紫蘇磷脂酸磷酸水解酶基因（ PfPAH1）的鑒定及功能分析

董書言 邢志 尹苗 王堯 周雅莉 黃旭升 王超 王計平 李潤植

摘 要 本文基于紫蘇基因組數據篩選獲得兩條 PfPAH1基因序列，分別命名為 PfPAH1-1和 PfPAH1-2。應用生物信息學工具分析PfPAH1s蛋白理化性質、功能結構域及系統(tǒng)進化。定量PCR（qRT-PCR）檢測 PfPAH1s在紫蘇根、莖、葉、花及不同發(fā)育時期種子的表達譜。進一步克隆到高表達的 PfPAH1-1基因的編碼序列并進行煙草瞬時轉化以鑒定其功能。結果表明， PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因的開放閱讀框（ORF）長度均為2 715 bp，編碼904個氨基酸殘基，含有Lipin_N 、Lipin_mid 和屬于HAD_like超家族的LNS2 三個保守結構域。系統(tǒng)進化分析顯示紫蘇PfPAH1-1蛋白與唇形科植物一串紅的SsPAH1親緣關系最近，其次是葡萄和芥菜。PfPAH1-2蛋白則與唇形科的芝麻SiPAH1親緣關系最近，其次為油橄欖，紫蘇和芝麻均為油料作物，推測PfPAH1-2和SiPAH1可能具有相似功能。qRT-PCR分析表明 PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因均在開花后40 d種子中表達量最高，預示著其可能參與油脂合成積累。煙草瞬時轉化揭示過表達 PfPAH1-1基因煙草葉片總脂肪酸及中性脂含量均高于野生型煙草，然而磷脂含量降低。

關鍵詞 紫蘇；磷脂酸磷酸水解酶；基因克隆；表達特性；煙草瞬時表達

紫蘇（Perilla frutescens （L.） Britt.）屬唇形科紫蘇屬1 a生草本植物，是一種傳統(tǒng)的藥食同源植物，在亞洲東部國家，特別是中國、韓國和日本廣泛種植［1］。 紫蘇種子出油率高達46%～58%，不飽和脂肪酸含量豐富（>種子中總含油量的90%），特別是α-亞麻酸含量（約60.7%）遠高于大豆（5%～13%）、油菜（1%～8%）、玉米? （0.5%～2%）、向日葵? （0.5%～2.0%）等油料作物［2］。極低的ω-6/ω-3 FAs（linoleic acid/alpha-linolenic acid）比率（0.2∶1）使紫蘇油成為人類飲食中植物油的理想來源。此外，紫蘇油還可用于制作干燥油漆、清漆、油墨等［3］。因此，紫蘇作為一種多用途經濟作物，在制藥、食品及工業(yè)等方面具有潛在的應用前景。

植物細胞中，甘油脂合成具有兩條完全獨立的途徑，即真核途徑和原核途徑［4］。磷脂酸（PA，phosphatidic acid）是所有甘油酯從頭合成的共同前體物［5］。PA由甘油-3-磷酸（glycerol-3- phosphate，G3P）途徑合成，在磷脂酸磷酸水解酶（PAP/PAH，phosphatidic acid phosphatase/phosphatidic acid hydrolase）作用下生成二酰甘油（DAG，diacylglycerol）進而合成三酰甘油（TAG，triacylglycerol）［6-7］，或由胞苷二磷酸-二脂酰甘油合酶（CDS，cytidinedi phosphate-diacylglycerol synthase）催化形成胞苷二磷酸-二脂酰甘油（CDP-DAG，cytidinediphosphatediacylglycerol），進一步合成磷脂酰肌醇 （PI，phosphatidylinositol）、磷脂酰甘油（PG，phosphatidylglycerol）和磷脂酰絲氨酸（PS，phosphatidylserine）［4］。此外，PA經 PAP/PAH催化合成的DAG可經核苷酸途徑形成磷脂酰膽堿（PC，phosphatidylcholine）及磷脂酰乙醇胺（PE，phosphatidylethanolamine），也可通過連續(xù)催化反應合成半乳糖脂及硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG，sulfoquinovosyldiacylglycerol）［5］。因此，細胞中的PA及DAG含量的變化能夠影響細胞膜脂質的合成代謝，同時DAG也是連接油脂和膜脂的關鍵節(jié)點，可以直接調節(jié)細胞內油脂、膜脂的? 平衡。

植物中含有多種磷脂酸水解酶異構體，這些酶的代謝功能一直是脂質代謝研究的焦點［7］。PAP作為調控生物體內PA和DAG含量的關鍵酶，根據其催化特性分為PAP1/PAH和PAP2/LPP，其中PAP1包括酵母Pah1p、植物PAH1、PAH2和動物的Lipin 1～3。Reitman［8］研究表明Lipin 1過表達會導致小鼠體內TAG含量升高，體質量增加；Han等［9］指出酵母PAH1與甘油酯合成有關，其 pah1Δ突變體中PA含量高于野生型植株，DAG和TAG含量較野生型減少；Mietkiewska等［10］將擬南芥PAH和油菜PAH在酵母 pah1Δ突變體中表達能夠在突變體酵母中重新合成TAG；Wang等［11］研究發(fā)現擬南芥? Δ pah1 ?pah2雙突變體中PA、PC、PE、PI等磷脂含量較野生型顯著升高，雙半乳糖二脂酰甘油（DGDG）及糖脂單半乳糖二脂酰甘油（MGDG）低于野生型。目前，PAH在酵母中已被純化［12］，動物Lipin也得到較為廣泛的研究［5］，而有關植物PAH的研究報道相對較少。

本研究基于從紫蘇基因組數據庫中鑒定獲得 PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因序列，分析其基本理化性質、結構特點及系統(tǒng)發(fā)育關系等，通過實時熒光定量PCR研究 PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因在紫蘇不同組織中的表達特異性；對表達量較高的 PfPAH1-1基因進行分子克隆，獲得完整編碼的CDS序列，并通過侵染野生煙草（Nicotiana tobaccum，Sumsun NN（SNN））葉片，瞬時表達目的基因，研究過表達 PfPAH1-1基因的煙草脂質組成變化，為深入探討紫蘇 PfPAH1-1基因在脂質代謝中的生物學功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紫蘇及煙草種子由山西農業(yè)大學分子農業(yè)與生物能源研究所保存。于2020年5月將紫蘇種植于山西農業(yè)大學試驗基地，在適宜時期取其根、莖、葉、花及開花后不同發(fā)育時期（開花后10 d、20 d、30 d、40?? d）的種子，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。煙草置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（溫度25 ℃，光照時間16?? h，光照度15 000? lx）。

1.2紫蘇 PfPAH1基因篩選及鑒定

以擬南芥AtPAH1（NP_001118604.1）蛋白序列為檢索序列，利用BioEdit軟件在紫蘇基因組及轉錄組數據庫中進行BLAST同源比對，通過ORF（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）及CDD功能結構域（Conserved Domains Datebase，http：//ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/Wrpsb.cgi）分析比對，篩選獲得紫蘇PAH1基因序列。

1.3 ?PfPAH1基因生物信息學分析

通過GSDS（Gene Structure Display Server，http：//gsds.gao-lab.org/index.php）在線軟件分析紫蘇 PfPAH1基因外顯子、內含子分布情況；利用在線ExPasy網站中的ProtParam工具（http：//web.expasy.org/protgaram）分析 PfPAH1基因編碼蛋白的理化性質；使用在線軟件TMHMM Server v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Signal 4.1（www.cbs.dtu.dk/services/Signal P-4.1/）和PSORTⅡ（https：//psort.hgc.jp/form2.html）對紫蘇PfPAH1蛋白的跨膜區(qū)域、信號肽切割位點及亞細胞定位進行預測；依據SOPMA（http：//npsa- pr abi. ibcp.fr/cgi-bin/nspa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分析PfPAH1蛋白的二級結構；通過在線軟件SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/interactive）對PfPAH1蛋白的三級結構進行預測分析與同源建模；用Jalview軟件將紫蘇 PfPAH1氨基酸序列與其他物種進行多序列比對；運用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法（neighbor-joining，即N-J法）構建紫蘇PfPAH1蛋白與其他物種PAH1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 ?PfPAH1基因的表達特性分析

采用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（RN09，北京艾德萊生物科技有限公司）提取紫蘇根、莖、葉、花及花后不同發(fā)育時期種子的RNA，并用核酸濃度儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度和質量；用StarScript Ⅱ cDNA 第一鏈合成試劑盒（A222-10，北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司）進行反轉錄合成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

利用Primer 5.0設計qRT-PCR特異性引物 PfPAH1-qPCR-F/R（表1）。實時熒光定量PCR以 ?18S rRNA作為內參基因，使用TaKaRa公司的TB Green○R Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試劑盒，通過CFX 96TM Optics Module實時熒光定量PCR儀（BIO-RAD）檢測 PfPAH1基因在紫蘇不同組織器官中的表達模式。反應體系為10?? μL，包含TB Green Premix Ex TaqTM? Ⅱ 5? μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 0.8 μL；反應程序為95 ℃預變性10 min；95 ℃變性5 s，57 ℃退火34 s，共40個循環(huán)，反應結束后升溫至95 ℃進行溶解曲線分析。每個樣品重復3次。

1.5 ?PfPAH1-1基因的克隆

以篩選比對出的 PfPAH1-1基因CDS序列為模板，設計PCR擴增引物 PfPAH1-1-ORF-F/R（表1）。參考TOYOBO公司的KOD-Plus-Neo說明書，使用KOD酶（KOD DNA polymerase）進行PCR擴增。反應體系為50 μL：模板cDNA 2 μL，上下游引物各1.5 μL，10×Pfu Buffer?? 5 μL，dNTP（2 mmol/L）5 μL，MgSO4（25?? mmol/L）2 μL，KOD- Plus-Neo 1 μL，dd H2O?? 32 μL。反應條件為：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min 30 s，循環(huán)35次；68 ℃終延伸10 min。反應結束后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，將檢測正確的產物純化回收并連接到pMD18-T載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)。挑取單克隆進行PCR鑒定篩選陽性克隆，送至北京擎科生物技術有限公司測序。

1.6 植物表達載體構建及煙草瞬時轉化

設計帶有XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點的引物 PfPAH1-1-1303-F和 PfPAH1-1-1303-R（表1），擴增 PfPAH1-1基因目的片段，同時對pCAMBIA1303載體（圖1-A）進行雙酶切。采用Vazyme公司的ClonExpress○R Ultra One Step Cloning Kit克隆得到過表達重組質粒pCAMBIA1303+ PfPAH1-1，將重組質粒轉化到農桿菌中，侵染煙草葉片（圖1-B），于2 d后取部分樣品提取RNA進行RT-PCR檢測，驗證目的基因是否成功轉入，5 d后取剩余樣品真空冷凍干燥備用。

1.7 總脂肪酸含量測定及脂質組成分析

總脂提?。悍Q取50 mg樣品粉末置于50 mL離心管中，加入4 mL甲醇∶氯仿（V∶V，2∶1）混合液，37 ℃抽提4 h，4 000 r/min離心10 min后吸取上清液，并向剩余樣品沉淀中繼續(xù)加入甲醇∶氯仿（V∶V，2∶1）混合液3.5 mL，提取? 2 h，4 000 r/min離心10 min收集上清，再次加入7.5 mL甲醇∶氯仿（V∶V，2∶1）混合液抽提? 12 h，4 000 r/min離心10 min；合并3次所得上清液于干凈的50 mL離心管，加入1％NaCl溶液和氯仿溶液，使得最終氯仿∶甲醇∶水（V∶V∶V）為? 2∶2∶1.8，充分混勻，離心吸取下層有機相至已稱量的玻璃管中。經氮吹儀吹干后稱量管質量，每個樣品3次重復。

總脂肪酸含量=（提取后管質量-提取前管質量）/樣品質量。

脂質分級：以一定體積的氯仿∶甲醇 （V∶V=1∶1）溶解上述已稱量的總脂，利用Cleanert Silica固相萃取小柱（Agela/博納艾杰爾科技有限公司，天津）進行脂質分級。先用1 mL氯仿活化硅膠柱，上樣。用10 mL氯仿洗脫得到中性脂，再用10 mL丙酮洗脫得到糖脂，最后用10 mL甲醇洗脫得到磷脂，收集每一組分于已稱量的玻璃管中，氮吹儀吹干至恒量，計算不同脂類組分含量。

2 結果與分析

2.1 紫蘇 PfPAH1基因的鑒定與結構分析

以擬南芥AtPAH1蛋白序列為檢索序列，在紫蘇基因組及轉錄組數據庫中進行BLAST比對，通過ORF及CDD數據庫進一步分析，篩選獲得2個紫蘇 PfPAH1基因序列，分別命名為 PfPAH1-1和 PfPAH1-2。蛋白質功能結構域預測表明，PfPAH1-1和PfPAH1-2均含有3個保守結構域，分別為Lipin_N結構域、Lipin_mid結構域和屬于HAD_like（haloacid dehalogenase-like）超家族的LNS2結構域（圖2-A）；基因結構分析顯示（圖2-B）， PfPAH1-1基因含有8個內含子和9個外顯子， PfPAH1-2基因含有9個內含子和10個外顯子，與擬南芥和芝麻PAH1基因的內含子、外顯子分布相似。

2.2 紫蘇 PfPAH1基因編碼蛋白的序列特征

通過ProtParam軟件預測分析（表2）表明：紫蘇 PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因編碼氨基酸數為904，編碼蛋白的分子式分別為C4 375H6 819N1 191O1 419S32，分子質量分別為? 10.08? ku和9.98? ku，理論等電點pI 分別為4.73和4.96，二者親疏水性系數均小于0，預測其為親水性水性蛋白質。

采用TMHMM Server v2.0、Signal 4.1軟件對紫蘇PfPAH1蛋白的跨膜區(qū)域及信號肽切割位點進行預測，結果表明（圖3）紫蘇PfPAH1蛋白無跨膜區(qū)域，且無信號肽存在，推測其為非分泌性蛋白。運用SOPMA軟件對PfPAH1蛋白進行二級結構預測，結果顯示：紫蘇PfPAH1-1和PfPAH1-2蛋白的二級結構主要由4種元件組成，PfPAH1-1包含無規(guī)則卷曲56.08%，α-螺旋23.01%，直鏈延伸16.37%，β-轉角4.54%；PfPAH1-2包含無規(guī)則卷曲56.75%，α-螺旋? 22.9%，直鏈延伸15.93%，β-轉角4.42%，推測無規(guī)則卷曲和α-螺旋為PfPAH1蛋白的主要結構元件。

通過SWISS-MODEL數據庫采用同源建模的方法預測紫蘇PfPAH1蛋白三級結構，如圖4所示，選擇6tzy.2［13］蛋白作為模板蛋白進行同源建模，結果顯示：PfPAH1-1、PfPAH1-2蛋白與模板蛋白6tzy.2的序列覆蓋度分別為36.75%和35.05%，保守序列范圍分別為589～876 aa和578～878 aa。PfPAH1蛋白與模板蛋白均由一條多肽鏈（nuclear elongation and deformation protein：A）構成，模板蛋白含有2個CA配體，而PfPAH1-1和PfPAH1-2蛋白僅含有1個CA? 配體。

2.3 PAH1蛋白氨基酸多序列比對及系統(tǒng)進化分析

通過Jalview對紫蘇、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、芝麻（Sesamum indicum）、油橄欖?? （Olea europaea）、一串紅（Salvia splendens）的PAH1蛋白氨基酸序列進行比對（圖5-A）。分析可知，紫蘇PfPAH1蛋白存在已公布植物PAH1蛋白序列中的DXDX（T/V） 催化模體 ［14］，該序列在這些物種中高度保守，由此推斷DXDX（T/V）結構域在PAH1蛋白中發(fā)揮重要功能。利用MEGA 7.0軟件對紫蘇PfPAH1蛋白和擬南芥、芝麻、煙草（Nicotiana tomentosiformis）和油橄欖等植物的PAH1 蛋白構建進化樹，結果如圖5-B所示，紫蘇PfPAH1-1 蛋白與一串紅聚為一支，同屬唇形科植物，與葡萄、芥菜等其他物種關系較遠，其進化基本符合植物進化分類，PfPAH1-2蛋白與芝麻SiPAH1親緣關系最近，其次為油橄欖，與山崳菜屬、辣椒等親緣關系較遠，推測紫蘇 PfPAH1-2基因的功能可能與芝麻SiPAH1基因相似。

2.4 ?PfPAH1基因在紫蘇不同組織中的表達? 特性

由圖6可知，? PfPAH1-1基因在紫蘇根、莖、葉、花及種子中均有表達，根中表達量顯著高于其他組織；該基因表達量在不同發(fā)育時期種子中存在顯著差異，隨著種子的成熟呈現先降低后升高的趨勢，開花后20? d種子中的表達量最低，40? d表達量達到最高，是開花后20 d表達量的3.2倍； PfPAH1-2基因在紫蘇根、莖、葉、花及開花后10 d的種子中幾乎不表達，且隨著種子的成熟表達量逐漸增加，但與 PfPAH1-1基因相比表達均較低。王計平等［15］研究表明，紫蘇種子脂肪酸積累在開花后40 d達到高峰，據此推測 PfPAH1-1基因高表達可能與紫蘇種子脂質合成代謝過程相關。

2.5 ?PfPAH1-1基因的克隆

以紫蘇各組織cDNA 混樣為模板，根據表達量高的 PfPAH1-1基因全長ORF序列設計克隆引物（表1），使用KOD高保真酶進行PCR 擴增，將得到的目的片段經純化、回收后連接到pMD18-T載體上，得到重組質粒pMD18-T+PfPAH1-1，將重組質粒轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)。挑取單克隆進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測在2 000 bp以上得到1條特異性條帶，經測序分析該序列與轉錄組數據結果一致，未發(fā)生突變，表明成功分離得到 PfPAH1-1基因（圖7）。

2.6 植物表達載體的構建及農桿菌轉化

利用XbaⅠ和KpnI對重組質粒pCAMBIA1303+ PfPAH1-1進行雙酶切，以空載作為對照。雙酶切后得到的目的基因條帶，長度大小為2 715 bp，與 PfPAH1-1序列長度大小一致，結果表明，植物表達載體pCAMBIA1303+ PfPAH1-1構建成功（圖8-A）。菌液PCR檢測轉化農桿菌GV3101，在2 715 bp處有目的條帶（圖8-B），表明目的基因 PfPAH1-1成功轉入農桿菌中。

2.7 瞬時表達煙草葉片脂質含量分析

農桿菌瞬時侵染2 d后，取煙草葉片提取總RNA，通過qRT-PCR檢測 PfPAH1-1基因是否有效表達，結果表明（圖9），瞬時轉化后的煙草葉片中目的基因

PfPAH1-1正常轉錄形成 mRNA。

取瞬時侵染5 d后的煙草葉片分析紫蘇 PfPAH1-1基因瞬時表達對煙草葉片各脂質含量的影響。結果如圖10所示，野生煙草（WT）葉片中總脂肪酸占葉片干質量的15.29%，轉 pCAMBIA1303空載（EV）的煙草葉片中總脂肪酸占葉片干質量（DW）的15.30%，而轉 PfPAH1-1基因煙草葉片中總脂肪酸的含量為17.35%（占葉片干質量），總脂肪酸含量顯著上升。分析其脂質組成發(fā)現， PfPAH1-1基因瞬時表達煙草葉片中糖脂含量沒有明顯變化，約占葉片干質量的? 3.55%～3.56%，磷脂含量較WT下降0.3%（占葉片干質量），而中性脂含量提高1.86%（占葉片干質量）。

3 討? 論

紫蘇作為一種多用途經濟作物，因其含有豐富的營養(yǎng)物質及種子含油量和不飽和脂肪酸含量較高，越來越引起國內外學者的廣泛關注，是目前深海魚油的良好替代產品。三酰甘油（TAG）是油料作物種子油脂的主要貯存形式，PAH是TAG合成途徑中的關鍵酶，其介導反應的底物PA是脂核苷酸CDP-DAG合成的直接前體，產物DAG是TAG合成的直接前體，這些脂質中間體的代謝失調是導致脂質性疾病產生的根本［16-17］。有研究表明，PAH 活性依賴于鹵代酸脫鹵酶樣結構域（HAD_like）的DXDX（T/V）催化模體［9，17-18］。釀酒酵母PAH1 DXDX（T/V） 催化模體上的天冬氨酸D398和D400兩個位點同時突變時，其活性將降低99.9%以上［9］。本研究在紫蘇中鑒定獲得兩個編碼904個氨基酸殘基的 PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因，均包含HAD_like 結構域，同時具有PAH 特有的活性位點DXDX（T/V），且序列（DVDGT）與擬南芥、芝麻等已公布的植物相同，表明PfPAH1-1和PfPAH1-2能夠催化其蛋白質功能。序列特征分析表明紫蘇PfPAH1蛋白無轉運肽或跨膜區(qū)域，與Eastmond等［14］和Santos-Rosa等［19］研究結果? 一致。

Zimmermann等［20］分析擬南芥PAH1（At3G09560）基因表達譜顯示， 該基因在擬南芥各組織器官和不同發(fā)育階段種子中均有表達，并在成熟期的種子中表達量達到最高；Eastmond等［14］對擬南芥 [QX（Y15]PAH1的qRT-PCR 分析表明，該基因在幼苗、葉、根、莖、花中都有表達，在不同發(fā)育時期種子中的表達呈先降后升的趨勢，且在成熟種子中的表達量顯著高于其他組織；Nakamura等［21］研究結果表明PAH基因在擬南芥不同發(fā)育時期的花中均有表達。本試驗分析了紫蘇 PfPAH1基因的時空表達模式，表明 PfPAH1-1在紫蘇各組織中均有表達，隨著種子的成熟， PfPAH1-1表達量先下降后升高，在種子發(fā)育前期（開花后20 d）表達量最低，隨后逐漸升高，成熟種子中（開花后40?? d）表達量顯著高于其他時期； PfPAH1-2基因在紫蘇不同組織中表達量均較低。推測在紫蘇脂質合成代謝調控過程中 PfPAH1-1起主導作用，且在發(fā)育中期（開花后? 20 d、30 d）種子中可能更多參與以PA為底物合成PI及PG的反應，而后在TAG及磷脂合成過程中同時發(fā)揮作用［4］。

PAH將PA轉化為DAG以提供磷脂和TAG生物合成的底物，是甘油酯組裝的重要步驟［22］。在釀酒酵母的研究中， pah1Δ突變體中磷脂生物合成相關基因（INO1、INO2、OPI）表達上調，磷脂水平增加，但DAG、TAG水平明顯下降，相反，PAH1的過表達會導致磷脂生物合成基因表達被抑制，磷脂生物合成受到損害，但可有效加強釀酒酵母細胞內的油脂合成［9，19，23-24］；在植物中，擬南芥Δpah1 pah2雙突變體中含有的磷脂是野生型的2倍，編碼磷脂合成的幾種關鍵酶基因均被上調，且總脂肪酸含量降低15%［14，25］。為進一步分析紫蘇 PfPAH1-1基因的功能，本研究通過農桿菌侵染法將目的基因在煙草葉片中瞬時表達，測定瞬時表達后煙草葉片中各脂質組分的含量，結果表明，轉 PfPAH1-1基因煙草葉片中的總脂肪酸含量顯著升高，其脂質組成也有所變化，其中中性脂水平提高，磷脂含量降低，而糖脂含量基本不變。由此推測，紫蘇 PfPAH1-1基因瞬時表達有效加強了TAG合成途徑中磷脂PA向DAG的轉變，中性脂水平升高；而該基因過表達可消耗磷脂合成底物PA，使得磷脂合成過程受阻，降低磷脂含量，結合前人研究結果，這一現象也可能與磷脂合成酶基因表達降低有關。在植物的長期進化過程中，改變膜脂組分是植物適應逆境脅迫的重要途徑［26］。其中，甘油酯是膜脂質的主要成分，膜甘油脂由附著在sn-1和sn-2位置的兩種疏水性脂肪酸及甘油主鏈sn-3位置上的磷（磷脂）或糖（糖脂）分子組成［27］。 PfPAH1-1基因在煙草葉片的瞬時表達可引起煙草葉片中膜脂組分的變化，因此推測其在響應植物逆境脅迫中可能具有一定調控作用。

4 結? 論

以擬南芥AtPAH1蛋白序列為參考序列，鑒定得到2個紫蘇 PfPAH1基因，分別命名為 PfPAH1-1和 PfPAH1-2，對其序列特征和表達特性進行分析。通過RT-PCR技術成功獲得組織中高表達紫蘇 PfPAH1-1基因的cDNA克隆，并初步探討了該基因在煙草中異源表達對煙草脂質組成的影響，為深入研究 PfPAH1-1基因在植物油脂合成積累中的分子機制奠定理論基礎，同時為通過基因工程手段改變紫蘇及其他油料作物的脂質組分提供有益基因元件。

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Identification and Functional Analysis of Phosphatidic Acid

Phosphohydrolase Gene （ PfPAH1） from Perilla frutescens

Abstract This enzymatic process plays an important role in plant lipid metabolism.? In this study，two? PfPAH1 genes （? PfPAH1-1 and? PfPAH1-2） were retrieved from the perilla genome database.Bioinformatics tools were used to analyze the physicochemical properties，functional domains and phylogenetic tree of PfPAH1? proteins.? Quantative PCR （qRT-PCR） was employed to examine the expression profiles of the? PfPAH1 genes? in perilla roots，stems，leaves，flowers and seeds at different development stages. The coding sequence of the highly-expressed? PfPAH1-1 gene was cloned and and further used for transient transformation in tobacco to characterize? PfPAH1-1 function. The results showed that the? open reading frame （ORF） of? PfPAH1-1 and? PfPAH1-2 gene sequences? were 2 715 bp in length，encoding 904 amino acid residues. The PfPAH1 protein contained three conservative domains（ Lipin_N，Lipin_mid and LNS2） the typical characteristics of? the HAD_like superfamily. Phylogenetic tree?? analysis indicated that? PfPAH1-1 protein exhibited the closest genetic relationship with? SsPAH1 from Salvia splendens of Labiatae，followed by PAH1s from Vitis vinifera and Capsella rubella，Similarly，PfPAH1-2 protein demonstrated the closest genetic relationship with? SiPAH1 from Sesamum indicum of Labiatae，followed by PAH1s from Olea europaea and Capsicum annuum. This suggested that? PfPAH1-2 and? ?SiPAH1? genes，which have similar functions，are present in oil crops from the same family. qRT-PCR analysis indicated that the highest expression levels of? PfPAH1-1 and? PfPAH1-2 genes were detected in the developing seeds at 40 days after flowering，suggesting their crucial role in lipid biosynthesis. The evaluation of transiently transformed tobacco plants showed higher contents of total fatty acids and neutral lipids? in the? PfPAH1-1 transgenic leaves compared to wild tobacco leaves，while the content of phospholipids was lower in the transgenics.

Key words Perilla frutescens; Phosphatidic acid phosphohydrolase （PAH1）; Gene cloning; Expression characteristics; Transient expression