茯苓酸通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路抑制氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡

王飛飛 陳伯艷 李瓊

摘要? 目的：探究茯苓酸通過(guò)調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/溶質(zhì)載體家族7成員11（SLC7A11）/谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（GPX4）信號(hào)通路抑制氧糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡的機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9c2，誘導(dǎo)建立細(xì)胞OGD/R模型后以0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L茯苓酸處理24 h，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）法檢測(cè)各處理組細(xì)胞活力后篩選出合適的茯苓酸作用濃度。將H9c2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、茯苓酸組、ML385組（Nrf2抑制劑組）、茯苓酸＋ML385組，除對(duì)照組外其余各組建立細(xì)胞OGD/R模型后以茯苓酸、ML385分組處理，采用CCK-8法與流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞活力、凋亡率；采用試劑盒檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞培養(yǎng)基上清中乳酸脫氫酶（LDH）、促炎因子［前列腺素E2（PGE2）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）］、抗炎因子白細(xì)胞介素（IL）-10水平及細(xì)胞抗氧化因子［過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽（GSH）］、鐵死亡相關(guān)指標(biāo)［鐵含量、丙二醛（MDA）］水平；采用免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞凋亡及Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率、LDH釋放量、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細(xì)胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），細(xì)胞活力、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細(xì)胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細(xì)胞凋亡率、LDH釋放量、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細(xì)胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），細(xì)胞活力、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細(xì)胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；ML385組細(xì)胞凋亡率、LDH釋放量、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細(xì)胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），細(xì)胞活力、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細(xì)胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細(xì)胞凋亡率、LDH釋放量、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細(xì)胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），細(xì)胞活力、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細(xì)胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。結(jié)論：茯苓酸可通過(guò)激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)而抑制OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥、脂質(zhì)過(guò)氧化與鐵死亡，增強(qiáng)其抗氧化活性及細(xì)胞活力，最終減輕其細(xì)胞凋亡損傷。

關(guān)鍵詞? 氧糖剝奪/復(fù)氧；心肌細(xì)胞；茯苓酸；核因子E2相關(guān)因子2/溶質(zhì)載體家族7成員11/谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4；鐵死亡；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.02.011

Tumulosic Acid Inhibits Oxygen-glucose Deprivation/Reoxygenation-induced Cardiomyocyte Ferroptosis by Regulating Nrf2/SLC7A11/GPX4 Signaling Pathway

WANG Feifei， CHEN Boyan， LI Qiong

Xi′an Gaoxin Hospital， Xi′an 710000， Shaanxi， China

Corresponding Author? LI Qiong， E-mail： 554739296@qq.com

Abstract? Objective：To explore the mechanism of tumulosic acid inhibiting oxygen-glucose deprivation/reoxygenation（OGD/R）-induced cardiomyocyte ferroptosis.Methods：Rat cardiomyocytes H9c2 were cultured in vitro and treated with 0，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0 μmol/L tumulosic acid for 24 h immediately after? the establishment of the cell OGD/R model.The cell viability of each treatment group was detected by CCK-8 method，and the appropriate concentration of tumulosic acid was screened out.H9C2 cells were randomly divided into control group，model group， tumulosic acid group，ML385 group［nuclear factor erythroid-2-related factor 2（Nrf2） inhibitor group］，and tumulosic acid＋ML385 group，except for the control group，the rest of the groups were treated with tumulosic acid and ML385 immediately after the establishment of the cell OGD/R model.The viability and apoptosis rate of H9c2 cells in each group were detected by CCK-8 method and flow cytometry respectively.The kits were applied to detect the levels of lactate dehydrogenase（LDH），pro-inflammatory factors［prostaglandin E2（PGE2），and tumor necrosis factor-α（TNF-α）］，anti-inflammatory factor interleukin（IL）-10 levels，cellular antioxidant factors［catalase（CAT） and glutathione（GSH）］，ferroptosis-related indicators［iron content and malondialdehyde（MDA）］ in the supernatant of H9c2 cell culture medium in each group.The apoptosis of H9c2 cells in each group and the expression of Nrf2/solute carrier family 7 member 11（SLC7A11）/glutathione peroxidase 4（GPX4） signal-related proteins were detected by Western Blotting.Results：Compared with control group，the apoptosis rate，LDH release，PGE2 and TNF-α levels in cell culture supernatant，cellular iron content，MDA level，and Bax and Caspase-3 protein expression? increased in model group（P＜0.05），the cell viability，IL-10 level in cell culture supernatant，cellular CAT and GSH levels，Bcl-2 and Nrf2，SLC7A11，GPX4 protein expression? decreased（P＜0.05）.Compared with model group，the apoptosis rate，LDH release（PGE2） and TNF-α levels in cell culture supernatant，cellular iron content，MDA level，and Bax and Caspase-3 protein expression? decreased in tumulosic acid group（P＜0.05），the cell viability，IL-10 level in cell culture supernatant，cellular CAT and GSH levels，Bcl-2 and Nrf2，SLC7A11，GPX4 protein expression? increased（P＜0.05）;the apoptosis rate，LDH release，PGE2，and TNF-α levels in cell culture supernatant，cellular iron content，MDA level，and Bax and Caspase-3 protein expression? increased in ML385 group（P＜0.05），the cell viability，IL-10 level in cell culture supernatant，cellular CAT and GSH levels，Bcl-2 and Nrf2，SLC7A11，GPX4 protein expression decreased（P＜0.05）.Compared with tumulosic acid group，the apoptosis rate，LDH release，PGE2，and TNF-α levels in cell culture supernatant，cellular iron content，MDA level，and Bax and Caspase-3 protein expression? increased in tumulosic acid＋ML385 group（P＜0.05），the cell viability，IL-10 level in cell culture supernatant，cellular CAT and GSH levels，Bcl-2 and Nrf2，SLC7A11，GPX4 protein expression? decreased（P＜0.05）.Conclusion：Tumulosic acid can inhibit OGD/R-induced myocardial cell inflammation，lipid peroxidation，and ferroptosis by activating Nrf2/SLC7A11/GPX4 signaling，enhance antioxidant activity and cell viability，and ultimately alleviate apoptosis injury.

Keywords? oxygen glucose deprivation/reoxygenation; cardiomyocytes; tumulosic acid; nuclear factor erythroid-2-related factor 2/solute carrier family 7 member 11/glutathione peroxidase 4; ferroptosis; experimental study

作者單位? 西安高新醫(yī)院（西安? 710000）

通訊作者? 李瓊，E-mail：554739296@qq.com

引用信息? 王飛飛，陳伯艷，李瓊.茯苓酸通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路抑制氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（2）：267-273.

心肌梗死造成的心肌缺血、缺氧是引發(fā)心源性猝死的重要原因之一，通過(guò)再灌注恢復(fù)供血是主要的治療策略，可有效降低病人死亡率，但在此過(guò)程中心肌細(xì)胞會(huì)因?yàn)槿毖俟嘧p傷發(fā)生凋亡，進(jìn)一步加重心肌結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，導(dǎo)致病人預(yù)后不佳［1-2］。心肌缺血再灌注期間由于血氧的突然再補(bǔ)給可引發(fā)活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成過(guò)多和鐵離子的積累，破壞氧化還原平衡，造成脂質(zhì)過(guò)氧化和谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭，引發(fā)鐵死亡，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷凋亡，通過(guò)抑制鐵死亡可預(yù)防心肌缺血再灌注損傷，是一種有效的心臟保護(hù)策略［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，鐵死亡與缺血再灌注引發(fā)的各種組織細(xì)胞損傷密切相關(guān)，核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）/溶質(zhì)載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11）/谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）信號(hào)通路參與介導(dǎo)其過(guò)程，激活該信號(hào)通路可增強(qiáng)抗氧化能力，抑制氧糖剝奪/復(fù)氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）誘導(dǎo)的神經(jīng)元脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵死亡，保護(hù)神經(jīng)元免受腦缺血再灌注損傷［5］，上調(diào)Nrf2及其下游GPX4的表達(dá)，可降低心肌細(xì)胞內(nèi)ROS、炎性因子和鐵水平，提高抗氧化活性，防止炎癥和鐵死亡，進(jìn)而挽救心肌免受缺血再灌注損傷［6-7］，因此，激活Nrf2/SLC7A11/GPX4可能是減輕OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡的有效方法。茯苓酸是一種存在于茯苓、靈芝等中草藥中的天然羊毛甾烷型三萜化合物，具有抗氧化、抗纖維化及抗炎特性，可通過(guò)抑制心肌纖維化減輕阿霉素誘導(dǎo)的心臟收縮力缺陷和心力衰竭［8］，還可增強(qiáng)鐵死亡相關(guān)蛋白Nrf2、血紅素加氧酶1（HO-1）、SLC7A11、GPX4的表達(dá)，降低炎性因子及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物生成，通過(guò)抑制腎臟鐵死亡減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷［9］，因而預(yù)測(cè)茯苓酸可能通過(guò)下調(diào)Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路抑制OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡。本實(shí)驗(yàn)體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞H9c2，誘導(dǎo)建立細(xì)胞OGD/R模型后以茯苓酸干預(yù)處理，對(duì)上述預(yù)測(cè)做驗(yàn)證。

1? 材料與方法

1.1? 主要試劑及儀器

大鼠心肌細(xì)胞H9c2（貨號(hào)：SNL-029）購(gòu)自武漢尚恩生物技術(shù)有限公司；DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基（貨號(hào)：11966025）、DMEM低糖培養(yǎng)基（貨號(hào)：10567022）購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；D-無(wú)水葡萄糖（純度≥99.8%，貨號(hào)：G8150）、茯苓酸（純度：HPLC≥98%，貨號(hào)：IP0010）、ML385（純度≥98%，貨號(hào)：IM1020）、鐵含量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC4355）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC0025）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：BC0685）、大鼠白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-10酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號(hào)：SEKH-0028）、大鼠前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA試劑盒（貨號(hào)：SEKR-0053）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）試劑盒（貨號(hào)：E606335）、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（貨號(hào)：D731168）、異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）雙染法膜聯(lián)蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：E606336）均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：A007-1-1）、GSH測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：A006-2-1）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；兔源抗大鼠anti-SLC7A11一抗（貨號(hào)：ab175186）、小鼠抗大鼠anti-β-actin一抗（貨號(hào)：ab8226）、兔源抗大鼠anti-Nrf2抗體（貨號(hào)：ab92946）、兔源抗大鼠anti-GPX4一抗（貨號(hào)：ab125066）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）偶聯(lián)山羊抗兔二抗（貨號(hào)：ab6721）、HRP偶聯(lián)兔抗小鼠二抗（貨號(hào)：ab97046）均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

酶標(biāo)分析儀（型號(hào)：AMR-100）購(gòu)自上海聚慕醫(yī)療器械有限公司；流式細(xì)胞分選儀（型號(hào)：FACSMelody）購(gòu)自美國(guó)BD公司；垂直電泳槽（型號(hào)：KEEBIO-VE180）、電泳儀電源（型號(hào)：KEEBIO-600N）、轉(zhuǎn)移電泳槽（型號(hào)：KEEBIO-VE186）均購(gòu)自上海金鵬分析儀器有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 茯苓酸作用濃度篩選

購(gòu)買(mǎi)的凍存大鼠心肌細(xì)胞H9c2置于40 ℃水浴中快速解凍，離心后以磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌，然后加入含10%胎牛血清的DMEM低糖培養(yǎng)基重懸H9c2細(xì)胞，接種在25 mm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至約80%細(xì)胞融合，傳代并以1×104個(gè)/孔的密度接種在96孔板培養(yǎng)24 h，然后誘導(dǎo)建立細(xì)胞OGD/R模型：將培養(yǎng)基更換為DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基后將H9c2細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱（37 ℃、94%N2、5%CO2、1%O2）中培養(yǎng)24 h進(jìn)行氧糖剝奪處理，然后將培養(yǎng)基更換為含糖DMEM培養(yǎng)基并放入正常培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2、95%O2）中培養(yǎng)6 h行復(fù)氧處理［10］，細(xì)胞建模后立即以0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L茯苓酸處理24 h（以0 μmol/L茯苓酸處理細(xì)胞作為對(duì)照組）［11］，每孔加入20? μL CCK-8試劑孵育1 h，參照CCK-8試劑盒說(shuō)明指導(dǎo)測(cè)出各處理組細(xì)胞吸光度，計(jì)算其細(xì)胞活力，細(xì)胞活力＝藥物處理組吸光值/對(duì)照組吸光值×100%。

1.2.2? 分組處理H9c2細(xì)胞后收集標(biāo)本

取H9c2細(xì)胞傳代并以2.5×105個(gè)/孔的密度接種在小培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、茯苓酸組、ML385（Nrf2抑制劑）組、茯苓酸＋ML385組，除對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞按照1.2.1中方法建立OGD/R模型，然后馬上進(jìn)行藥物處理：茯苓酸組以10.0 μmol/L茯苓酸處理，ML385組以2.0 μmol/L ML385處理［12］，茯苓酸＋ML385組以10.0 μmol/L茯苓酸和2.0 μmol/L ML385聯(lián)合處理，對(duì)照組正常培養(yǎng)且不進(jìn)行任何處理，各組均于處理24 h后收集其細(xì)胞沉淀及培養(yǎng)基，細(xì)胞沉淀存于液氮中備用，培養(yǎng)基于離心后存于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3? CCK-8法與流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞活力、凋亡率

取H9c2細(xì)胞傳代并以1×104個(gè)/孔的密度接種在96孔板中培養(yǎng)24 h，遵照1.2.2中方法進(jìn)行分組處理24 h后通過(guò)CCK-8法測(cè)定各組細(xì)胞活力，具體步驟參照1.2.1。

取H9c2細(xì)胞傳代并以2.5×105個(gè)/孔的密度接種在小培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，遵照1.2.2中方法進(jìn)行分組處理24 h，以胰酶消化后收集各組細(xì)胞，采用預(yù)冷PBS洗滌、重懸后計(jì)數(shù)，每組取出5×105個(gè)細(xì)胞進(jìn)行FITC/PI雙染法后采用流式細(xì)胞儀測(cè)定各組細(xì)胞凋亡率，具體步驟按照Annexin Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.4? 采用試劑盒檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞培養(yǎng)基上清中LDH、PGE2、TNF-α、IL-10水平及細(xì)胞CAT、GSH與MDA水平、鐵含量

取1.2.2中收集的各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清，置于4 ℃冰箱中緩慢解凍后，采用試劑盒檢測(cè)其中LDH、PGE2、TNF-α、IL-10水平，具體操作步驟按照各自制造商試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取1.2.2中收集的各組細(xì)胞分別加入適量RIPA裂解液混勻，裂解2 h后離心提取其中總蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)出其濃度，各組分別取300 mL細(xì)胞樣品液（剩余樣品液存于－80 ℃進(jìn)行蛋白表達(dá)檢測(cè)），采用試劑盒檢測(cè)其中CAT、GSH與MDA水平、鐵含量，具體操作步驟按照各自制造商試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.5? 免疫印跡法檢測(cè)各組H9c2細(xì)胞凋亡及Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

取1.2.4中剩余細(xì)胞樣品液置于冰水浴中緩慢凍融后，根據(jù)蛋白濃度測(cè)定結(jié)果每組取出15 mg總蛋白，煮沸變性后上樣跑電泳、濕轉(zhuǎn)，將膠中分離后的蛋白移到硝酸纖維素膜上，37.5 ℃下以3%牛血清白蛋白溶液孵育蛋白2 h后將B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、Nrf2、β-actin、SLC7A11及GPX4剪下，分別孵育兔源抗大鼠anti-Bcl-2、anti-Bax、anti-Caspase-3、anti-Nrf2、anti-β-actin、anti-SLC7A11及anti-GPX4一抗，洗滌后根據(jù)一抗宿主物種分別孵育HRP偶聯(lián)山羊抗兔二抗、HRP偶聯(lián)兔抗小鼠二抗，洗滌后采用化學(xué)發(fā)光試劑顯色偶聯(lián)二抗的HRP，采集各蛋白條帶圖像后，運(yùn)用Image J軟件定量其灰度值，以?xún)?nèi)參β-actin為標(biāo)準(zhǔn)量化各蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間差異比較采用t檢驗(yàn)，多組間差異比較行單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩差異比較進(jìn)行SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)? 果

2.1? 茯苓酸對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力的影響

不同濃度的茯苓酸均可提升OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞活力，且劑量越高，其提升作用越強(qiáng)，在濃度為10.0 μmol/L時(shí)對(duì)細(xì)胞活力的提升作用進(jìn)入平臺(tái)期，因而后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇10.0 μmol/L的茯苓酸進(jìn)行。

2.2? 茯苓酸對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡損傷的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率、LDH釋放量均升高（P＜0.05），細(xì)胞活力降低（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細(xì)胞凋亡率、LDH釋放量均降低（P＜0.05），細(xì)胞活力升高（P＜0.05）；ML385組細(xì)胞凋亡率、LDH釋放量均升高（P＜0.05），細(xì)胞活力降低（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細(xì)胞凋亡率、LDH釋放量均升高（P＜0.05），細(xì)胞活力降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1、表1。

2.3? 茯苓酸對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞促炎因子與抗炎因子釋放的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PGE2、TNF-α水平均升高（P＜0.05），IL-10水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PGE2、TNF-α水平均降低（P＜0.05），IL-10水平升高（P＜0.05）；ML385組細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PGE2、TNF-α水平均升高（P＜0.05），IL-10水平降低（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PGE2、TNF-α水平均升高（P＜0.05），IL-10水平降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

2.4? 茯苓酸對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞抗氧化因子及鐵死亡相關(guān)指標(biāo)水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞CAT、GSH水平均降低（P＜0.05），MDA水平、鐵含量均升高（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細(xì)胞CAT、GSH水平均升高（P＜0.05），MDA水平、鐵含量均降低（P＜0.05）；ML385組細(xì)胞CAT、GSH水平均降低（P＜0.05），MDA水平、鐵含量均升高（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細(xì)胞CAT、GSH水平均降低（P＜0.05），MDA水平、鐵含量均升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

2.5? 茯苓酸對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）；ML385組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2、表4。

2.6? 茯苓酸對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。與模型組比較，茯苓酸組細(xì)胞Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）；ML385組細(xì)胞Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。與茯苓酸組比較，茯苓酸＋ML385組細(xì)胞Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖3、表5。

3? 討? 論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死治療過(guò)程中，心肌組織會(huì)因血流再灌注發(fā)生氧化應(yīng)激、炎性浸潤(rùn)及心肌細(xì)胞死亡等缺血再灌注損傷癥狀，是影響病人預(yù)后的關(guān)鍵，因此對(duì)其進(jìn)行防治對(duì)于提升心肌梗死病人治療效果有重大臨床意義［13-14］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2進(jìn)行OGD/R處理，誘導(dǎo)建立體外心肌缺血再灌注損傷細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，OGD/R誘導(dǎo)細(xì)胞促炎因子PGE2、TNF-α水平升高，抗炎因子IL-10及抗氧化因子CAT、GSH水平降低，引發(fā)細(xì)胞炎癥與過(guò)氧化損傷，造成LDH釋放量提升及細(xì)胞活力降低，最終誘發(fā)細(xì)胞凋亡，揭示OGD/R細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

鐵死亡是引發(fā)腦、心肌等組織器官缺血再灌注損傷的主要因素之一，可引發(fā)缺血再灌注后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化水平升高和鐵蓄積，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷死亡，通過(guò)抑制鐵死亡可減輕OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷，保護(hù)心肌免于缺血再灌注損傷［15-16］。茯苓酸是一種有明顯抗炎及抗氧化特性的天然三萜類(lèi)化合物，廣泛分布于靈芝、茯苓等名貴中草藥中，可通過(guò)抑制鐵死亡保護(hù)腎臟組織，避免缺血再灌注引發(fā)的急性病理?yè)p傷［9］，還可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷［17］，緩解血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大和凋亡［11］，因而推測(cè)茯苓酸可能對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡具有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)以0、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 μmol/L茯苓酸處理OGD/R誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2，均可提升其細(xì)胞活力，且劑量越高，其提升作用越強(qiáng)，以10.0 μmol/L的茯苓酸處理OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞，可降低細(xì)胞凋亡率、LDH釋放量、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細(xì)胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，升高細(xì)胞活力、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細(xì)胞CAT及GSH水平、Bcl-2蛋白表達(dá)，表明茯苓酸可減少促炎因子和ROS產(chǎn)生，提高抗炎和抗氧化因子水平，緩解脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞內(nèi)鐵沉積，抑制鐵死亡，最終減輕OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡損傷，并提升其活力，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，且劑量越高，功效越強(qiáng)。

研究顯示，Nrf2信號(hào)可通過(guò)調(diào)控SLC7A11和GPX4表達(dá)而介導(dǎo)細(xì)胞鐵蓄積、ROS產(chǎn)生和氧化損傷過(guò)程，激活Nrf2信號(hào)可上調(diào)SLC7A11、GPX4表達(dá)，緩解ROS產(chǎn)生和鐵沉積，減輕鐵死亡引發(fā)的細(xì)胞損傷，對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，并可減輕缺血再灌注引起的大鼠心肌組織炎癥和脂質(zhì)過(guò)氧化，抑制鐵死亡，從而減輕心肌損傷［18-20］。劉鳳等［17］研究顯示茯苓酸可通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路改善氧化型低密度脂蛋白導(dǎo)致的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷，因而推測(cè)激活Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)通路可能是茯苓酸抑制OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡的作用機(jī)制。本研究結(jié)果顯示，以Nrf2抑制劑ML385處理OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞，可下調(diào)SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)，促進(jìn)ROS及促炎因子表達(dá)，減少抗炎及抗氧化因子生成，加重OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞炎癥與過(guò)氧化損傷，增強(qiáng)鐵死亡，最終進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞損傷凋亡，而茯苓酸可上調(diào)OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)，表明Nrf2/SLC7A11/GPX4參與介導(dǎo)OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡及茯苓酸對(duì)其可能有抑制作用。以茯苓酸和ML385聯(lián)合處理OGD/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞，相比茯苓酸單獨(dú)處理，可升高細(xì)胞凋亡率、LDH釋放量、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中PGE2及TNF-α水平、細(xì)胞鐵含量、MDA水平及Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)，降低細(xì)胞活力、細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IL-10水平、細(xì)胞CAT及GSH水平、Bcl-2及Nrf2、SLC7A11、GPX4蛋白表達(dá)，表明ML385可減弱茯苓酸對(duì)炎癥和脂質(zhì)過(guò)氧化的減輕作用，拮抗其對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡和凋亡損傷的抑制作用，最終逆轉(zhuǎn)茯苓酸對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，揭示茯苓酸抑制OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡是通過(guò)激活Nrf2信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。

總之，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了茯苓酸可增強(qiáng)Nrf2/SLC7A11/GPX4通路蛋白表達(dá)，減少ROS和促炎因子產(chǎn)生，提高抗氧化因子和抑炎因子水平，緩解OGD/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化和鐵沉積，抑制鐵死亡，減輕OGD/R導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡損傷，促進(jìn)Nrf2/SLC7A11/GPX4信號(hào)途徑傳導(dǎo)可能是其分子機(jī)制之一，本研究為茯苓酸用于心肌缺血再灌注損傷的臨床防治提供了新的理論依據(jù)，有利于心肌梗死治療方法的改進(jìn)。

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（收稿日期：2022-08-11）

（本文編輯王麗）