不同醇化時(shí)間對(duì)片煙原料附生細(xì)菌種群多樣性及質(zhì)量的影響

崔鈺杰 鄒克興 陳義昌 劉領(lǐng) 王小東 梁偉

關(guān)鍵詞：醇化時(shí)間：片煙原料：高通量測(cè)序：多樣性分析：質(zhì)量分析

煙草作為我國(guó)重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)作物，其栽種面積大，年產(chǎn)量高。我國(guó)既有龐大的煙草消費(fèi)市場(chǎng)，又擁有著眾多的吸食煙草群體。隨著煙草質(zhì)量的提升和生產(chǎn)技術(shù)的革新，吸食者對(duì)煙草的品質(zhì)有了新的需求，如吸食過(guò)程中煙葉香味醇厚、吃味更好、青雜氣減少等方面，“醇化”是業(yè)內(nèi)公認(rèn)的提升煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。通過(guò)醇化，可使煙葉顏色逐漸加深并更加均勻，進(jìn)而提升香氣物質(zhì)，使吸食味道醇和。煙葉醇化分為人工醇化和自然醇化兩種，人工醇化速度快但醇化效果較差；自然醇化效果較好，但醇化周期長(zhǎng)，煙葉長(zhǎng)期與外界環(huán)境密切接觸易導(dǎo)致霉變生蟲(chóng)。針對(duì)以上兩種醇化方式存在的弊端，煙草研究者利用優(yōu)勢(shì)微生物對(duì)片煙進(jìn)行醇化，既能提高醇化效果，又能夠降解煙葉中的有害成分、提升煙葉品質(zhì)，為煙草醇化提供了新的技術(shù)方式。

近年來(lái)，高通量基因測(cè)序技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域，通過(guò)高通量測(cè)序能夠快速篩選出煙葉中的優(yōu)勢(shì)微生物種群并對(duì)其進(jìn)行一系列分析。基于此，本研究以廣西百色、湖南郴州兩地區(qū)分別醇化0、12、24、36個(gè)月的中部片煙（C3F）為試驗(yàn)材料，利用高通量基因測(cè)序技術(shù)對(duì)片煙原料進(jìn)行附生細(xì)菌多樣性分析和化學(xué)成分分析．篩選出優(yōu)勢(shì)菌群，從而可為片煙醇化復(fù)配微生物制劑提供物種信息，又可為煙葉最佳醇化時(shí)間的選擇提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試片煙為廣西百色（廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供）、湖南郴州產(chǎn)地的片煙原料，煙葉等級(jí)均為C3F。樣品名稱(chēng)、煙葉產(chǎn)地等信息如表1所示。片煙貯存?zhèn)}庫(kù)溫度32℃，濕度66%。

1.2樣品采集

對(duì)廣西百色、湖南郴州兩地區(qū)分別醇化0、12、24、36個(gè)月的復(fù)烤片煙原料單獨(dú)進(jìn)行取樣，每包片煙3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，依次裝至干燥無(wú)污染的塑封袋保存待測(cè)。

1.3高通量測(cè)序及分析

高通量測(cè)序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，測(cè)序獲得ASV（Amplicon Sequence Va-riant）豐度信息，通過(guò)ASV代表序列豐度信息，利用美吉生物云平臺(tái)（https：//www. majorbio. com）對(duì)其進(jìn)行微生物群落多樣性分析、差異分析、功能分析等。

1.4片煙化學(xué)質(zhì)量分析

片煙化學(xué)質(zhì)量采用AntarisⅡ傅立葉近紅外光譜分析儀（賽默飛世爾科技公司，美國(guó)）進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同醇化時(shí)間片煙原料細(xì)菌多樣性分析

對(duì)廣西百色、湖南郴州的片煙進(jìn)行微生物多樣性指數(shù)分析，按照最小抽平數(shù)進(jìn)行抽平，覆蓋率達(dá)到99%以上。由表2可以看出，YO片煙的群落豐富度（Sobs、Ace、Chao）指數(shù)和群落多樣性（Shannon）指數(shù)都高于其他3個(gè)處理，Y2片煙的群落豐富度和群落多樣性指數(shù)最低，表明YO片煙中微生物群落豐富度和多樣性最高。

隨機(jī)抽取樣品測(cè)序數(shù)達(dá)26000，能較好地反映樣本中的微生物多樣性情況。如圖1所示，Sobs指數(shù)和Shannon指數(shù)曲線(xiàn)均達(dá)到平穩(wěn)，且均以YO處理最高；當(dāng)隨機(jī)抽取測(cè)序數(shù)達(dá)20000時(shí)，YO處理的Sobs指數(shù)最高，為350，其次是Y3，指數(shù)為215;YI指數(shù)為200，最低的為Y2，為155;當(dāng)隨機(jī)抽取測(cè)序數(shù)達(dá)到12000時(shí)．Shannon指數(shù)YO在四個(gè)樣本中最高，達(dá)到4；Y1、Y3的指數(shù)分別為3.4、2.9，Y2的指數(shù)最低，為2.4。以上結(jié)論表明，YO片煙的微生物群落豐富度和多樣性更高。

2.2不同醇化時(shí)間片煙原料細(xì)菌群落組成分析

不同醇化時(shí)間片煙原料細(xì)菌共鑒定出28個(gè)門(mén)、548個(gè)屬。在門(mén)水平上（圖2），變形菌門(mén)（Pro-teobacteria）的相對(duì)豐度最高，達(dá)到0.8以上，在廣西百色和湖南郴州的樣本中均為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其次是厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteri-ota）。

在屬水平上（圖3），假單胞菌屬（Pseudo-monas）在所有樣本中相對(duì)豐度均較高，部分達(dá)到0.6左右，其次為未分類(lèi)產(chǎn)菌科屬（unclassified_f_Alcaligenaceae）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、黃色單胞菌屬（Xan-thomonas）、代爾夫特屬（Delftia）、水生微生物屬（Aquamicrobium）；未分類(lèi)傘形孢科屬（unclassified_f_Xanthomonadaceae）、紅球菌屬（Esherichia-Shigel-la）、腸桿菌屬（unclassified_f_Bacillaceae）、芽孢桿菌屬（Noviherbaspirillum）相對(duì)豐度較低。以上結(jié)果表明廣西百色和湖南郴州兩地的片煙微生物群落組成較為相似，微生物群落較豐富。

不同醇化時(shí)間片煙原料細(xì)菌物種數(shù)Venn圖見(jiàn)圖4。在門(mén)水平上（圖4A），四個(gè)處理共有的菌門(mén)數(shù)為11個(gè)，Y3處理特有菌門(mén)數(shù)最多，有6個(gè)，其次為Y1和Y2處理，分別有3個(gè)和2個(gè)，YO處理無(wú)特有菌門(mén)。在屬水平上（圖4B），4個(gè)處理共有的菌屬數(shù)量為111個(gè)，其中Y3處理特有屬數(shù)目最多，為97個(gè)，其次為YO和Y1處理，分別有60個(gè)和47個(gè)，Y2處理最少，為38個(gè)。結(jié)果表明，在不同的分類(lèi)學(xué)水平下，每個(gè)處理特有類(lèi)群的數(shù)量不同，表明試驗(yàn)樣本微生物群落的多樣性較高。

2.3不同醇化時(shí)間片煙原料細(xì)菌屬水平差異分析

圖5為屬水平細(xì)菌物種差異比較分析，按最小抽平數(shù)抽平。其中，鞘氨醇單胞菌屬、迪凱亞屬（Diclceya）、馬西利亞屬（Massilia）3個(gè)菌屬不同處理間呈顯著性差異（P<0.05），Y0處理中上述3個(gè)屬平均占比均最高，分別為7.41%、3.49%、1.21%；腸桿菌屬（Enterobacter）和未分類(lèi)的腸桿菌科（unclassified_f_Enterobacteriaceae）呈極顯著差異（P<0.01），YO處理片煙樣本中上述兩個(gè)類(lèi)群占比均最高，分別為4.28%、3.22%。

2.4不同醇化時(shí)間片煙原料微生物功能分析

采用FAPROTAX人工構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)片煙樣本微生物進(jìn)行功能分析，共鑒定出21個(gè)功能分組。如圖6所示，化學(xué)異養(yǎng)（chemoheterotrophy）、好氧化學(xué)異養(yǎng)（aerobic chemoheterotrophy）、暗氧化硫化合物（dark oxidation of sulfur compounds）、暗硫化物氧化（dark sulfide oxidation）、硝酸鹽還原（nitrate reduction）、硝酸鹽呼吸（nitrate respira-tion）、氮呼吸（nitrogen respiration）7個(gè)功能在所有樣本中表達(dá)功能均較豐富；錳氧化（manganeseoxidation）、木聚糖分解（xylanolysis）、亞硝酸鹽呼吸（nitrite respiration）、氮?dú)夤潭ǎ╪itrogen-fixa-tion）4個(gè)功能偏弱但在所有試驗(yàn)樣本中普遍存在。

微生物群落FAPROTAX功能差異檢驗(yàn)（圖7）顯示，化學(xué)異養(yǎng)、好氧化學(xué)異養(yǎng)功能占比達(dá)到35%以上；暗氧化硫化合物、暗硫化物氧化、硝酸鹽還原功能占比5%以上，其他功能在所有樣品中也少量存在；發(fā)酵功能（fermentation）、動(dòng)物寄生蟲(chóng)或共生體（animal parasites or symbionts）、人類(lèi)腸道（human gut）、哺乳動(dòng)物腸道（mammal gut）4個(gè)功能在各處里間呈極顯著差異（P<0.01），Y0樣本的占比最高，均在5%以上。所鑒定試驗(yàn)樣品在功能上呈現(xiàn)多樣性的態(tài)勢(shì)，廣西百色和湖南郴州兩地區(qū)的片煙在微生物功能構(gòu)成上也較為相似。

2.5不同醇化時(shí)間對(duì)片煙原料微生物化學(xué)質(zhì)量的影響

表3可知，湖南郴州Y1處理片煙的總糖和還原糖含量均最高，分別為22.30%和19.70%，廣西百色Y3的總糖和還原糖含量最高，分別為24.40%和21.30%；在煙堿含量中，湖南郴州Y2最高，Y1最低，分別為3.08%和2.21%，廣西百色Y2最高，Y0最低，分別為為2.94%和為2.01%：在總氮含量中，湖南郴州Y2最高，Y1最低，分別為2.28%和1.90%，廣西百色Y1最高，Y3最低，分別為2.16%和1.80%：在鉀含量中，湖南郴州Y1最高，YO最低，分別為3.24%和2.95%，廣西百色Y3最高，Y2最低，分別為3.14%和2.50%；在氯含量中，湖南郴州YO最高，Y3最低，分別為0.67%和0.49%，廣西百色Y3最高，Y2最低，分別為0.61%和0.49%；在淀粉含量中，湖南郴州Y1最高，Y2最低，分別為4.22%和3.71%，廣西百色YO最高，Y2最低，分別為4.75%和3.42%。

上述結(jié)果表明，不同地區(qū)、不同醇化年限的片煙，附生微生物對(duì)煙葉化學(xué)品質(zhì)產(chǎn)生了影響：隨著醇化時(shí)間的延長(zhǎng)，片煙內(nèi)部微生物種群結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，與煙葉的各個(gè)有機(jī)成分發(fā)生反應(yīng)進(jìn)而提升了相應(yīng)化學(xué)成分的含量。

3討論與結(jié)論

微生物通過(guò)一系列降解反應(yīng)產(chǎn)生出有益的小分子物質(zhì)，可以加快煙葉中有害成分的分解，進(jìn)而改善煙葉品質(zhì)，以達(dá)到增香的目的。本研究以廣西百色、湖南郴州片煙原料為材料進(jìn)行微生物多樣性分析和化學(xué)質(zhì)量分析，通過(guò)高通量基因測(cè)序得出兩地片煙細(xì)菌物種非常豐富，且種群構(gòu)成相似，這與牟丹等的研究結(jié)果一致：在門(mén)水平上主要以變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，在屬分類(lèi)學(xué)水平主要以假單胞菌屬、未分類(lèi)產(chǎn)菌科屬、硫桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、黃色單胞菌屬、代爾夫特屬、水生微生物屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，這與Su、田麗君、周家喜等的研究結(jié)果一致。

醇化煙葉表面微生物可使煙葉內(nèi)多種物質(zhì)迅速發(fā)生分解、降解、氧化等反應(yīng)，生成醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、酸類(lèi)和新植二烯等香氣成分物質(zhì)。除此之外，還有發(fā)酵功能、人體病原、動(dòng)物寄生等類(lèi)群，表明細(xì)菌通過(guò)多種途徑獲益于自身并作用于煙葉。廣西百色、湖南郴州地區(qū)的片煙細(xì)菌微生物群落構(gòu)成較復(fù)雜，其中化學(xué)異養(yǎng)功能在所有測(cè)試樣本中占比均較高，有助于煙葉中有機(jī)質(zhì)的降解；相對(duì)豐度較高的變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)及假單胞菌屬、硫桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬等都可以降解有機(jī)物，這與趙銘欽等關(guān)于烤煙葉面增香機(jī)制的研究論述較為相似。目前，煙草微生物的應(yīng)用大多集中在病蟲(chóng)害防治和有害成分降解等方面，在普洱茶、雪茄煙以及辣椒醬等發(fā)酵領(lǐng)域的研究也較多，如劉琨毅等研究表明，地衣芽孢桿菌與其他微生物協(xié)同作用對(duì)普洱茶的感官品質(zhì)有一定的提升作用：劉穎等對(duì)韶關(guān)和衡陽(yáng)地區(qū)自然發(fā)酵辣椒的研究顯示，厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，假單胞菌屬和泛菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，功能以代謝為主，包括碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝、核苷酸代謝等；葉長(zhǎng)文等研究發(fā)現(xiàn)雪茄煙中優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)和子囊菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌屬為葡萄球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、假單胞菌屬和曲霉屬；劉筱雪等以四川懷遠(yuǎn)特色發(fā)酵食品為材料研究發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)和子囊菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，這可能與當(dāng)?shù)貧夂虍a(chǎn)生大量的有益微生物有一定的關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)，鞘氨醇單胞菌屬和腸桿菌屬在功能性上作用更加突出，其中，鞘氨醇單胞菌屬在生物降解和生物質(zhì)合成方面發(fā)揮著重要作用，在環(huán)境、農(nóng)業(yè)、食品及工業(yè)生產(chǎn)等諸多領(lǐng)域具有廣泛的市場(chǎng)應(yīng)用價(jià)值：腸桿菌屬為革蘭氏陰性益生菌，因其對(duì)腸道疾病有顯著的緩解效果而被廣泛用到臨床治療中，可以有效預(yù)防和治療由病原菌引起的胃腸道疾病，如炎癥性腸?。↖BD），起到調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道穩(wěn)定和體內(nèi)平衡的作用。此外，對(duì)片煙化學(xué)質(zhì)量的分析結(jié)果顯示，隨著醇化時(shí)間的延長(zhǎng)，片煙附生優(yōu)勢(shì)菌群沒(méi)有失活反而可能與有機(jī)成分發(fā)生反應(yīng)，提升煙葉質(zhì)量，這與黃申、胡婉蓉、楊麗平等利用微生物菌劑或單一微生物作用于煙葉提升品質(zhì)的研究結(jié)果基本一致。

綜上，廣西百色、湖南郴州兩地區(qū)片煙原料細(xì)菌物種豐富，菌群組成相似，變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)；假單胞菌屬、未分類(lèi)產(chǎn)菌科屬、硫桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、黃色單胞菌屬、代爾夫特屬、水生微生物屬為優(yōu)勢(shì)菌屬。物種差異分析和功能分析均呈現(xiàn)顯著差異。在片煙化學(xué)質(zhì)量分析中得出，隨著醇化時(shí)間的延長(zhǎng)微生物菌種不斷地和有機(jī)成分發(fā)生反應(yīng)進(jìn)而使煙葉成分得到了優(yōu)化提升。該研究結(jié)果可為進(jìn)一步選用優(yōu)勢(shì)菌群復(fù)配微生物制劑提供物種信息，為片煙最佳醇化時(shí)間的選擇提供依據(jù)。