SPE-UPLC聯(lián)用快速檢測保健品中人參皂苷Rh2成分

韓璐?張杰?陳小兵?李剛?李莉?徐濤

摘 要：目的：基于固相萃取與超高液相色譜聯(lián)用技術(shù)，建立一種快速準(zhǔn)確檢測保健品中人參皂苷Rh2成分的方法，為市售含有人參皂苷Rh2成分的保健品的質(zhì)量評價提供參考。方法：樣品預(yù)處理后經(jīng)甲醇超聲提取，中性氧化鋁SPE小柱凈化，篩選合適的洗脫劑進行HLB-SPE小柱分離純化，采用WatersT3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，乙腈-水為流動相梯度洗脫，PDA全波長掃描，流速0.3 mL·min-1。結(jié)果：SPE-UPLC法測得人參皂苷Rh2濃度在9.7～99.8 μg·mL-1與其峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999），平均回收率為99.20%。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、簡便、快速，并能有效去除輔料干擾，穩(wěn)定性高，可用于含有人參皂苷Rh2有效成分的保健食品的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：固相萃取；超高效液相色譜（UPLC）；保健食品；人參皂苷Rh2；含量測定

Rapid Determination of Ginsenoside Rh2 in Health Products by SPE-UPLC

Abstract： Objective： To establish a rapid and accurate method for the determination of rare ginsenoside Rh2 in health food products based on solid-phase extraction coupled with ultra-high liquid chromatography （UPLC）， and to provide a reference for the quality evaluation of commercially available health food products containing ginsenoside Rh2. Method： The samples were pretreated and extracted by methanol ultrasonication， purified by a neutral alumina SPE column， and screened for suitable eluents for the separation and purification on a HLB-SPE column， using a WatersT3 （100 mm×2.1 mm， 1.8 μm） chromatographic column with acetonitrile-water as the mobile phase in a gradient elution， and scanned by a PDA at full wavelength at a flow rate of 0.3 mL·min-1. Result： The concentration of ginsenoside Rh2 measured by SPE-UPLC showed a good linear relationship with its peak area in the range of 9.7～99.8 μg·mL-1 （r=0.999）， and the average recovery was 99.20%. Conclusion： The method is accurate， simple， rapid and effective in removing the interference of excipients， with high stability， and can be used for the quality control of health food containing ginsenoside Rh2 active ingredient.

Keywords： solid phase extraction; ultra performance liquid chromatography （UPLC）; health food; ginseng saponin Rh2; content determination

人參是五加科植物人參的干燥根和根莖[1]，素有“百草之王”的美譽，是我國傳統(tǒng)的天然中藥材。人參主要分布于我國東北三省，俄羅斯和朝鮮境內(nèi)。人參具有極高的藥理活性，增強免疫力、提高記憶力、保護心肌、抗疲勞、抗腫瘤等功效[2-3]。我國最早的本草學(xué)著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中就將其列為補益上品。

人參皂苷是人參的主要活性化學(xué)成分，迄今為止，從人參中分離鑒定的人參皂苷類物質(zhì)已經(jīng)超過100種，其中具有高活性的人參皂苷C-K、Rg3、Rh2在自然界中含量較低被稱為稀缺人參皂苷[4]。人參皂苷Rh2的作用機制主要包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞增殖、抑制血管生成和轉(zhuǎn)移等[5-8]。人參皂苷Rh2聯(lián)合化療藥物可以逆轉(zhuǎn)各種腫瘤細(xì)胞的耐藥性，增強藥物敏感性[9-11]，其作用機理和吸收代謝途徑均尚在研究探索中，所以人參皂苷Rh2成分多用于中藥復(fù)方制劑和人參類保健品中，導(dǎo)致其含量的標(biāo)識規(guī)范性較差。目前多使用薄層色譜法、薄層掃描法、高效液相色譜法等方法進行含量檢測，由于樣品成分較復(fù)雜，分離效果較差。本文創(chuàng)建固相萃取與超高液相色譜聯(lián)用技術(shù)，對保健品分離純化處理，提高檢測靈敏度、分離度和專屬性，可用于人參類保健品中人參皂苷Rh2成分的質(zhì)量評價。

固相萃取技術(shù)（Solid Phase Extraction，SPE）是一種近年來迅速發(fā)展起來的樣品前處理技術(shù)，相比傳統(tǒng)的液液萃取，固相萃取具有操作更加便捷、消除干擾能力強、目標(biāo)成分篩選更快等特點。SPE兼具高富集因子和操作靈活性，具有吸收快、萃取劑可重復(fù)使用、產(chǎn)生三廢少、分離系數(shù)好、溶劑用量少、省時等優(yōu)點[12-14]。本文采用中性氧化鋁填料的SPE小柱進行初步除雜，HLB新型材料填料的SPE小柱分離純化，UPLC檢測，方法準(zhǔn)確，可靠，可用于人參類保健品中人參皂苷Rh2成分的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器

NexeraX2 LC-30A UPLC（日本島津?qū)嶒炂鞑挠邢薰荆?；KQ-800DB 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS205十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；色譜柱：Cosmosil-C18（日本半井公司）、Acquity-WatersT3（美國沃特世科技有限公司）、Phenomenex-C18（美國飛諾美公司）。

1.2 試藥

人參皂苷含片（河南時珍漢方醫(yī)藥科技有限公司）；今幸膠囊（浙江亞克藥業(yè)有限公司）；岑萃人參提取物壓片糖果（江蘇御臣源生物科技有限公司）；斐爾特皂苷人參復(fù)合粉（美國菲爾特制藥集團）；域金方人參提取物壓片糖果（廣州灃芝健康食品有限公司）；人參皂苷Rh2對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111748-2005501，HPLC≥98%）；SPE-C18柱、SPE-HLB柱、SPE-中性氧化鋁柱（湖北比克曼生物科技有限公司）；甲醇、乙腈（默克公司），均為色譜純，其余試劑為分析純，水為高純水。

1.3 試驗方法

1.3.1 固相萃取柱預(yù)處理與加樣

將SPE柱固定，加入10 mL甲醇進行活化，再次加入10 mL高純水平衡，待液面降至SPE柱篩板表面時，注入5 mL樣品溶液，控制閥門流速待樣品液面降至SPE柱篩板表面時，再次緩慢注入10 mL高純水淋洗，淋洗結(jié)束后按照洗脫劑極性大小依次淋洗，離心管收集樣品洗脫液，每個極性洗脫劑收集5倍柱體積。

1.3.2 溶液的制備

（1）對照品溶液配制。精密稱取適量人參皂苷Rh2對照品至10 mL棕色容量瓶并用色譜甲醇定容，配制成1.00 mg·mL-1的對照品溶液，于4 ℃避光保存?zhèn)溆?，取適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，以色譜級甲醇稀釋成0.10 mg· mL-1、0.20 mg· mL-1、0.40 mg· mL-1、0.60 mg·mL-1、0.80 mg·mL-1不同濃度的對照品溶液。

（2）供試品溶液的配制。將統(tǒng)一采購的5種保健品不分劑型每品類取10份，研磨混勻，取約0.125 g，精密稱定，加入色譜甲醇10 mL至25 mL容量瓶中，超聲（功率460 W，頻率40 kHz）溶解20 min，放冷，用色譜甲醇定容至刻度，搖勻備用。將超聲提取液加樣至1.3.1項下預(yù)處理的中性氧化鋁SPE小柱前端，先后用純水、純甲醇依次淋洗，凈化去除保健品輔料干擾，收集甲醇淋洗劑至25 mL容量瓶中，以色譜甲醇定容，再次將中性氧化鋁過濾后的甲醇溶液上樣于HLB-SPE小柱前段，參照1.3.1項下操作，以85%的甲醇水溶液作為洗脫劑，洗脫HLB-SPE小柱，收集洗脫液25 mL，過0.22 μm的有機相微孔濾膜，轉(zhuǎn)移至液相進樣小瓶中，即得待測供試品溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：WatersT3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相：A為乙腈，B為水；流速：0.3 mL·min-1；梯度洗脫條件：0～2.0 min，流動相A（35%～50%）；2～15 min，流動相A（50%～80%）；15～16 min，流動相A（80%～90%）；16～18 min，流動相A（90%～35%）。檢測波長：PDA全波長掃描；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.4 線性關(guān)系考察

將1.3.1項下配制的0.10 mg· mL-1、0.20 mg·mL-1、0.40 mg·mL-1、0.60 mg·mL-1、0.80 mg·mL-1不同濃度的對照品溶液分別進樣10 μL，以被測對照品的峰面積Y為縱坐標(biāo)，被測對照品的進樣量X（μg）為橫坐標(biāo)，進行線性回歸。

1.3.5 精密度實驗

取中濃度對照品（0.06 mg·mL-1），按色譜條件連續(xù)進樣，測定6次，連續(xù)測定5 d，記錄峰面積。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗

精密量取同一批供試品溶液，分別于室溫下放0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、22 h、24 h進樣測定，記錄峰面積。

1.3.7 加標(biāo)回收率

取已知含量的同一批今幸膠囊研磨后的粉末，精密稱取6份，于每份樣品中精密加入人參皂苷Rh2對照品溶液0.25 mL（0.80 mg·mL-1），按1.3.2項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，按照1.3.3項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算平均回收率。

1.3.8 樣品測定

分別取5種不同品牌標(biāo)識含有人參皂苷Rh2成分的保健品（n=3），分別按照1.3.2項方法制備供試品溶液，依次按1.3.3項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品中人參皂苷Rh2的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件的選擇

實驗過程中比較了Cosmosil-C18（150 mm×2.1 mm，2.6 μm）、Acquity-WatersT3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Phenomenex-C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）3種不同孔徑填料的色譜柱對分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Acquity-WatersT3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱分離樣品的分離度、色譜峰位數(shù)量與峰形態(tài)均屬最佳。

2.1.2 固相萃取柱及洗脫劑篩選

目前針對人參皂苷類成分的固相萃取柱填料一般選用大孔樹脂或鍵合硅膠C18的反相疏水方式為主，而市售保健品一般成分復(fù)雜，對固相萃取柱填料要求較高，不僅要保證人參皂苷成分的回收率，還要將干擾成分盡可能去除。考慮市售保健品中可能存在含量較低的人參皂苷Rh2成分的樣品，為使樣品中人參皂苷Rh2成分得到全部洗脫，對洗脫倍數(shù)進行考察。本實驗分別對C18（200 mg/3 mL）、C18（500 mg/6 mL）、HLB（500 mg/6 mL）3種不同的固相萃取柱進行篩選，同一萃取柱進行5倍柱體積洗脫，收集每次洗脫液進行UPLC檢測并記錄峰面積，已知峰面積與樣品溶液濃度成比例，根據(jù)峰面積總和計算不同固相萃取柱的回收率情況，結(jié)果如表1所示。數(shù)據(jù)顯示相同洗脫條件下，C18固相萃取柱對比HLB固相萃取柱對人參皂苷Rh2成分的保留效果較差，回收率較低，為減少待測樣品因不保留造成損耗，保證高回收率，所以本實驗選擇HLB填料的固相萃取柱。

取適量對照品溶液上樣于同一HLB固相萃取柱（500 mg/6 mL）前端，依次用洗脫劑洗脫多倍柱體積，收集每1倍柱體積的洗脫液進行UPLC檢測并記錄峰面積，計算每次洗脫液中人參皂苷Rh2的回收率，結(jié)果如表2所示。數(shù)據(jù)顯示5倍柱體積洗脫后的累加回收率大于95.0%，萃取柱上人參皂苷Rh2成分殘留量小于5.0%，綜合考慮樣品洗脫回收率，洗脫試劑用量等因素確定洗脫劑用量為5倍柱體積。結(jié)合表1實驗數(shù)據(jù)最終確定固相萃取柱選用SPE-HLB（500 mg/6 mL）萃取柱，洗脫體積為5倍柱體積，相比傳統(tǒng)填料凈化能力得到提高，比較好地解決了分析干擾的情況。

在此基礎(chǔ)上，分別用30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%濃度的甲醇溶液洗脫，收集洗脫液后用100%甲醇溶液沖洗，將洗脫液與沖洗液微孔濾膜過濾轉(zhuǎn)移至進樣小瓶中，結(jié)果顯示85%甲醇溶液回收率最高，因此確定甲醇-水（85+15）為洗脫劑。

2.2 線性關(guān)系考察

按照1.3.3項下色譜條件，將標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液分別進樣10 μL，記錄不同濃度及其對應(yīng)的峰面積值，計算得到線性回歸方程Y=3.142×107X+8.692×103（r=0.999）；取0.10 mg·mL-1進樣1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL，以S/N=3確定的檢出限（Limit of Detection，LOD），以S/N=10確定的定量限（Limit of Quantitation，LOQ），最終確定LOD=0.17 μg、LOQ=0.45 μg。

2.3 精密度試驗

根據(jù)系統(tǒng)適用性實驗要求，對儀器精密度進行考察，日內(nèi)精密度RSD=0.83%，日間精密度RSD=1.06%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取域金方保健品適量，按1.3.2項下配制供試品溶液，在不同時間測定含量，記錄峰面積，數(shù)據(jù)如表3，計算RSD=0.51%，表明24 h之內(nèi)人參皂苷Rh2成分在供試品溶液內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率

按照1.3.7項下配制加樣回收率待測溶液，依1.3.3項下色譜條件進樣，記錄峰面積，計算平均回收率為99.2%，RSD=0.42%。

2.6 樣品測定

按照1.3.8項下樣品前處理進樣檢測，記錄峰面積，并計算樣品中人參皂苷Rh2的含量，見表4。今幸膠囊標(biāo)示量為含人參皂苷Rh2 16.2 g/100 g，測定量為15.75 g/100 g；岑萃標(biāo)示量為含人參皂苷Rh2?3.2 g/100 g，測定量為0.31 g/100 g；域金方標(biāo)示量為含人參皂苷Rh2 2.0g/100 g，測定量為0.27 g/100 g；人參皂苷標(biāo)示量為含人參總皂苷26.0 g/100 g，測定人參皂苷Rh2含量約為0.01 g/100 g；斐爾特未明確標(biāo)示人參皂苷Rh2含量，測定人參皂苷含量約為0.03 g/100 g；考慮SPE柱損耗約為5.0%，結(jié)果表明今幸膠囊含量合格、岑萃和域金方含量不合格，人參皂苷和斐爾特兩款保健品幾乎不含人參皂苷Rh2成分。

3 結(jié)論

本實驗采用超聲提取，中性氧化鋁SPE柱除雜，HLB填料的SPE小柱分離、純化保健品中人參皂苷Rh2成分，樣品前處理后通過UPLC快速檢測，該方法具有操作簡單、快速、穩(wěn)定性高、溶劑消耗少等特點。本實驗確立方法后對市售銷量較高的5種標(biāo)識含有人參皂苷Rh2成分的保健品進行檢測，結(jié)果顯示今幸膠囊含量合格、岑萃人參提取物壓片糖果和域金方人參提取物壓片糖果含量不達標(biāo)，其余兩款產(chǎn)品幾乎不含有人參皂苷Rh2成分，綜上所述本實驗為含有人參皂苷Rh2的保健品質(zhì)量控制提供了一種快速檢測的方法。

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