甘肅省玉米大斑病菌交配型組成及遺傳多樣性分析

高建昊 戴子淙 張小杰 周天旺 王春明 洪流 郭成

摘 要 為明確甘肅省玉米大斑病菌交配型組成及遺傳結(jié)構(gòu)，利用交配型鑒定特異引物對(duì)采自該省不同地區(qū)的玉米大斑病菌進(jìn)行交配型測(cè)定，并采用簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性（ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)供試菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明：甘肅省玉米大斑病菌主要包括3種交配型，即A交配型、a交配型和Aa交配型，其比例約為8∶8∶1。24條ISSR引物共擴(kuò)增出136條條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出5.67條，其中多態(tài)性條帶134條，多態(tài)性條帶比例為98.53%。利用PopGen 32軟件分析發(fā)現(xiàn)甘肅3個(gè)地區(qū)玉米大斑病菌間的親緣關(guān)系更近，遺傳距離均小于0.08；隴南地區(qū)與陜西省的菌株有更高的遺傳相似度，為0.933 8；用NTSYS-pc軟件對(duì)隴東地區(qū)的菌株聚類分析，發(fā)現(xiàn)ISSR類群的劃分與菌株交配型間并沒(méi)有直接關(guān)系。說(shuō)明玉米大斑病菌遺傳類群和交配型之間無(wú)明顯相關(guān)性，但與菌株地理來(lái)源有一定的相關(guān)性。

關(guān)鍵詞 玉米大斑病菌；交配型；ISSR；遺傳多樣性

玉米大斑病是世界玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的一種葉部病害，在玉米整個(gè)生育期均可發(fā)病，影響玉米的生產(chǎn)，一般年份發(fā)病可造成20%左右的產(chǎn)量損失，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)到50%以上［1］。近年來(lái)，隨著感病品種‘先玉335及其近緣種的廣泛種植，加之氣候及耕作制度的變化，導(dǎo)致玉米大斑病在不同地區(qū)和不同年份頻頻發(fā)生與流行，現(xiàn)已成為危害甘肅東南部玉米生產(chǎn)的主要葉部病害之一［2］。

大斑凸臍蠕孢菌Exserohilum turcicum （Pass.） Leonard & Suggs［有性態(tài)為大斑剛毛座腔菌Setosphaeria turcia （Luttr.） Leonard & Suggs］是引起玉米大斑病的病原菌［2］。該病菌為異宗配合真菌，其有性生殖受MAT基因控制，包括僅含 ?StMAT1-1基因的A交配型、僅含 ???StMAT1-2基因的a交配型和同時(shí)包含兩種基因的Aa交配型［3］。在自然條件下不斷地進(jìn)行有性生殖，病原菌基因有性重組，使得病菌變異頻率頻繁，生理小種也隨之不停變化，對(duì)病害的防治與抗病品種造成嚴(yán)重威脅［4］。

分子標(biāo)記能夠在DNA水平上反應(yīng)病原菌個(gè)體及種群間的差異［5-6］，目前已有多種分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用。ISSR具有可獲信息量高，可重復(fù)性強(qiáng)，檢測(cè)多態(tài)性高且操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)［2］ 。谷守芹等［7］利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了玉米大斑病菌的遺傳多樣性；郭麗媛［2］在谷守芹等［7］的基礎(chǔ)上優(yōu)化了ISSR-PCR分析的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，并討論了玉米大斑病菌的遺傳多樣性與菌株地理來(lái)源和交配型間的關(guān)系；代玉立等［4］利用ISSR法研究了福建省玉米大斑病菌的遺傳多樣性。目前尚未見(jiàn)到對(duì)甘肅省玉米大斑病菌遺傳多樣性研究的報(bào)道。

根據(jù)郭成等［8］的調(diào)查，玉米大斑病在甘肅省隴東地區(qū)發(fā)病嚴(yán)重，部分地塊病情級(jí)別高達(dá)7～9級(jí)，平均病株率為87.9%，嚴(yán)重危害了當(dāng)?shù)赜衩装踩a(chǎn)。本研究對(duì)甘肅省玉米大斑病菌的交配型和遺傳多樣性進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步深入研究甘肅省玉米大斑病的流行規(guī)律及綜合防控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試病樣：2021-2022年采集甘肅省及陜西省具有典型玉米大斑病癥狀的病葉標(biāo)樣，風(fēng)干后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基。馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL。

試劑及儀器：2×Power Taq PCR Master Mix、DL1000 DNA Marker和DL2000 DNA Marker均購(gòu)自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；TBE購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；B518229-0100真菌基因組DNA快速抽提試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司；PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離培養(yǎng) 采用組織分離法，剪取病健交界處的組織塊（4 mm×6 mm），于75%的酒精中消毒40 s，然后用無(wú)菌水清洗3次，置于PDA平板中。室溫培養(yǎng)3～4 d后轉(zhuǎn)至PDA上純化2～3次，保存菌株。經(jīng)分離培養(yǎng)后共獲得60株供試菌株，其中50株甘肅菌株進(jìn)行交配型鑒定和遺傳多樣性分析，10株陜西菌株僅作為地理種群的對(duì)照進(jìn)行遺傳多樣性分析（表1）。[FL）]

1.2.2 DNA提取 刮取純化的病菌菌絲裝入滅過(guò)菌的1.5 mL離心管中，干燥后加入小鋼珠，于液氮中冷卻，用組織研磨機(jī)將菌絲研磨成粉末，利用B518229-0100真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取各菌株DNA，測(cè)定OD260/OD280，確定其濃度與純度，-20 ℃保存，備用。

1.2.3 病原菌鑒定 將純化后的單菌落接種在PDA平板上，室溫培養(yǎng)7 d，觀察菌落特征，并于普通光學(xué)顯微鏡下觀察孢子形態(tài)。同時(shí)，以提取的DNA為模板，利用引物ITS1（5′- TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［6，9］對(duì)ITS區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增。采用25? μL 的PCR反應(yīng)體系，即? 12.5? μL 2×Power Taq PCR Master Mix，1? μL上游引物，1? μL下游引物，2? μL DNA模板，ddH2O補(bǔ)足至25? μL。PCR反應(yīng)程序參考馬周杰等［6］病原菌鑒定的PCR反應(yīng)程序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)拍照后，交于上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行比對(duì)，下載相似性大于99%的序列，以蕓薹鏈格孢（Alternaria brassicae）、細(xì)極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、茄鏈格孢（Alternaria solani）、菜豆殼球孢（Macrophomina phaseolina）等為外類群，以大斑剛毛座腔菌（Setosphearia turcica）和凸臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum）為內(nèi)類群，基于ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 交配型分子鑒定

以提取的50株甘肅省玉米大斑病菌株DNA為模板，參照張泗舉［3］提出的玉米大斑病菌交配型測(cè)定引物（表2）進(jìn)行PCR鑒定。反應(yīng)體系同“1.2.3”節(jié)。參照張泗舉［3］設(shè)定PCR反應(yīng)程序，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增條帶有無(wú)及大小確定交配型。只擴(kuò)增出800 bp左右目的條帶的菌株為A交配型菌株，只擴(kuò)增出250 bp左右目的條帶的菌株為a交配型菌株，同時(shí)可擴(kuò)增出2個(gè)目的條帶的菌株為Aa交配型菌株，無(wú)目的條帶擴(kuò)增結(jié)果的菌株為中性菌株。

1.2.5 ISSR-PCR擴(kuò)增 參考谷守芹等［7］、郭麗媛［2］和代玉立等［4］優(yōu)化的ISSR-PCR反應(yīng)體系和篩選的引物，對(duì)所有供試的60株大斑病菌株進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成（表3）。反應(yīng)體系同“1.2.3”節(jié)。PCR反應(yīng)程序參考郭麗媛［2］ISSR-PCR擴(kuò)增所用程序（退火溫度見(jiàn)表3）。取6? μL擴(kuò)增產(chǎn)物用的1.5%瓊脂糖凝膠在220 V恒定電壓下電泳約20 min，用凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計(jì)電泳條帶，在遷移率相同的位置，有條帶的記為1，無(wú)條帶的記為0，將數(shù)據(jù)結(jié)果錄入Excel表中構(gòu)建原始數(shù)據(jù)矩陣。利用PopGen? 32計(jì)算遺傳距離、遺傳相似度、Neis基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)等遺傳變異參數(shù)，并利用UPGMA構(gòu)建基于Neis遺傳距離的聚類圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌鑒定

所有供試菌株的菌落背面為欖綠色或黑褐色；在光學(xué)顯微鏡下觀察（圖1），菌絲為灰黑色，分生孢子梗呈直立狀或彎曲狀，單生或簇生，棕褐色，頂端為淺棕色，有2～6 個(gè)橫隔膜，分生孢子為黃褐色，呈長(zhǎng)梭形或紡錘形，中下部較寬，有明顯的臍點(diǎn)，具2～8個(gè)橫隔膜，大小為（36.56～? 59.14）? μm×（8.19～14.51） μm。

所有供試菌株均用ITS1/ITS4引物擴(kuò)增出約600 bp的條帶，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列結(jié)果與GenBank中的玉米大斑病菌的無(wú)性態(tài)大斑凸臍蠕孢菌（Exserohilum turcicum） 菌株序列（NCBI accession NO. MG727619.1）和有性態(tài)大斑剛毛座腔菌（Setosphearia turcica）菌株序列（NCBI accession No. KJ922728.1）進(jìn)行比對(duì)，同源性均達(dá)99%以上。利用軟件MEGA 11.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），所有供試菌株均能與E. turcicum和S. turcica聚為一支。因此，所有分離株均被鑒定為大斑剛毛座腔菌（S. turcica）。

2.2 交配型組成分析

利用鑒定交配型的2對(duì)特異性引物對(duì)甘肅省的50株供試菌株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在供試的50株甘肅菌株中，A交配型（僅包含 ?StMAT1-1）共有24株，占菌株總數(shù)的48%，a交配型（僅包含 ?StMAT1-2）共有23株，占菌株總數(shù)的46%，Aa交配型的（同時(shí)包含 ?StMAT1-1和 ?StMAT1-2）共有3株，占菌株總數(shù)的6%，未檢測(cè)到中性菌株。從甘肅不同地區(qū)交配型的分布情況來(lái)看，28株來(lái)自隴南地區(qū)的供試菌株中有17株為A交配型，10株為a交配型，1株為Aa交配型，A交配型和a交配型的比例接近2∶1；15株來(lái)自隴東地區(qū)的供試菌株中有4株為A交配型，9株為a交配型，2株為Aa交配型，A交配型和a交配型的比例接近1∶2；7株隴中地區(qū)的菌株中有3株為A交配型，4株為a交配型， A交配型和a交配型的比例接近1∶1。這表明隴南地區(qū)玉米大斑病菌的優(yōu)勢(shì)交配型為A交配型，隴東地區(qū)玉米大斑病菌的優(yōu)勢(shì)交配型為a交配型，隴中地區(qū)玉米大斑病菌A交配型和a交配型同為優(yōu)勢(shì)交配型。

2.3 ISSR-PCR擴(kuò)增

對(duì)供試的60株玉米大斑病菌進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條帶的大小為100～5 000 bp，24條ISSR引物共擴(kuò)增出136條條帶，平均每條引物擴(kuò)增出5.67條條帶，其中多態(tài)性的條帶數(shù)為134條，多態(tài)性條帶比例為98.53%，表明玉米大斑病菌群體存在豐富的遺傳多樣性。將統(tǒng)計(jì)的電泳譜帶建立0、1矩陣，利用POPGEN軟件分析，結(jié)果顯示（表4），Neis基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)均以隴南地區(qū)為最高，分別為? 0.394 7和0.565? 5 ，表明該地區(qū)菌株的基因豐富度最高；陜西省次之，分別為0.373? 8和0.544 9；而隴東地區(qū)分別為0.371 4和0.538 0；隴中地區(qū)的則分別為0.329 5和0.474 3，說(shuō)明玉米大斑病菌基因多樣性與地理區(qū)域有較大的相關(guān)性。甘肅省3個(gè)地區(qū)的Shannon信息指數(shù)均在0.47以上，Neis基因多樣性指數(shù)均在0.32以上，表明甘肅省玉米大斑病菌的遺傳多樣性十分豐富。如表4所示，甘肅省3個(gè)地區(qū)中有效等位基因數(shù)、Neis基因多樣性指數(shù)、Shannon信息指數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率均以隴南地區(qū)最高，表明隴南地區(qū)菌株遺傳多樣性最豐富。

如表5所示，隴南地區(qū)與隴東地區(qū)的遺傳距離最小，為0.036 4；遺傳相似度最高，為0.964 3。相比隴東地區(qū)和陜西省，隴中地區(qū)與隴南地區(qū)的遺傳距離更小，為0.043 9；遺傳相似度更高，為? 0.957 1。甘肅3個(gè)地區(qū)中，隴南地區(qū)與陜西地區(qū)的遺傳距離最小，為0.068 4；遺傳相似度最高，為0.933 8 。對(duì)popgen聚類圖譜分析發(fā)現(xiàn)（圖3），在距離2.85處甘肅省3個(gè)地區(qū)和陜西省可聚為2個(gè)類群，分別是甘肅類群和陜西類群；在距離? 1.82處甘肅類群又聚為2個(gè)亞類群，其中隴東地區(qū)和隴南地區(qū)聚為一支，隴中地區(qū)聚為一支。以上結(jié)果表明，甘肅各地區(qū)玉米大斑病菌的親緣關(guān)系更近，隴南、隴中、隴東3個(gè)地區(qū)相比，隴南地區(qū)與陜西地區(qū)的菌株遺傳相似度更高。說(shuō)明玉米大斑病菌的遺傳親緣關(guān)系與地理來(lái)源有相關(guān)性。

在用NTSYS-pc軟件對(duì)隴東地區(qū)的菌株進(jìn)行聚類分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同交配型的菌株可以聚類在同一類群中，說(shuō)明菌株的交配型與遺傳分化之間并沒(méi)有明顯的相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

在甘肅，玉米大斑病主要危害隴東和隴南地區(qū)的玉米生產(chǎn)，是不可忽視的重要病害。中國(guó)玉米大斑病菌存在不同的交配類型（A交配型、a交配型和Aa交配型），且可以進(jìn)行有性生殖，這增加了玉米大斑病菌遺傳變異的幾率。異宗配合真菌的有性生殖受交配基因MAT的控制，交配類型A和a分別由 ?StMAT1-1和 StMAT1-2基因編碼［10］。在本研究中，檢測(cè)出甘肅省玉米大斑病菌存在A、a和Aa 3種交配類型，其中A交配型和a交配型比例接近1∶1，與Bunkoed等［11］報(bào)道泰國(guó)玉米大斑病菌A交配型與a交配型比例接近1∶1的研究結(jié)果比較一致；但與孫淑琴等［12］的中國(guó)玉米大斑病菌中Aa交配型的兩性菌株數(shù)量最大，王利智等［13］的云南省玉米大斑病菌A交配型比例明顯大于a交配型，以及郭麗媛［2］的中國(guó)北方玉米產(chǎn)區(qū)玉米大斑病菌a交配型比例遠(yuǎn)大于A交配型之結(jié)果有差異。以上研究結(jié)果表明，不同地區(qū)存在不同的優(yōu)勢(shì)交配型，且交配型分布比例也存在差異，有些地區(qū)交配型組成較為簡(jiǎn)單，有些地區(qū)交配型組成較為復(fù)雜，而不同的交配型有性雜交可能是生理小種趨于復(fù)雜的原因之一［12］。因此，監(jiān)測(cè)不同地區(qū)玉米大斑病菌的交配型分布及比例，對(duì)大斑病菌遺傳分化與病害流行的預(yù)測(cè)具有重要意義。此外，Nelson［14］發(fā)現(xiàn)玉米大斑病菌還存在雙性菌株和中性菌株，認(rèn)為玉米大斑病菌的交配類型不是簡(jiǎn)單的雙極性，但本研究并未發(fā)現(xiàn)中性菌株，今后還需擴(kuò)大樣本容量。

根據(jù)郭成等［8］的調(diào)查，近年來(lái)玉米大斑病在甘肅省發(fā)病日益嚴(yán)重，除氣候適宜等原因外，可能還與病原菌豐富的遺傳多樣性有關(guān)。因此，本研究以大斑病發(fā)病最嚴(yán)重的隴東地區(qū)為中心，采集了隴東地區(qū)、隴中地區(qū)、隴南地區(qū)及臨近甘肅省的陜西省部分地區(qū)的大斑病樣用于試驗(yàn)。本研究對(duì)供試的60株玉米大斑病菌進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)甘肅各地區(qū)菌株間的親緣關(guān)系更近，其中隴東地區(qū)與隴南地區(qū)的菌株有更高的遺傳相似度；隴中地區(qū)與隴東地區(qū)的遺傳相似度及隴中地區(qū)與隴南地區(qū)的遺傳相似度均高于隴中地區(qū)與陜西省的遺傳相似度，表明玉米大斑病菌的變異與地域之間有一定的關(guān)系，地域間的距離越近，菌株間的親緣關(guān)系越近。這與Ferguson等［15］、 Borchardt等［16］和郭麗媛［2］研究所得玉米大斑病菌的遺傳變異與地域間有一定的關(guān)系的結(jié)論一致。但與谷守芹等［7］、張明會(huì)等［17］、王利智等［13］和馬周杰等［6］分析認(rèn)為玉米大斑病菌類群劃分與菌株地理來(lái)源間的相關(guān)性并不顯著的結(jié)果不一致。以上結(jié)果表明，不同地區(qū)的病原菌受氣候、生態(tài)環(huán)境、人工作業(yè)、推廣品種的抗病基因組成等諸多因素影響，其地理來(lái)源對(duì)遺傳變異的影響表現(xiàn)出差異。本研究的結(jié)果表明，在甘肅省內(nèi)，病原菌的地理來(lái)源是影響遺傳多樣性的一個(gè)重要因素。同時(shí)在本研究中，不同的交配型可以劃分在同一類群中，說(shuō)明玉米大斑病菌的ISSR多態(tài)性與交配型之間的相關(guān)性不顯著。這與郭麗媛［2］交配型與菌株遺傳分化的關(guān)系不明顯的結(jié)果一致；但與谷守芹等［7］和馬周杰等［6］研究發(fā)現(xiàn)玉米大斑病菌菌株遺傳類群和交配型在分子水平上存在一定關(guān)系的結(jié)果不一致。這可能與各地菌株遺傳背景或海拔、氣候等環(huán)境因素的差異有關(guān)。因河西走廊干旱少雨，大斑病零星發(fā)生，甘肅中部干旱，大部分地區(qū)大斑病發(fā)生偏輕，故所有供試菌株中，主要缺乏甘肅中部地區(qū)的菌株，今后還需增大樣本容量，同時(shí)進(jìn)行生理小種的鑒定，進(jìn)一步確定玉米大斑病菌遺傳多樣性與地域、交配型和生理小種之間的關(guān)系以及同一地區(qū)的菌株變異趨勢(shì)，以期對(duì)大斑病的綜合防控起到支撐作用。

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Analysis of Mating Type Composition and Genetic Diversity of Northern Maize Leaf Blight in Gansu

Abstract To clarify the current situation of mating type composition and genetic structure of Exserohilum turcicum in Gansu province，the specific primers were used to identify the mating type of Exserohilum turcicum collected from different regions of Gansu province，and the tested strains were analyzed for genetic diversity using simple sequence repeat interval amplified polymorphism （ISSR） molecular marker technology. The results showed that there were three mating types of the pathogen in Gansu? province，namely “A” mating type （only containing? ?StMAT1-1 gene） ，“a” mating type （only containing ?StMAT1-2 gene）? and “Aa” mating type （containing both ?StMAT1-1 and ?StMAT1-2 genes），its ratio was about 8∶8∶1. A total of 136 bands were amplified from 24 ISSR primers，with an average of 5.67 bands amplified per primer，including 134 polymorphic bands and a 98.53% proportion of polymorphic bands. PopGen32 software was used to analyze the genetic relationship among the three areas in Gansu，and the genetic distance was less than 0.08; the strains from Longnan had a higher genetic similarity （0.933? 8） with those from Shaanxi; NTSYS-pc software was used to cluster the strains in Longdong area，and it was found that there was no direct relationship between ISSR classification and strain mating type. The results indicated that there was no significant correlation between the genetic group and mating type of the pathogen，while there was a certain correlation with the geographical origin of the strain.

Key words Maize leaf spot pathogen; Mating types; ISSR; Genetic diversity