免疫層析技術(shù)在獸醫(yī)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用

朱向東，朱雅寧，劉 偉，趙 靜，趙玉錳

（天津市動物疫病預(yù)防控制中心，天津 300402）

免疫層析技術(shù)是上世紀(jì)70 年代出現(xiàn)的一種血清學(xué)檢測技術(shù)，以抗原-抗體特異性的免疫學(xué)反應(yīng)和層析技術(shù)為技術(shù)基礎(chǔ)，利用毛細(xì)管床的虹吸作用和示蹤顆粒顯色反應(yīng)，大約5～15 min 可直觀地觀察到檢測結(jié)果，具有操作簡便、檢測快速、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，適合臨床快速檢測應(yīng)用。

免疫層析技術(shù)包括雙抗夾心法和競爭法兩種。雙抗夾心法是在信號發(fā)生區(qū)發(fā)生抗原夾心免疫反應(yīng)，當(dāng)檢測線和質(zhì)控線均顯色時(shí)判定為陽性結(jié)果，若檢測線不顯色而質(zhì)控線顯色時(shí)判定為陰性結(jié)果。競爭法則正好相反，當(dāng)檢測線和質(zhì)控線均顯色時(shí)判定為陰性，而只有質(zhì)控線顯色時(shí)判定為陽性。根據(jù)標(biāo)記物不同，目前主要包括膠體金、熒光免疫層析、納米酶和液相芯片等四種免疫層析試紙條檢測技術(shù)。

1 膠體金免疫層析試紙條檢測技術(shù)

1971 年Faulk 和Taytor 將膠體金引入免疫化學(xué)后，膠體金免疫層析技術(shù)快速發(fā)展并在獸醫(yī)檢測領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。2004 年姜建宏用原核表達(dá)制備偽狂犬病病毒gE 蛋白抗原和全病毒抗原研制了區(qū)分野毒感染和疫苗免疫的鑒別膠體金免疫層析法。2007 年王慧杰等建立了檢測豬圓環(huán)病毒Cap蛋白抗體的膠體金檢測方法，具有較強(qiáng)的靈敏性和穩(wěn)定性。2008 年蔣韜等建立了O 型口蹄疫病毒免疫層析試紙條檢測方法，其靈敏性高于反向間接血凝試驗(yàn)。2014 年張鑫宇等建立了非洲豬瘟病毒p54 抗體的膠體金檢測試紙條，敏感性可達(dá)到200 ng/mL，適合非洲豬瘟病毒感染早期檢測使用。2020 年王海麗等建立了羊布魯氏菌的膠體金檢測方法，具有特異、敏感、穩(wěn)定、操作簡單快捷等特點(diǎn)，適合于羊布魯氏菌病抗體的現(xiàn)場檢測。2021 年李昕等利用雙抗體夾心法將口蹄疫病毒的兔抗及豚鼠抗體作為標(biāo)記膠體金，分別制備出檢測O、A、Asia 1 血清型的3種層析試紙卡，對O、A、Asia 1 型病毒的最低檢出量分別為0.567、0.693、0.219μg/mL，從而建立了口蹄疫病毒抗原血清型的快速分型和定量的檢測方法。2023 年余春明等建立了犬瘟熱、犬細(xì)小病毒膠體金二聯(lián)檢測卡，該方法特異性強(qiáng)，靈敏度好，可用于臨床快速診斷。

2 熒光免疫層析試紙條檢測技術(shù)

2.1 熒光微球免疫層析試紙條檢測技術(shù) 熒光微球進(jìn)行標(biāo)記時(shí)是通過共價(jià)結(jié)合的方式，提高了免疫探針的穩(wěn)定性，與傳統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙條相比，具有獨(dú)特的優(yōu)勢。2014 年楊亞杰等建立了定量檢測牛乳中酪蛋白熒光微球免疫層析法，可快速、方便、高效的檢測牛乳制品中的過敏原（酪蛋白）。2016 年裴星瑤等建立了快速檢測雞飼料中喹乙醇含量的熒光微球免疫層析法，大大提高了靈敏度。2022 年邵穎等建立了血清4 型禽腺病毒POCT 熒光微球免疫層析檢測方法，該方法可以在15 min內(nèi)檢測出結(jié)果，與臨床診斷結(jié)果相符，可以用于基層獸醫(yī)臨床檢測。2022 年楊艷利用禽白血病病毒P27 蛋白多克隆抗體制備了熒光微球免疫層析檢測技術(shù)，為禽白血病的種群凈化和禽白血病的檢測提供了簡便的方法。2023 年王英超等研制了一種快速檢測牛布魯氏菌抗體的熒光快速檢測試紙卡，該方法與熒光偏振方法的符合率為100%，可以適用于臨床樣品的快速檢測。

2.2 量子點(diǎn)免疫層析試紙條檢測技術(shù) 量子點(diǎn)與傳統(tǒng)的有機(jī)染料相比，具有明顯優(yōu)勢，已成為一種非常有潛力的熒光探針標(biāo)記物。2020 年，孔玉方等以量子點(diǎn)熒光微球作為示蹤物，共價(jià)偶聯(lián)布魯氏菌外膜蛋白OMP22，并將布魯氏菌外膜蛋白OMP28和抗OMP22 的單克隆抗體噴涂于硝酸纖維素膜上分別作為檢測線和質(zhì)控線，組裝制備了檢測速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)且成本低的量子點(diǎn)熒光微球免疫層析試紙條，可用于布魯氏菌病的現(xiàn)場篩查。2022 年史伯昌等建立了量子點(diǎn)熒光微球布魯菌病快速診斷方法，對臨床血樣的總敏感性為97%，特異性為90%，可以用于基層布魯氏菌病的凈化檢測。2023 年徐志遠(yuǎn)等根據(jù)非洲豬瘟病毒VP72 蛋白的氨基酸序列建立了非洲豬瘟病毒熒光量子點(diǎn)檢測試紙條，與商品化的非洲豬瘟熒光定量PCR 檢測試劑盒陽性符合率為82.1%（23/28），陰性符合率為93.8%（75/80），可以用于非洲豬瘟病毒的現(xiàn)場快速診斷。

2.3 上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析試紙條檢測技術(shù) 2018年洪霞等以上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料（UCP）為新型標(biāo)記物，采用競爭免疫反應(yīng)建立了快速檢測黃曲霉毒素B1的上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析檢測卡方法，并對試紙條性能進(jìn)行評價(jià)。2019 年黃震等制備了上轉(zhuǎn)換納米材料（Upconversion Nanoparticles,UCNPs）,并將其應(yīng)用于免疫層析平臺，從而建立了一種檢測牛奶中大腸桿菌O157:H7 方法的上轉(zhuǎn)換免疫層析方法，該方法靈敏度較高，抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)，不僅能用于大腸桿菌O157:H7 的檢測，也可被推廣應(yīng)用于其它食源性致病菌檢測。2022 年張運(yùn)蓮建立了牛奶中抗生素殘留（卡那霉素、四環(huán)素和氨芐青霉素）的上轉(zhuǎn)換熒光納米傳感檢測方法，為牛奶中抗生素的痕量檢測提供了新思路。

2.4 時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條檢測技術(shù) 時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)是用稀土元素（Eu、Tb、Sm等）作為標(biāo)記物，其檢測靈敏度比膠體金試紙條等高出2～3 個(gè)數(shù)量級。2020 年王華俊等采用單克隆抗體技術(shù)和熒光微球免疫層析技術(shù)，制備PRV gE 抗原的時(shí)間分辨熒光微球免疫層析試紙卡，該試紙卡可在15 min 內(nèi)定量檢測樣品中PRV gE 抗原，與PRV gE 與gD 二重實(shí)時(shí)熒光PCR 的總符合率為89.55%，可以用于PRV 抗原的定性檢測，具有良好的臨床應(yīng)用價(jià)值。同年，朱玲等建立了可定量檢測豬血清或乳汁中PEDV IgG 或IgA 抗體的時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條，具有靈敏、特異、準(zhǔn)確、操作簡便、檢測快速的特點(diǎn)，符合臨床快速檢測的要求，可用于臨床上PEDV IgG 和IgA 的快速檢測。2021 年王華俊等建立了豬流行性腹瀉病毒時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測方法，最佳檢測時(shí)間15 min，可以用于PEDV 的現(xiàn)場檢測。2022 年孔繁霞等研制了基于時(shí)間分辨熒光微球的黃曲霉毒素B1 定量檢測卡，具有靈敏度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。

3 納米酶免疫層析試紙條檢測技術(shù)

納米酶免疫層析試紙條檢測技術(shù)是以納米酶為標(biāo)記物的又一新型檢測方法。該方法有效解決了傳統(tǒng)膠體金免疫層析試紙條檢測技術(shù)靈敏度低的問題。2016 年何暉等建立了一種快速篩查志賀氏菌的熒光納米免疫層析方法，具有良好的特異性和靈敏性，適用于現(xiàn)場快速檢測。2020 年劉鍵等研制了納米酶免疫層析試紙條，該試紙條對諾如病毒的最低檢出濃度為10 ng/mL,比普通膠體金試紙條靈敏度高10 倍；與輪狀病毒、腺病毒、幽門螺桿菌均無交叉反應(yīng)，具有簡便、快速、可現(xiàn)場應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn),在諾如病毒快速檢測中具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 液相芯片

液相芯片（Liquid chip，LP）又稱熒光微球免疫學(xué)檢測技術(shù)（Fluorescent-microbead immunoassay，F(xiàn)MIA），是一種結(jié)合熒光微球作為抗原復(fù)合物結(jié)合抗體的蛋白質(zhì)檢測方法。該方法可以在同一樣品中對多種分子同時(shí)進(jìn)行定性或定量分析，不僅可以進(jìn)行高通量檢測，而且大大提高了樣品利用率。2018年曾夢利用原核表達(dá)載體pMAL-c5x 對豬偽狂犬病毒gE 和gB 蛋白進(jìn)行了可溶性表達(dá)，以制備的重組蛋白為抗原與微球偶聯(lián)，分別建立 gE、gB IgG抗體單一FMIA 檢測方法，并在此基礎(chǔ)上建立了gE、gB 的雙重FMIA 檢測方法，該方法優(yōu)于同時(shí)建立的ELISA 方法，可以用于PRV 野毒感染和疫苗免疫豬IgG 的快速鑒別診斷及檢測。2021 年曹丙蕾等建立了豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎二重液相芯片檢測方法，可用于豬流行性腹瀉病毒與豬傳染性胃腸炎病毒的鑒別診斷，與熒光RT-PCR 檢測方法的符合率為100%。2022 年王群等建立了牛病毒性腹瀉病毒抗體液相芯片高效檢測方法，靈敏度高于ELISA 方法，為牛病毒性腹瀉病毒的口岸快速檢測提供了一種新的方法。2023 年鄔旭龍等建立了同時(shí)檢測7 種豬繁殖障礙性疫病的方法，該方法能夠同時(shí)檢測豬偽狂犬病病毒、豬日本乙型腦炎病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒和非洲豬瘟病毒等7 種豬繁殖障礙性疫病，最低檢測限度為103 copies/μL，為豬病多種病原快速鑒別診斷提供了技術(shù)儲備。

5 展 望

膠體金免疫層析檢測技術(shù)在獸醫(yī)快檢領(lǐng)域已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用，對動物疫病的快速診斷和早期診斷發(fā)揮了積極的作用。近年來，熒光微球免疫層析技術(shù)也已經(jīng)在獸醫(yī)領(lǐng)域進(jìn)行了不斷的研究和推廣應(yīng)用?？梢?，以后的免疫層析技術(shù)肯定朝著半定量、定量和高通量檢測方向發(fā)展。此外，免疫層析檢測技術(shù)結(jié)合互聯(lián)網(wǎng)手段在動物疫病的監(jiān)測和數(shù)據(jù)分析方面的發(fā)展和應(yīng)用將為獸醫(yī)領(lǐng)域的健康發(fā)展保駕護(hù)航。