血清miR-297a、FGF23水平與高血壓患者冠狀動(dòng)脈鈣化的相關(guān)性研究

馮紀(jì)訥 陳雪 趙倩倩 王鍵

1.山東省臨朐縣人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東臨朐 262600；

2.濰坊市人民醫(yī)院心內(nèi)一科，山東濰坊 261000

冠狀動(dòng)脈鈣化（Coronary artery calcification，CAC）是動(dòng)脈粥樣硬化的一種類型[1]。冠狀動(dòng)脈鈣化程度高的患者其心血管相關(guān)事件的發(fā)生率高于冠脈鈣化程度低的患者，并且鈣化冠狀動(dòng)脈行介入治療的難度遠(yuǎn)高于未鈣化患者[2]。冠狀動(dòng)脈鈣化的檢測(cè)方法包括冠脈CT、冠狀動(dòng)脈造影、血管內(nèi)超聲等。

基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，鈣化過(guò)程不是一個(gè)鈣鹽被動(dòng)沉積過(guò)程，而是一個(gè)主動(dòng)的生物學(xué)過(guò)程[3]。微小RNA（microRNA, miRNA)能夠通過(guò)調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的表型而影響血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展，有研究表明冠狀動(dòng)脈鈣化患者血清miR-297a表達(dá)異常[4]。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23（Fibroblast growth factor 23，F(xiàn)GF23）由成骨細(xì)胞分泌，具有調(diào)節(jié)鈣磷平衡的功能，文獻(xiàn)報(bào)道其與冠狀動(dòng)脈鈣化密切相關(guān)[5]。

高齡、脂質(zhì)代謝紊亂、高血糖、高鈣血癥、腎透析、高血壓等是冠脈鈣化的重要影響因素[6]。已有文獻(xiàn)報(bào)道，維持性血液透析患者血清FGF23水平與冠狀動(dòng)脈鈣化具有相關(guān)性[7]。本研究觀察高血壓人群miR-297a、FGF23表達(dá)水平及其與高血壓冠狀動(dòng)脈鈣化的相關(guān)性，分析miR-297a、FGF23作為冠狀動(dòng)脈鈣化診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床的可能性，為臨床高血壓患者冠狀動(dòng)脈鈣化的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象與分組

入選標(biāo)準(zhǔn)：1）符合高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)；2）未合并糖尿病、慢性腎病、惡性腫瘤；3）無(wú)高脂血癥、高鈣血癥；4）簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）先天性心臟病或慢性風(fēng)濕性心臟??；2）接受免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素等藥物治療；3）接受活性維生素D沖擊治療。

選取2015年9月至2018年6月期間住院高血壓患者95例作為研究對(duì)象，另選取同期在進(jìn)行體檢的40例無(wú)CAC健康者作為對(duì)照組。所有研究對(duì)象均完成血管內(nèi)超聲[8]。按照血管內(nèi)超聲結(jié)果，分為無(wú)鈣化組、輕度鈣化組（血管內(nèi)超聲I～I(xiàn)I級(jí)）、重度鈣化組（血管內(nèi)超聲III～I(xiàn)V級(jí)）。高血壓無(wú)鈣化組37例，輕度鈣化組27例，重度鈣化組31例。健康對(duì)照組及高血壓無(wú)鈣化組，輕度鈣化組，重度鈣化組4組年齡、性別等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），研究具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 所有研究對(duì)象晨起空腹采取肘靜脈血2mL，置于EP管內(nèi)，4℃，3000 r/min離心10 min，小心吸取上清液置于另一EP管內(nèi)，-80℃保存，現(xiàn)用現(xiàn)融，以免發(fā)生溶血。

1.2.2 qRT-PCR法檢測(cè)血清miR-297a表達(dá)情況采用qRT-PCR法檢測(cè)研究對(duì)象血清中miR-297a相對(duì)表達(dá)量。提取血清總RNA，按照試劑盒說(shuō)明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后進(jìn)行PCR檢測(cè)。qRTPCR程序設(shè)定為：95 ℃預(yù)熱30 s，60 ℃ 15 s，72℃ 15 s，以上三步驟共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，并對(duì)所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，采用2-ΔΔCt算法計(jì)算miR-297a相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.3 FGF23及成骨細(xì)胞標(biāo)記物 應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清中FGF23、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（Bone morphogenesis pale，BMP-2）、基質(zhì) Gla 蛋白（matrix gla protein，MGP）水平。試劑盒分別為人FGF-23 ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）、ALP檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）、人BMP-2 ELISA試劑盒（艾美捷科技有限公司）、MGP檢測(cè)試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附法)（上海鈺博生物科技有限公司），嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 分析方法 比較4組血清miR-297a、FGF23、堿性磷酸酶、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、基質(zhì)Gla蛋白水平，分析miR-297a、FGF23與堿性磷酸酶、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、基質(zhì)Gla蛋白的相關(guān)性。觀察血清miR-297a和FGF23水平對(duì)高血壓患者冠狀動(dòng)脈鈣化的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間采用方差分析；Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析；采用Logistic回歸分析法評(píng)估影響高血壓患者冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生的因素；ROC曲線分析檢測(cè)miR-197a和FGF23對(duì)高血壓患者發(fā)生血管鈣化的預(yù)測(cè)價(jià)值。各組數(shù)據(jù)均以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組血清miR-297a、FGF23水平比較

高血壓非鈣化組miR-297a表達(dá)、FGF23水平與健康對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），輕度鈣化組和重度鈣化組miR-297a表達(dá)低于非鈣化組和健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），輕度鈣化組和重度鈣化組FGF23水平高于非鈣化組和健康對(duì)照組（P＜0.05）；與輕度鈣化組相比，重度鈣化組miR-297a表達(dá)降低，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），輕度鈣化組與重度鈣化組FGF23水平相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 4組miR-297a、FGF23水平比較 （±s）

表2 4組miR-297a、FGF23水平比較 （±s）

注：a代表與健康對(duì)照組相比，P＜0.05；b代表與非鈣化組相比，P＜0.05；c代表與輕度鈣化組相比，P＜0.05。

組別 例數(shù) miR-297a/U6 FGF23（pg/mL）健康對(duì)照組 40 1.02±0.25 38.26±9.56非鈣化組 37 1.04±0.24 37.95±9.48輕度鈣化組 27 0.57±0.11ab 208.97±55.52ab重度鈣化組 31 0.38±0.09abc 210.38±52.59ab F 155.381 444.568 P＜0.001 ＜0.001

2.2 4組冠狀動(dòng)脈鈣化相關(guān)指標(biāo)比較

輕度鈣化組和重度鈣化組的ALP、MGP高于非鈣化組和健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。輕度鈣化組、重度鈣化組、非鈣化組BMP-2高于健康對(duì)照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。輕度鈣化組和重度鈣化組ALP、BNP-2、MGP組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。健康對(duì)照組與非鈣化組ALP、MGP水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 4組ALP、BMP-2、MGP水平比較（±s）

表3 4組ALP、BMP-2、MGP水平比較（±s）

注：a代表與健康對(duì)照組相比，P＜0.05；b代表與非鈣化組相比，P＜0.05。

組別 例數(shù) ALP（U/gprot） BMP-2（pg/mL） MGP（pg/mL）健康對(duì)照組 40 49.86±14.12 13.59±3.51 89.72±22.43非鈣化組 37 52.38±13.10 29.28±3.59a 91.05±21.76輕度鈣化組 27 73.88±12.57ab 44.61±7.79a 58.87±19.33ab重度鈣化組 31 83.64±28.41ab 42.38±11.05a 60.49±15.12ab F 148.839 243.647 34.681 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 血清miR-297a和FGF23水平與血管鈣化相關(guān)指標(biāo)相關(guān)性

Pearson相關(guān)性結(jié)果表明：miR-297a與ALP、BMP-2呈負(fù)相關(guān)（r= -0.759、-0.812，P＜0.05），與MGP呈正相關(guān)（r= 0.763，P＜0.05）；FGF23與ALP、BMP-2呈正相關(guān)（r= 0.759、0.804，P＜0.05），與MGP呈負(fù)相關(guān)（r= -0.811，P＜0.05）。詳見(jiàn)表4。

表4 相關(guān)性分析

2.4 Logistic回歸分析影響高血壓患者冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生的因素

將是否發(fā)生冠狀動(dòng)脈鈣化為因變量，以ALP、BMP-2、MGP、miR-297a和FGF23水平為自變量并進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示ALP、BMP-2、MGP、miR-297a和FGF23均為冠狀動(dòng)脈鈣化的影響因素，miR-297高表達(dá)是影響血管鈣化的保護(hù)因素，F(xiàn)GF23水平高是影響冠狀動(dòng)脈鈣化的危險(xiǎn)因素。詳見(jiàn)表5。

表5 多元回歸分析

2.5 血清miR-297a和FGF23水平對(duì)高血壓患者冠狀動(dòng)脈鈣化的預(yù)測(cè)價(jià)值

ROC曲線顯示，miR-297a預(yù)測(cè)高血壓患者冠狀動(dòng)脈鈣化曲線下面積為0.859，截?cái)嘀禐?.735，敏感度為88.7%，特異性為86.8%。FGF23水平預(yù)測(cè)高血壓患者冠狀動(dòng)脈鈣化的曲線下面積為0.906，截?cái)嘀禐?3.49 pg/mL，敏感度為92.5%，特異性為89.5%。詳見(jiàn)圖1。

圖1 miR-297a和FGF23的ROC曲線

3 討論

冠狀動(dòng)脈鈣化是一個(gè)類似于成骨的主動(dòng)過(guò)程，致鈣化細(xì)胞向成骨表型分化形成鈣化[9]。流行病學(xué)資料表明，冠狀動(dòng)脈鈣化在40～49歲人群的發(fā)生率達(dá)到50%[10]，中國(guó)人出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈鈣化的比率高于黑種人，低于白種人[11]。對(duì)于急性心肌梗死患者，冠狀動(dòng)脈鈣化明顯增加了PCI的難度，可能導(dǎo)致手術(shù)困難，術(shù)中球囊破裂、術(shù)后支架貼壁不全等并發(fā)癥[12]。除目前臨床應(yīng)用的血管內(nèi)超聲、冠狀動(dòng)脈CT或冠狀動(dòng)脈血管造影等影像學(xué)手段外[13]，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)對(duì)判斷鈣化程度、預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈鈣化的發(fā)生有其實(shí)際意義。

miRNAs已被證實(shí)參與生物體多種生命活動(dòng)，miRNAs涉及調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、遷移、凋亡及表型變化等各種生理和病理過(guò)程，幾乎參與了人體一切生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)和所有疾病發(fā)病過(guò)程的調(diào)控[14]。近年來(lái)，文獻(xiàn)研究表明，miRNAs在冠狀動(dòng)脈鈣化中發(fā)揮了重要作用。miR-297a是一個(gè)典型的多功能microRNA，位于非編碼區(qū)基因Pic內(nèi)[15]。Zheng等[4]通過(guò)維生素D3加尼古丁構(gòu)建大鼠血管鈣化模型，通過(guò)miRNA芯片檢測(cè)、篩選大鼠血管鈣化模型中差異性表達(dá)的miRNA，觀察血管鈣化過(guò)程中miRNA表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明miR-297a在血管鈣化過(guò)程中明顯下調(diào)。本研究通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈鈣化患者miR-297a表達(dá)水平顯著低于無(wú)冠脈血管鈣化患者，提示高血壓患者血清miR-297a表達(dá)情況與冠狀動(dòng)脈鈣化的發(fā)生密切相關(guān)。

FGF23是FGFs家族重要成員之一，由骨細(xì)胞及骨成纖維細(xì)胞所分泌，在鈣磷調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[16-18]。有研究表明，F(xiàn)GF23生理作用為修復(fù)受損內(nèi)皮細(xì)胞，促使新血管形成，改善近端腎小管Na-P轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白胞吞作用，促進(jìn)磷酸外分泌，且能減少血液內(nèi)1,25（OH）VD含量，減少腸道內(nèi)磷酸鹽吸收，降低血磷表達(dá)水平[19]。Jimbo[20]在慢性腎病引起的血管鈣化中研究表明，慢性腎病中晚期冠狀動(dòng)脈鈣化患者血清FGF23水平較普通人群顯著升高，與冠狀動(dòng)脈發(fā)生及不良預(yù)后密切相關(guān)。本研究中，高血壓冠狀動(dòng)脈鈣化患者血清FGF23水平顯著高于健康對(duì)照組和無(wú)鈣化患者，推測(cè)FGF23可反應(yīng)高血壓患者體內(nèi)冠狀動(dòng)脈鈣化情況。

血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VEMCs）作為心血管系統(tǒng)主要的構(gòu)成細(xì)胞，其由收縮表型向成骨細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)變，是血管鈣化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵病理過(guò)程，此過(guò)程中涉及血管平滑肌細(xì)胞收縮表型的喪失、成骨樣細(xì)胞表型的獲得以及細(xì)胞內(nèi)鈣鹽的沉積[21-22]。ALP是一組同工酶，是骨鈣化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，VSMCs可在各種鈣化因素作用下高表達(dá)堿性磷酸酶，ALP酶活性增加促進(jìn)鈣化發(fā)生，可反映血管鈣化程度[23]。BMP-2是可誘導(dǎo)骨組織形成的局部生長(zhǎng)因子，在血清生長(zhǎng)因子刺激下可抑制VSMC增殖[24]。MGP與血管鈣化密切相關(guān)，主要由動(dòng)脈血管壁平滑肌細(xì)胞合成，敲除MGP基因則主動(dòng)脈鈣化嚴(yán)重[25]。

本研究Pearson分析結(jié)果表明miR-297a表達(dá)水平與血管鈣化指標(biāo)ALP、BMP-2呈負(fù)相關(guān)，與MGP呈正相關(guān)；FGF23水平與血管鈣化指標(biāo)ALP、BMP-2水平呈正相關(guān)，與MGP水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-297a下調(diào)表達(dá)、FGF23上調(diào)表達(dá)可能促進(jìn)高血壓患者冠狀動(dòng)脈鈣化過(guò)程。多因素分析結(jié)果顯示miR-297a高表達(dá)是患者發(fā)生冠狀動(dòng)脈鈣化的保護(hù)因素，F(xiàn)GF23高水平是高血壓冠狀動(dòng)脈鈣化的危險(xiǎn)因素之一。進(jìn)一步ROC分析結(jié)果得出，miR-297a預(yù)測(cè)高血壓患者冠狀動(dòng)脈鈣化曲線下面積為0.859，敏感度特異性高，截?cái)嘀禐?.735，表明miR-297a低于0.735時(shí)，高血壓患者發(fā)生冠狀動(dòng)脈鈣化風(fēng)險(xiǎn)增高。血清FGF23曲線下面積為0.906，敏感度為92.5%，特異性為89.5%，截?cái)嘀禐?3.49 pg/mL。本研究也存在一定不足，miR-297a如何參與調(diào)控FGF23抑制冠狀動(dòng)脈鈣化還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，血清miR-297a表達(dá)降低、FGF23水平升高與高血壓患者發(fā)生冠狀動(dòng)脈鈣化有關(guān)，檢測(cè)血清miR-297a、FGF23水平可評(píng)估高血壓患者發(fā)生血管鈣化的風(fēng)險(xiǎn)，具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。