNP2、Starbase和LncBook數(shù)據(jù)庫預測miR-212-5p與H19結合。冠心病組miR-212-5p表達低于對照組［0.44（0.32，0.70）和1.00（0.78，1.37），P＜0.001］；miR-212-5p診斷冠心病的AUC為0.839［95%CI（0.760，0.918）］。冠心病組H19和miR-212-5p呈負相關（r＝－0.436，P＜0.001）。H19表達與

Gensini評分呈正相關（r＝0.430，P＜0.001）；miR-212-5p表達與Gensini評分呈負相關（r＝－0.315，P＝0.006）。冠心病病人H19表達與TNF-α（r＝0.273，P＝0.008）和IL-17（r＝0.310，P＝0.003）呈正相關。miR-212-5p表達與TNF-α（r＝－0.272，P＝0.001）、IL-1β（r＝－0.223，P＝0.030）、IL-6（r＝－0.295，P＝0.004）和IL-17（r＝－0.348，P＜0.001）呈負相關。結論：循環(huán)H19及其靶標miR-212-5p與冠心病疾病的嚴重程度和炎癥水平相關。

關鍵詞? 冠心??；長鏈非編碼RNA H19；miR-212-5p；炎癥反應

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.02.022

基金項目? 2020年度省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室項目（No.SKL-HIDCA-2020-WF4）

作者單位? 新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院（烏魯木齊 830011），E-mail：41200630@qq.com

引用信息? 解晨曦，畢波.脂蛋白相關lncRNA參與炎癥反應致冠心病的分子機制［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2024，22（2）：326-330.

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是一種常見的疾病，每年死亡人數(shù)超過1 700萬例，是全球人類疾病死亡的主要原因［1］。冠心病的早期發(fā)現(xiàn)和治療（即藥物、介入或手術治療）與隨后的冠心病結局相關。近年來，許多研究報告了多種類型的生物標志物，例如心肌肌鈣蛋白-I、脂蛋白A、纖維蛋白原和胱抑素C，用于預測冠心病風險［2-3］。盡管發(fā)現(xiàn)了這些生物標志物，但冠心病的早期識別和管理仍然存在不足。因此，有必要不斷識別冠心病的生物標志物。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一種長度超過200個核苷酸的非編碼RNA。生物體內(nèi)的lncRNA種類繁多，數(shù)量巨大，并參與多種疾病的病理進程［4］。其中，脂蛋白相關lncRNA-mRNA網(wǎng)絡在冠心病病理過程中發(fā)揮重要作用［5］。lncRNA H19（H19）作為脂蛋白相關lncRNA，研究發(fā)現(xiàn)H19通過抑制264.7細胞中的Caspase-1減輕氧化低密度脂蛋白誘導的細胞焦亡［6］。此外，還有研究證實，H19下調(diào)通過誘導血管平滑肌細胞的凋亡來緩解冠心?。?］。然而，H19在冠心病過程中對炎癥反應的作用尚不清楚，仍需要進一步研究其作為冠心病生物標志物的潛在作用。因此，本研究旨在探討H19與冠心病病人冠狀動脈狹窄程度、常見生化指標和炎性細胞因子的關系。

1? 資料與方法

1.1? 臨床資料

納入2019年1月—2022年1月因不明原因胸痛或疑似冠心病癥狀而在冠狀動脈造影后新診斷為冠心病的病人100例。納入標準：冠狀動脈造影顯示冠心病，年齡≥18歲，并且至少有1條主要的心外膜血管狹窄＞50%。排除標準：1）除冠心病以外的其他心臟??；2）患有自身免疫性疾病、嚴重感染、嚴重的肝臟或腎臟疾病、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤；3）孕婦或哺乳期婦女。

招募100例因不明原因的胸痛或疑似冠心病癥狀而接受冠狀動脈造影但最終被確定患有冠心病以外疾病的受試者作為對照組。在對照組的招募中，年齡限制在50～80歲，男性與女性比例限制在4∶1，旨在匹配冠心病病人和對照組的年齡和性別。對照組排除標準：1）伴有自身免疫性疾病、嚴重感染、嚴重的肝臟或腎臟疾病、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤；2）孕婦或哺乳期婦女。所有受試者均簽署書面知情同意書。

1.2? 數(shù)據(jù)記錄

入組后記錄所有受試者的人口統(tǒng)計學數(shù)據(jù)、病史、合并癥和生化指標。通過冠狀動脈造影計算Gensini評分，定量分析冠狀動脈狹窄嚴重程度。

1.3? 樣本采集

在冠狀動脈造影之前從所有登記的受試者中采集外周血。采血后，在4 ℃下以2 500×g離心15 min，將血漿樣品與外周血樣品分離。血漿樣本用于檢測H19和miR-212-5p的表達。測量冠心病病人血漿樣品中腫瘤壞死因子α （TNF-α）、白細胞介素（IL）-1β、IL-6和IL-17水平。

1.4? H19和miR-212-5p表達檢測

采用逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）檢測血漿樣品中H19和miR-212-5p的表達。使用RNeasy Protect Mini Kit （德國Qiagen公司）從血漿樣品中提取總RNA，然后使用帶有隨機引物的iScriptTMcDNA Synthesis Kit，美國Bio-Rad公司生產(chǎn)（25 ℃ 5 min，46 ℃ 20 min，95 ℃ 1 min）。隨后，使用THUNDERBIRD SYBRqPCR Mix（日本Osaka公司）進行實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）以量化H19和miR-212-5p表達（95 ℃ 60 s，然后40個循環(huán)的95 ℃ 15 s和60 ℃持續(xù)60 s），均使用 2－ΔΔCt方法計算，分別以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和U6作為內(nèi)部參考。用于聚合酶鏈式反應（PCR）的引物見表1。

1.5? 炎性細胞因子測定

使用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）測定炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17，試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.6? 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。根據(jù)變量分布和正態(tài)性的特點，使用均數(shù)、標準差、中位數(shù)（M）、四分位間距（IQR）、百分比（%）進行描述性分析。使用χ2檢驗、t檢驗或Wilcoxon秩和檢驗進行統(tǒng)計推斷。使用Spearman秩相關檢驗估計兩個連續(xù)變量之間的關聯(lián)。受試者工作特征（ROC）曲線用于估計變量在區(qū)分冠心病病人和對照組方面的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2? 結? 果

2.1? 冠心病組與對照組臨床特征比較

與對照組相比，冠心病組糖尿病比例、C反應蛋白（CRP）水平、Gensini評分明顯增加（P＜0.05），高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平明顯降低（P＜0.05）。詳見表2。

2.2? 兩組H19表達比較及H19診斷冠心病的效能

冠心病組H19表達明顯高于對照組［2.27（1.68，3.39）與1.00 （0.60，1.41），P＜0.001］，詳見圖1A。H19診斷冠心病的ROC曲線下面積（AUC）為0.903［95%CI（0.847，0.958）］，詳見圖1B。

2.3? H19作為miR-212-5p ceRNA發(fā)揮作用

作為ceRNA，H19競爭性結合miRNA并調(diào)節(jié)細胞質(zhì)中的靶mRNA。miRNA靶點預測生物信息學（lncRNASNP2：http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/lncRNASNP＃！/，Starbase：http：//www.starbase.sysu.edu.cn/，LncBook：https：//bigd.big.ac.cn/lncbook/index）用于尋找與H19相互作用的miRNA，共確定12種候選miRNA（見圖2A）。其中，有研究報道m(xù)iR-212-5p抑制心臟成纖維，具有保護心臟的作用［8］。因此，研究選擇miR-212-5p進行進一步分析。冠心病組miR-212-5p表達低于對照組［0.44（0.32，0.70）與1.00（0.78，1.37），P＜0.001］。詳見圖2B。miR-212-5p對冠心病具有良好的鑒別價值［AUC＝0.839，95%CI（0.760，0.918）］。詳見圖2C。

2.4? 冠心病病人H19、miR-212-5p、Gensini評分及生化指標之間的相關性

在對照組中，未發(fā)現(xiàn)H19和miR-212-5p之間存在相關性（r＝－0.128，P＝0.204）；在冠心病組中，H19和miR-212-5p呈負相關（r＝－0.436，P＜0.001）；H19表達與Gensini評分呈正相關（r＝0.430，P＜0.001）；miR-212-5p表達與Gensini評分呈負相關（r＝－0.315，P＝0.006）。詳見圖3。此外，H19表達與冠心病病人HDL-C水平呈負相關（r＝－0.271，P＝0.009），與CRP水平呈正相關（r＝0.460，P＜0.001）；miR-212-5p表達與冠心病病人TC （r＝－0.232，P＝0.023）和CRP（r＝－0.423，P＜0.001）水平呈負相關。詳見表3。

2.5? 冠心病病人H19和miR-212-5p與炎性細胞因子的相關性

在冠心病病人中，H19表達與TNF-α（r＝0.273，P＝0.008）和IL-17（r＝0.310，P＝0.003）水平呈正相關。miR-212-5p表達與TNF-α（r＝－0.272，P＝0.001）、IL-1β（r＝－0.223，P＝0.030）、IL-6（r＝－0.295，P＝0.004）和IL-17（r＝－0.348，P＜0.001）水平呈負相關。詳見表4。

3? 討? 論

有研究表明，幾種非編碼RNA具有作為冠心病生物標志物的潛力，例如lncRNA-FA2H-2、lncRNA GAS5及其潛在靶標miR-21和miR-194-3p［9-10］。本研究擴展了先前發(fā)現(xiàn)，并證實H19和miR-212-5p作為炎癥調(diào)節(jié)因子在心血管系統(tǒng)的多種病理生理過程中發(fā)揮著至關重要的作用。本研究結果表明，冠心病病人中H19高表達，而miR-212-5p在心血管系統(tǒng)中表達不足。ROC曲線顯示，H19和miR-212-5p均能夠診斷冠心病，并且AUC值均超過0.8。同時，H19表達與冠心病病人的miR-212-5p呈負相關，原因可能是：1）H19調(diào)節(jié)系統(tǒng)性炎癥［miR-22-3p/NOD樣受體蛋白3（NLRP3）通路［11］］和內(nèi)皮細胞的生長（通過miR-194-3p-靶向硫氧還蛋白相互作用蛋白軸［12］），而miR-212-5p調(diào)節(jié)炎性細胞因子［通過磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）］通路［13］。因此，H19和miR-212-5p的失調(diào)增加了冠心病的風險。2）H19與miR-212-5p之間的負相關可能是由于H19作為miR-212-5p的負調(diào)節(jié)因子［14］。本研究中，所有冠心病受試者均首次診斷為冠心病，且在當前研究之前沒有接受任何針對冠心病的治療。因此，可基本排除治療對H19和miR-212-5p表達的影響。

Gensini評分是衡量冠心病冠狀動脈狹窄一般嚴重程度的有意義的評分系統(tǒng)［15］。本研究表明，H19與冠心病病人Gensini評分呈正相關，而miR-212-5p與冠心病病人Gensini得分呈負相關?？赡茉驗椋?）H19通過促進miR-21-5p介導的Toll樣受體4（TLR4）/核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路增強炎癥，導致更嚴重的血管狹窄，從而加重糖尿病心血管疾?。?6］；2）miR-212-5p通過PAFAH1B2信號通路調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的增殖和遷移，介導冠心病的嚴重程度［17］。此外，本研究還表明H19與HDL-C呈負相關；同時，miR-212-5p與TC呈負相關，這可能是由于它們對動脈粥樣硬化中膽固醇和細胞內(nèi)脂質(zhì)積累的調(diào)節(jié)［6］。有報道指出HDL-C和TC是冠心病的潛在危險因素［3］。因此，可以推斷H19和miR-212-5p調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝間接促進冠心病進展。

H19和miR-212-5p與心血管疾病病人的炎癥水平相關。一項研究報道，H19在動脈粥樣硬化進展過程中通過海綿狀miR-221加重人髓系白血病單核細胞（THP）-1巨噬細胞的炎癥反應［18］。另一項研究報告稱，巨噬細胞中miR-212-5p的缺失會促進動脈粥樣硬化形成過程中的血管炎癥［19］。本研究表明，冠心病病人的H19表達與CRP、TNF-α和IL-17水平呈正相關，而miR-212-5p表達與CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17水平呈負相關。可能原因：1）H19通過多種途徑增強炎性細胞因子的產(chǎn)生，例如miR-22-3p/NLRP3信號通路，觸發(fā)CRP、TNF-α和IL-17水平升高［11］；2）miR-212-5p通過c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路和PI3K/AKT通路下調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17，導致促炎細胞因子和CRP水平降低［13］。同時，H19和miR-212-5p與IL-17具有相關性，這可以通過H19和miR-212-5p對T輔助17平衡和分化的調(diào)節(jié)來解釋。

4? 小? 結

本研究結果表明，H19和miR-212-5p與冠心病疾病的嚴重程度和炎癥水平相關?；谶@些發(fā)現(xiàn)，對H19和miR-212-5p的強化監(jiān)測可能可以反映冠心病病人的疾病嚴重程度和炎癥水平，從而對不同疾病嚴重程度或炎癥水平的冠心病病人進行適當管理。

參考文獻：

［1］? CUSHMAN M，SHAY C M，HOWARD V J，et al.Ten-year differences in women′s awareness related to coronary heart disease：results of the 2019 American Heart Association national survey：a special report from the American Heart Association［J］.Circulation，2021，143（7）：e239-e248.

［2］? LIMA B B，HAMMADAH M，KIM J H，et al.Relation of high-sensitivity cardiac troponin I elevation with exercise to major adverse cardiovascular events in patients with coronary artery disease［J］.The American Journal of Cardiology，2020，136：1-8.

［3］? MEDINA-LEYTE D J，ZEPEDA-GARCA O，DOMNGUEZ-PREZ M，et al. Endothelial dysfunction，inflammation and coronary artery disease：potential biomarkers and promising therapeutical approaches［J］.International Journal of Molecular Sciences，2021，22（8）：3850.

［4］? WANG Q C，WANG Z Y，XU Q，et al.lncRNA expression profiles and associated ceRNA network analyses in epicardial adipose tissue of patients with coronary artery disease［J］.Scientific Reports，2021，11（1）：1567.

［5］? ZHANG C J，ZHANG X，GONG Y T，et al.Role of the lncRNA-mRNA network in atherosclerosis using ox-low-density lipoprotein-induced macrophage-derived foam cells［J］.Molecular Omics，2020，16（6）：543-553.

［6］? LIU S，XU D S，MA J L，et al.LncRNA H19 mitigates oxidized low-density lipoprotein induced pyroptosis via caspase-1 in raw 264.7 cells［J］.Inflammation，2021，44（6）：2407-2418.

［7］? ZHANG B F，JIANG H，CHEN J，et al.LncRNA H19 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury and maladaptive cardiac remodelling by regulating KDM3A［J］.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2020，24（1）：1099-1115.

［8］? WANG Z Q，F(xiàn)U M M，LI Y J.miR-142-5p and miR-212-5p cooperatively inhibit the proliferation and collagen formation of cardiac fibroblasts by regulating c-Myc/TP53INP1［J］.Canadian Journal of Physiology and Pharmacology，2020，98（5）：314-323.

［9］? LI Y B，GENG Y，ZHOU B D，et al.Long non-coding RNA GAS5 worsens coronary atherosclerosis through microRNA-194-3p/TXNIP axis［J］.Molecular Neurobiology，2021，58（7）：3198-3207.

［10］? CHEN Z H，SONG S X，ZHU J M，et al.Regulatory mechanism of miR-21 in formation and rupture of intracranial aneurysm through JNK signaling pathway-mediated inflammatory response［J］.International Journal of Clinical and Experimental Pathology，2020，13（7）：1834-1841.

［11］? SUN J Y，MAO S，JI W.LncRNA H19 activates cell pyroptosis via the miR-22-3p/NLRP3 axis in pneumonia［J］.American Journal of Translational Research，2021，13（10）：11384-11398.

［12］? SU W H，HUO Q，WU H，et al.The function of LncRNA-H19 in cardiac hypertrophy［J］.Cell & Bioscience，2021，11（1）：153.

［13］? CHEN F F，SUN N，WANG Y，et al.miR-212-5p exerts tumor promoter function by regulating the Id3/PI3K/Akt axis in lung adenocarcinoma cells［J］.Journal of Cellular Physiology，2020，235（10）：7273-7282.

［14］? REZAEI O，NATEGHINIA S，ESTIAR M A，et al.Assessment of the role of non-coding RNAs in the pathophysiology of Parkinson′s disease［J］.European Journal of Pharmacology，2021，896：173914.

［15］? 江業(yè)慧，張平洋，冉紅，等.基于AFI的無室壁運動異常冠心病患者左室心肌運動及其與冠脈狹窄程度間關系的研究［J］.中國超聲醫(yī)學雜志，2020，36（2）：125-128.

［16］? XIONG W，YAO M R，YANG Y Q，et al.Implication of regulatory networks of long noncoding RNA/circular RNA-miRNA-mRNA in diabetic cardiovascular diseases［J］.Epigenomics，2020，12（21）：1929-1947.

［17］? KIM G R，ZHAO T W，KEE H J，et al.microRNA-212-5p and its target PAFAH1B2 suppress vascular proliferation and contraction via the downregulation of RhoA［J］.PLoS One，2021，16（3）：e0249146.

［18］? HUANG S F，ZHAO G F，PENG X F，et al.The pathogenic role of long non-coding RNA H19 in atherosclerosis via the miR-146a-5p/ANGPTL4 pathway［J］.Frontiers in Cardiovascular Medicine，2021，8：770163.

［19］? BAI X Z，HE T，LIU M C，et al.Integrative analysis of microRNAs and mRNAs in LPS-induced macrophage inflammation based on adipose tissue stem cell therapy［J］.Inflammation，2021，44（1）：407-420.

（收稿日期：2022-07-21）

（本文編輯王麗）