探討電鏡包埋時(shí)間對(duì)脂肪組織超微結(jié)構(gòu)的影響

曲寶清 張琪 張翠萍 何萍 強(qiáng)桂芬

1.北京市神經(jīng)外科研究所首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院，北京 100070；

2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所藥物靶點(diǎn)研究與新藥篩選北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

生物電鏡制樣技術(shù)十分繁復(fù)，不同的標(biāo)本在處理時(shí)應(yīng)根據(jù)其特性進(jìn)行個(gè)性化處理，電鏡樣品的取材、制作非常關(guān)鍵。如果設(shè)計(jì)不合理，操作不規(guī)范，將造成實(shí)驗(yàn)試劑和時(shí)間上的浪費(fèi)[1]。

脂肪生物學(xué)是當(dāng)前研究肥胖及相關(guān)代謝性疾病的研究熱點(diǎn)，脂肪細(xì)胞組成的脂肪組織是人體中一種特殊的結(jié)締組織，包括白色脂肪與棕色脂肪，它們分別由白色脂肪細(xì)胞及棕色脂肪細(xì)胞組成[2]。白色脂肪細(xì)胞儲(chǔ)存脂肪的球體內(nèi)為大脂滴，是一種呈球狀的單層膜細(xì)胞器，脂滴中90%～99%為甘油三酯，還有少量脂肪酸、甘油二酯、膽固醇及磷脂等，用于儲(chǔ)存熱量；棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)有數(shù)量多且大小不等的圓形脂滴，胞漿內(nèi)含有較多的線粒體，間質(zhì)有豐富的血管，脂滴和線粒體緊密聯(lián)系，分解甘油三酯，發(fā)揮產(chǎn)熱耗能的作用[3-4]。鑒于脂肪組織結(jié)構(gòu)的特殊性，在電鏡樣品制備過(guò)程中，探索不同于常規(guī)的制備方法及包埋技術(shù)，將有助于提高電鏡觀察脂肪組織超微結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性。本文分析和探討透射電鏡制樣技術(shù)中的包埋時(shí)間對(duì)脂肪組織超微結(jié)構(gòu)觀察的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

水合氯醛購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；多聚甲醛購(gòu)自MERCK公司；戊二醛購(gòu)自SIGMA公司；磷酸鹽緩沖液購(gòu)自Coolaber公司；四氧化鋨（OsO4）購(gòu)自TED PELLA,INC公司；乙醇、環(huán)氧丙烷購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Epon812購(gòu)自SPI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠，體重22～25 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供（清潔級(jí)，許可證編號(hào)SCXK(京) 2016-0006）。

1.3 取材

4%水合氯醛（0.1 mL/10 g體重）腹腔注射麻醉小鼠，打開(kāi)腹腔，下腔靜脈取血后即刻進(jìn)行取材，分別自附睪旁取出白色脂肪及背部肩胛區(qū)取出棕色脂肪，在冰上切成約1mm3大小，立即置于冰預(yù)冷的2%多聚甲醛-2.5%戊二醛固定液中，用于制作電鏡標(biāo)本和超微結(jié)構(gòu)的觀察[5-6]。

1.4 透射電鏡樣品前處理

將固定2小時(shí)后的白色脂肪和棕色脂肪，經(jīng)0.1mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗3次，10min/次，后放置于磷酸鹽緩沖液中，4℃冰箱保存。按照包埋時(shí)間分為三組：第一組為浸泡第2天進(jìn)行組織包埋處理；第二組為浸泡第7天進(jìn)行組織包埋處理；第三組為浸泡第14天進(jìn)行組織包埋處理。

1.5 透射電鏡樣品制備

將浸泡于磷酸鹽緩沖液中的白色脂肪和棕色脂肪，采用四氧化鋨（OsO4）后固定2h，梯度乙醇脫水、環(huán)氧丙烷置換，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂浸透包埋，UC6（德國(guó)LEICA公司）型超薄切片機(jī)切取1μm的半薄切片，天青-亞甲基藍(lán)染色，光鏡觀察并定位。用UC6型超薄切片機(jī)切取厚約80nm的超薄切片，醋酸雙氧鈾-硝酸鉛染色后，HITACHI-H7650型透射電鏡（日本日立公司）觀察并拍照記錄[7-8]。

2 結(jié)果

2.1 包埋時(shí)間對(duì)白色脂肪組織超微結(jié)構(gòu)的影響

白色脂肪的光鏡半薄切片結(jié)果顯示，第一組白色脂肪細(xì)胞大而圓，細(xì)胞核和細(xì)胞器被擠壓至細(xì)胞的一側(cè)，胞膜光滑，胞漿內(nèi)為染色單一的均質(zhì)大型脂滴，呈單房結(jié)構(gòu)（圖1?）。第二組白色脂肪細(xì)胞形態(tài)略顯不規(guī)則形，胞膜粗糙呈點(diǎn)狀密集排列（圖1?）。第三組白色細(xì)胞部分區(qū)域見(jiàn)脂肪細(xì)胞崩解，胞膜上見(jiàn)大小不一串珠樣白色小泡（圖1?）。

電鏡觀察超微結(jié)果顯示，第一組白色脂肪組織脂肪細(xì)胞形態(tài)多為圓形，胞膜光滑，胞漿內(nèi)為染色均質(zhì)的脂類物質(zhì)，并見(jiàn)少量線粒體，間質(zhì)見(jiàn)血管結(jié)構(gòu)（圖1?）。第二組胞膜不光滑，沿胞膜有的圓形小泡分布，線粒體形態(tài)固縮(圖1?)。第三組白色脂肪組織脂肪細(xì)胞形態(tài)不甚規(guī)則，胞膜界限不清且部分?jǐn)嗔眩€粒體形態(tài)破壞，細(xì)胞內(nèi)和胞漿內(nèi)散在大小不等串珠樣絮狀無(wú)定形物質(zhì)(圖1?) 。

圖1 三組白色脂肪組織光鏡和電鏡下細(xì)胞形態(tài)

2.2 包埋時(shí)間對(duì)棕色脂肪組織超微結(jié)構(gòu)的影響

光鏡觀察半薄切片結(jié)果顯示，第一組棕色脂肪組織內(nèi)含大小不一的密集排列的脂肪細(xì)胞,間質(zhì)內(nèi)血管豐富，胞漿內(nèi)脂滴為圓形且體積小，呈多房室結(jié)構(gòu)（圖2?）。第二組鏡下見(jiàn)密集棕色脂肪細(xì)胞形態(tài)正常，脂滴為大小不等圓形，胞膜上偶見(jiàn)散在白色小泡（圖2?）。第三組鏡下脂肪細(xì)胞內(nèi)大量大小不等，排列密集的不規(guī)則串珠樣小泡（圖2?）。

圖2 三組棕色脂肪組織光鏡和電鏡下細(xì)胞形態(tài)

電鏡下超薄切片觀察結(jié)果顯示，第一組棕色脂肪細(xì)胞密集，胞膜光滑，界限清晰，胞漿內(nèi)見(jiàn)大量線粒體及大小不等脂滴，脂滴形態(tài)為圓形且光滑，間質(zhì)見(jiàn)血管結(jié)構(gòu)（圖2?）。第二組見(jiàn)脂肪細(xì)胞胞膜不光滑，胞膜褶皺，胞漿內(nèi)線粒體腫脹，脂滴多為圓形，脂滴旁見(jiàn)亮色圓形小泡(圖2?）。第三組鏡下見(jiàn)脂肪細(xì)胞胞膜界限不清，線粒體形態(tài)異常，胞漿內(nèi)見(jiàn)大片無(wú)規(guī)則形亮色物質(zhì)，散在胞漿內(nèi)且大多分布脂滴周邊，形成串珠樣改變(圖2?)。

3 結(jié)論

脂肪分為白色脂肪和棕色脂肪，白色脂肪主要儲(chǔ)備脂質(zhì)，是維持體溫和產(chǎn)熱的主要器官；而棕色脂肪則是專屬的非寒顫產(chǎn)熱器官，在能量代謝中發(fā)揮重要作用[9-10]。棕色脂肪其組成的脂肪細(xì)胞含有眾多的線粒體和豐富的血管，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)白色脂肪[11]。

在脂肪組織電鏡樣品制備過(guò)程中，多聚甲醛-戊二醛固定液使脂肪細(xì)胞內(nèi)的蛋白成分固定，鋨酸又固定了細(xì)胞內(nèi)的脂類物質(zhì)，棕色脂肪內(nèi)存在的大量線粒體和血管成分夾裹著多個(gè)脂滴[12]。白色脂肪細(xì)胞內(nèi)僅有一個(gè)貯存脂肪的球體，單一球體將細(xì)胞核等擠到細(xì)胞的周邊，使細(xì)胞漿成為一個(gè)薄薄的環(huán)，包圍著脂肪球體[13-14]。通過(guò)電鏡下觀察對(duì)比發(fā)現(xiàn)，白色脂肪細(xì)胞內(nèi)除脂滴這種特殊的細(xì)胞器之外，其他細(xì)胞器稀少；棕色脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴多，大小不一呈多房結(jié)構(gòu)。脂肪細(xì)胞整體上穩(wěn)定性差，對(duì)外界諸如滲透壓等環(huán)境因素比致密的組織細(xì)胞更容易受到破壞[15]。正是脂肪細(xì)胞特殊的結(jié)構(gòu)特征，長(zhǎng)時(shí)間放置在緩沖液內(nèi)使脂類物質(zhì)的微細(xì)結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化，電鏡下無(wú)法觀察其原生形態(tài)結(jié)構(gòu)，造成實(shí)驗(yàn)材料、標(biāo)本、人力、物力和時(shí)間成本的浪費(fèi)，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

生物電鏡標(biāo)本制備技術(shù)復(fù)雜繁瑣，環(huán)節(jié)很多，不同的標(biāo)本應(yīng)根據(jù)其生物特點(diǎn)選擇合適的實(shí)驗(yàn)方法和流程, 才能做到萬(wàn)無(wú)一失，得到高質(zhì)量的電鏡結(jié)果，從而達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。脂肪組織的電鏡樣品制備過(guò)程中，應(yīng)在盡量短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行包埋，制備新鮮的電鏡樣品，盡可能地穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)脂類析出，才能真實(shí)反映脂肪組織表面以及脂肪細(xì)胞間的結(jié)構(gòu)關(guān)系。