液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析花生油中的黃曲霉毒素

黃小小 莫秋云

摘 要：目的：建立一種樣品前處理簡易、快速、成本低的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對花生油樣品中黃曲霉毒素進(jìn)行定量分析。方法：花生油樣品經(jīng)甲醇-水（7∶3）提取，以10 mmol·L-1乙酸銨溶液-甲醇作為流動相進(jìn)行梯度淋洗，采用電噴霧正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測掃描，外標(biāo)法定量。利用所建立的分析方法對樣品進(jìn)行高、中、低3水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，并對實(shí)際樣品中黃曲霉毒素含量進(jìn)行測定。結(jié)果：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.2～10.0 ng·mL-1呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.999 6、0999 5、0.998 8、0.999 7；加標(biāo)回收率在72.5%～102.4%；檢出限分別為0.02 μg·kg-1、0.02 μg·kg-1、0.01 μg·kg-1、0.03 μg·kg-1；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜9.2%，符合國標(biāo)要求。利用該方法對實(shí)際樣品中黃曲霉毒素含量進(jìn)行測定，所得結(jié)果與GB 5009.22—2016中的第一法 同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相近。結(jié)論：該方法在確保準(zhǔn)確度的前提下，具有較好的選擇性和高靈敏度，準(zhǔn)確高效，可用于花生油中黃曲霉毒素的檢測。

關(guān)鍵詞：花生油；黃曲霉毒素；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

Abstract： Objective： To establish a simple， rapid and low-cost liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for quantitative analysis of aflatoxins in peanut oil samples. Method： Peanut oil samples were extracted by methanol-water （7∶3）， and gradient elution was carried out with 10 mmol·L-1 ammonium acetate solution-methanol as mobile phase. Electrospray positive ion mode multiple reaction monitoring scanning was used， and external standard method was used for quantitative analysis. The established analytical method was used to carry out high， medium and low three levels of standard addition experiments on samples， and the content of aflatoxin in actual samples was determined. Result： Aflatoxin B1， B2， G1， G2 showed good linear correlation in the range of 0.2～10.0 ng·mL-1， the correlation coefficients were 0.999 6， 0.999 5， 0.998 8， 0.999 7 respectively. The recovery was 72.5%～102.4%. The detection limits were 0.02 μg·kg-1， 0.02 μg·kg-1， 0.01 μg·kg-1， 0.03 μg·kg-1， respectively. The relative standard deviation was less than 9.2%， which met the requirements of national standard. The method was used to determine the content of aflatoxin in actual samples， and the results were similar to those of the first method of GB 5009.22—2016 isotope dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Conclusion： This method has good selectivity， high sensitivity， accuracy and high efficiency under the premise of ensuring accuracy， and can be used for the detection of aflatoxin in peanut oil.

Keywords： peanut oil; aflatoxins; liquid chromatography-tandem mass spectrometry

黃曲霉毒素是由黃曲霉及寄生曲霉等真菌毒素代謝產(chǎn)生的有毒性物質(zhì)[1-2]。黃曲霉毒素及其代謝產(chǎn)生的衍生物有20多種，其主要由一個呋喃環(huán)和一個香豆素組成。自然界中存在最多的黃曲霉毒素是G1、G2、B1、B2、M1與M2，其中黃曲霉毒素B1毒性最強(qiáng)，是劇毒物質(zhì)氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物[3]。日常生活中，花生及其制品極易被黃曲霉毒素侵染，含量可達(dá)到23～500 μg·kg-1[4]，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）要求花生及其制品中黃曲霉毒素含量不得超過20 μg·kg-1。小作坊榨取的花生油中黃曲霉毒素污染程度普遍偏高，不符合國標(biāo)要求。因此，需要探究更多有效、快速、便捷、準(zhǔn)確的檢測方法，保證花生及其制品的食用安全性，保障消費(fèi)者的身體健康。目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜-柱后衍生法、高效液相色譜-柱前衍生法、酶聯(lián)免疫吸附篩查法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中，前4種檢測方法試劑消耗量大，成本高，操作復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)人員的身體健康危害大，靈敏度低，耗時長，對環(huán)境污染嚴(yán)重，不適宜大批量檢測。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有操作簡便、成本低、對環(huán)境和試驗(yàn)人員友好、效率高等優(yōu)點(diǎn)，通過加標(biāo)回收試驗(yàn)和實(shí)際樣品檢測驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，該方法能實(shí)現(xiàn)對黃曲霉毒素的定性定量檢測，滿足相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2混合標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為1 ?g·mL-1，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；甲醇（HPLC），美國Fisher公司；乙酸銨（GR）；尼龍66針式微孔濾膜，直徑0.22 ?m。

1.2 儀器設(shè)備

LCMS-8030高效液相三重四級桿質(zhì)譜儀，島津公司；Multi Reax型渦旋振蕩器，海道夫（中國上海）；AE-200型1/10 000電子天平，上海合資；Milli-Q Direct16型超純水裝置，電阻率：18.2 MΩ·cm，Millipore。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS（150 mm×2.0 mm，ID）；流動相：A相為10 mmol乙酸銨溶液，B相為甲醇；梯度洗脫：2%→90%B（0.5～5 min），90%B（5～8 min），90%→2%B（8～10 min）；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧正離子源模式；儀器檢測電壓：4.50 kV；DL溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；干燥氣流速：15.00 L·min-1；檢測方式：多離子反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。4種黃曲霉毒素待測物的定性和定量MRM掃描參數(shù)見表1。

1.3.3 樣品處理

稱取5 g（精確至0.000 1 g）花生油于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇水溶液（體積比為7∶3），渦旋混勻后于渦旋振蕩器中振蕩20 min，在4 ℃條件下10 000 r·min-1離心10 min，準(zhǔn)確吸取澄清液1 mL于2 mL離心管中，使用超純水定容至刻度，混勻，以10 000 r·min-1離心5 min，過0.22 μm濾膜，待上機(jī)測試。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（100 ng·mL-1）：準(zhǔn)確移取一定量黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，混勻，密封后-20 ℃下避光，有效期3個月。黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取一定量黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)使用液（100 ng·mL-1）于10 mL容量瓶中，使用空白基質(zhì)溶液逐級稀釋至刻度，混勻，得到濃度分別為0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，過0.22 μm濾膜后，待上機(jī)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

以峰面積為縱坐標(biāo)，黃曲霉毒素濃度為橫坐標(biāo)，繪制線性回歸曲線，并計(jì)算回歸曲線方程及相關(guān)系數(shù)，根據(jù)儀器測出的信噪比，計(jì)算檢出限和定量限。回歸曲線方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。由表2可知，4種黃曲霉毒素的線性關(guān)系良好，檢出限和定量限均滿足相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。圖1為4種黃曲霉毒素對照品（16.0 μg·kg-1）的總離子流色譜圖。

2.2 加標(biāo)回收試驗(yàn)

在花生油陰性樣品中分別添加3種濃度（1.6 μg·kg-1、16.0 μg·kg-1、64.0 μg·kg-1）的黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，參照1.3所建立的儀器方法條件進(jìn)行測定，每份樣品重復(fù)測定6次，計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度（表3）。由表3可知，4種黃曲霉毒素的加標(biāo)回收率在72.5%～102.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.6%～9.2%，說明該方法準(zhǔn)確度和精密度均滿足要求。

2.3 市售樣品測定

采用本文建立的分析檢測方法對市售30種散裝花生油進(jìn)行測定，所得結(jié)果見表4。同時運(yùn)用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）第一法“同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜法”，通過免疫親和柱凈化，采用內(nèi)標(biāo)法對30種散裝花生油樣品進(jìn)行了測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法所得檢測結(jié)果相近，同時驗(yàn)證了本法的可靠性[4-7]?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中規(guī)定花生油中黃曲霉毒素不得超過20 μg·kg-1。由表4可知，30種散裝花生油中黃曲霉毒素檢出率為96.7%，超標(biāo)率為23.3%，合格率僅為76.7%。由此看出，目前市售散裝花生油受黃曲霉毒素污染情況比較嚴(yán)峻，其中黃曲霉毒素B1污染最為突出。這可能是因?yàn)樯⒀b花生油在收購、儲存、加工以及銷售等環(huán)節(jié)衛(wèi)生情況不達(dá)標(biāo)，導(dǎo)致散裝花生油中黃曲霉毒素污染嚴(yán)重。

3 結(jié)論

本研究運(yùn)用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立了同時檢測花生油中4種黃曲霉毒素的方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法能夠?qū)崿F(xiàn)對花生油中4種黃曲霉毒素進(jìn)行準(zhǔn)確快速的定性定量分析，具有快速、簡便、成本低等優(yōu)勢，滿足相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢出限和定量限的要求。

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作者簡介：黃小?。?987—），女，瑤族，廣西賀州人，碩士，主管技師。研究方向：理化檢驗(yàn)。

通信作者：莫秋云（1989—），女，廣西賀州人，碩士，工程師。研究方向：食品安全檢驗(yàn)檢測。E-mail：27411896767@qq.com。