白藜蘆醇調(diào)控蘋果響應(yīng)輪紋病的差異表達(dá)基因分析

張洋紅 李爽 陳昊偉 李佳 徐繼忠

關(guān)鍵詞：蘋果輪紋?。喊邹继J醇；轉(zhuǎn)錄組；差異表達(dá)基因

蘋果屬于薔薇科蘋果屬，是我國主要的栽培果樹之一，同時(shí)，我國也是蘋果的原生地之一，在蘋果屬35個(gè)種中，有24個(gè)種原生于我國。我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)和消費(fèi)國，蘋果種植面積和產(chǎn)量均超過世界總量的50%，但出口量極低，僅占2.5%。而影響蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害之一就是蘋果輪紋?。╝pple ring rot），該病危害果實(shí)和枝干，嚴(yán)重時(shí)甚至造成幼樹枯死等，嚴(yán)重制約我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前對(duì)蘋果輪紋病的防治主要以化學(xué)防治為主，但大量使用化學(xué)農(nóng)藥，容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且危害人體健康和環(huán)境。因此，需要在研究蘋果抗病機(jī)制的基礎(chǔ)上，挖掘抗病基因，選育抗病品種，開發(fā)植物源藥劑，以對(duì)蘋果輪紋病進(jìn)行綜合防治。

白藜蘆醇（resveratrol）是一種天然多酚類物質(zhì)，是植物體在抵御惡劣環(huán)境或病原侵害時(shí)分泌的一種抗毒素，主要存在于葡萄、花生和虎杖等植物中。目前，白藜蘆醇在蘋果輪紋病防治方面的研究尚未見報(bào)道，但在其它植物病原防治方面的研究已有報(bào)道。研究表明，白藜蘆醇可以抑制葡萄上灰霉菌、根霉菌、擬莖點(diǎn)霉等病原真菌的生長，對(duì)番茄早疫病菌、灰霉病菌、霉心病菌、炭疽病菌以及石榴果實(shí)黑斑病菌的菌絲生長也具有抑制作用，還對(duì)楊樹煙炭病菌、穿孔病菌、潰瘍病菌以及草莓病原真菌（灰葡萄孢菌、膠孢炭疽菌、立枯絲核菌）具有不同程度的抑制作用：白藜蘆醇處理碭山酥梨不僅具有一定的保鮮作用，還能顯著延緩碭山酥梨貨架期黑皮病的發(fā)生。此外，白藜蘆醇作為植物代謝中的次生代謝產(chǎn)物，其合成與苯丙氨酸代謝途徑密切相關(guān)，而苯丙氨酸代謝途徑參與木質(zhì)素、黃酮類、香豆素和芪類化合物等物質(zhì)的合成，其中，木質(zhì)素是植物組織的重要組成成分，可以保護(hù)植物免受各種致病菌的侵害。

轉(zhuǎn)錄組是指特定細(xì)胞或組織中的全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，目前，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于研究植物細(xì)胞對(duì)致病菌的脅迫應(yīng)答和病原菌的致病機(jī)理等方面。在蘋果輪紋病相關(guān)研究中，洪坤奇等在蘋果輪紋病菌侵染蘋果枝條階段的轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，與水解酶和果膠酶活性相關(guān)的基因以及與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白翻譯和糖類代謝相關(guān)的基因差異表達(dá)變化顯著；水楊酸（SA）誘導(dǎo)處理蘋果輪紋病不同抗性品種后的轉(zhuǎn)錄組表明，抗性品種的差異基因數(shù)量多，表明抗病品種的抗性相關(guān)基因更易受到SA的誘導(dǎo)。本研究通過對(duì)抗、感材料外源施加白藜蘆醇后針刺法接種蘋果輪紋病菌，觀察病斑大小的變化，并將0h和96h的樣品進(jìn)行RNA-Seq測序分析，利用高通量測序技術(shù)探究白藜蘆醇處理并接種輪紋病菌后不同抗性材料的基因表達(dá)變化情況，以期為深入探究白藜蘆醇調(diào)控蘋果抗輪紋病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

抗病株系1-1-46和感病株系1-1-40，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果課題組從“雞冠”和“富士”的雜交后代中選出。2017年將兩種抗性株系分別嫁接于平邑甜茶上，常規(guī)管理。

1.2試驗(yàn)方法

分別選取抗、感材料當(dāng)年生春梢頂端第5～7片完全展開的葉片，用500ug/mL白藜蘆醇浸泡30min（Res處理），以蒸餾水浸泡為對(duì)照（CK）；待葉片表面水分自然晾干后進(jìn)行針刺法接種蘋果輪紋病菌，接菌方法參照韓林林的方法：觀察病斑的變化，并選取接種0h和96h抗、感材料的Res處理和CK樣品用于RNA-seq分析，每處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共24份樣品。由北京百邁客生物科技有限公司完成測序。

1.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析

1.3.1轉(zhuǎn)錄組測序用NanoDrop2000分光光度計(jì)檢測RNA的純度和濃度，用Agient2100/Lab-Chip GX精確檢測RNA的完整性；用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；加入Fragmen-tation Buffer將mRNA隨機(jī)打斷：以mRNA為模板，合成第一條cDNA鏈及二鏈，并進(jìn)行cDNA純化；純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇，最后通過PCR富集得到cDNA文庫；之后進(jìn)行文庫質(zhì)控，再使用Illumina NovaSeq6000測序平臺(tái)進(jìn)行PE150模式測序，測序工作由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.3.2與蘋果參考基因組比對(duì)及基因功能注釋

利用HISAT2將clean reads與蘋果參考基因組（https：//iris. angers. inra. fr/gddh13/the-apple-ge-nome-downloads.html）進(jìn)行比對(duì)得到Mapped Data后，進(jìn)行文庫質(zhì)量評(píng)估、差異表達(dá)分析、基因功能注釋等。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，從差異基因數(shù)據(jù)庫選取9個(gè)基因，并利用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物（表1），分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果是否與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。

2結(jié)果與分析

2.1白藜蘆醇處理后葉片接種輪紋病菌的病斑大小變化

由圖1可知，對(duì)照處理下，抗、感材料葉片接菌后，隨時(shí)間推移，病斑面積逐漸增大，其中感病材料1-1-40的病斑面積增長較快。接菌72h后感病材料的病斑面積顯著大于抗病材料，接菌144h時(shí)感病材料1-1-40的病斑面積為19.07mm2，顯著高于抗病材料1-1-46的病斑面積（9.81mm2）。

抗、感材料經(jīng)白藜蘆醇處理后，接種輪紋病菌96～144h的病斑面積顯著低于對(duì)照，均表現(xiàn)為抗病材料的病斑面積顯著低于感病材料；144h時(shí)，感病材料1-1-40的病斑面積為17.04mm2，抗病材料1-1-46的病斑面積為6.41mm2。

2.2轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

經(jīng)測序質(zhì)量控制，對(duì)白藜蘆醇和對(duì)照處理后接菌0h和96h的24個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共獲得173.80Gb Clean Data，各樣品CleanData均達(dá)到6.05Gb，GC含量在46.07%～47.46%之間．Q20和Q30值分別在98.13%及以上和90.67%及以上（表2）。說明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可滿足后續(xù)分析。

2.3差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)

以log2（Fold change）≥2且FDR（False Dis-covery Rate）<0.01作為篩選條件，對(duì)白藜蘆醇處理后抗、感材料接種輪紋病菌Oh和96 h的差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行分析，結(jié)果（表3）顯示，感病材料1-1-40經(jīng)白藜蘆醇處理后接菌0h時(shí)（CKl_vs_T1）共有443個(gè)DEGs，其中上調(diào)表達(dá)的有1 84個(gè)，下調(diào)表達(dá)的有259個(gè)；抗病材料1-1-46經(jīng)白藜蘆醇處理后接菌Oh時(shí)（CK2-vs-T2）共有1855個(gè)基因差異表達(dá)，其中1240個(gè)上調(diào)表達(dá)，615個(gè)下調(diào)表達(dá)；感病材料經(jīng)白藜蘆醇處理后接菌96h時(shí)（T3-vs-T5）共有1596個(gè)DEGs，其中455個(gè)上調(diào)表達(dá)，1141個(gè)下調(diào)表達(dá)：抗病材料經(jīng)白藜蘆醇處理后接菌96h時(shí)（T4-vs=T6）共有2683個(gè)DEGs，其中1391個(gè)上調(diào)表達(dá)，1292個(gè)下調(diào)表達(dá)。

綜合來看，白藜蘆醇處理后，抗、感試材中的DEGs均是接菌96h的多于0h的，抗病材料的DEGs多于感病材料的：抗病材料中上調(diào)表達(dá)的基因多于下調(diào)表達(dá)的基因，而感病材料中則相反，下調(diào)表達(dá)的基因更多。說明抗病材料經(jīng)白藜蘆醇處理并接種蘋果輪紋病菌后葉片內(nèi)的基因表達(dá)模式變化比較激烈，而感病材料的變化則相對(duì)溫和且以下調(diào)表達(dá)的基因較多。

進(jìn)一步利用Venn圖比較4個(gè)組的DEGs．由圖2可知，對(duì)于上調(diào)表達(dá)的基因，在接菌Oh時(shí)，有105個(gè)僅在感病材料中特異表達(dá)，有909個(gè)僅在抗病材料中特異表達(dá)：接菌96h時(shí)，有292個(gè)僅在感病材料中特異表達(dá)，有1060個(gè)僅在抗病材料中特異表達(dá)。對(duì)于下調(diào)基因，接菌Oh時(shí)，有157個(gè)僅在感病材料中特異表達(dá)，有431個(gè)僅在抗病材料中特異表；接菌96h時(shí)，有894個(gè)僅在感病材料中特異表達(dá)，有1107個(gè)僅在抗病材料中特異表達(dá)。進(jìn)一步說明抗病材料應(yīng)對(duì)病菌侵染的基因表達(dá)模式較多。

2.4差異表達(dá)基因的GO功能注釋

由表4可見，比較組CKl_vs_T1中的DEGs有373個(gè)注釋到生物過程，518個(gè)注釋到細(xì)胞成分，375個(gè)注釋到分子功能；CK2-vs-T2中的DEGs有1670個(gè)注釋到生物過程，有1961個(gè)注釋到細(xì)胞成分，有1648個(gè)注釋到分子功能；T3_vs_T5中的DEGs有1531個(gè)注釋到生物過程，有1888個(gè)注釋到細(xì)胞成分，有1467個(gè)注釋到分子功能：T4_vs_T6中的DEGs有2612個(gè)注釋到生物過程，有3082個(gè)注釋到細(xì)胞成分，有2406個(gè)注釋到分子功能。綜合來看，4個(gè)比較組中的DEGs均以注釋到分子功能中的結(jié)合能力和催化活性中的最多。

2.5差異表達(dá)基因KEGG通路富集分析

為進(jìn)一步分析白藜蘆醇處理后蘋果輪紋病抗、感材料的DEGs在代謝通路中的功能，進(jìn)行KEGG Pathway富集分析，結(jié)果（表5）顯示，在P<0.05的情況下，抗病材料比較組間DEGs富集的代謝通路多于感病材料，接菌96h的DEGs富集到的通路多于0h的。

接菌0h，感病材料CK1_vs_T1富集的通路只有3條，富集到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hor-mone signal transduction，k004075）途徑的基因數(shù)最多，為16個(gè)，其次是糖酵解／糖異生（glycolysis/gluconeogenesis，k000010）和花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism，k000590）途徑，分別有7個(gè)和3個(gè)基因；而抗病材料CK2-vs-T2富集到13個(gè)通路，富集到植物一病原互作（plant-patho-gen interaction，k004626）途徑的基因最多，為127個(gè)，其次是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)通路一植物（MAPK signaling

pathway-plant，k004016）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism，k000500）、苯丙素生物合成途徑（phenylpropanoid bi-osynthesis，k000940）。接菌96h，感病材料T3_vs_T5富集到6個(gè)通路，富集到植物一病原互作途徑的DEGs最多，為131個(gè)，其次是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)通路一植物、淀粉和蔗糖的代謝等途徑；抗病材料T4-vs-T6富集到14個(gè)代謝通路，同樣是富集到植物一病原互作途徑的DEGs最多，為138個(gè)。

綜合來看，富集到植物一病原互作通路的DEGs最多，其次是植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)通路一植物、淀粉和蔗糖代謝等通路。此外，抗病材料的比較組還富集到了與木質(zhì)素合成相關(guān)的苯丙素生物合成途徑，分別有39個(gè)和75個(gè)基因。

2.6轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗(yàn)證

為進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，從涉及的主要代謝通路中挑選出9個(gè)變化明顯的差異基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，分別是與植物一病原互作相關(guān)的基因MD14G1077700、MD14G1170900、MD10G1286300、MD10G1333100和與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因

MD03G1273300、MD15G1225800、MD16G1178100、MD02G1165500、MD09G1042400。結(jié)果如圖3所示，圖中柱形為轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，折線為qRT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。可見，兩種數(shù)據(jù)雖在差異倍數(shù)上存在差異，但總體趨勢相同，表明該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)確切、可靠。

3討論與結(jié)論

天然的白藜蘆醇在植物遭到病原菌侵害時(shí)產(chǎn)生，對(duì)多種病原真菌具有顯著的抗菌作用，同時(shí)被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化和抗癌等作用。有研究表明，白藜蘆醇和嘧霉胺聯(lián)合使用，對(duì)葡萄灰霉病具有協(xié)同抗性，可抑制菌絲生長和分生孢子萌發(fā)。經(jīng)白藜蘆醇處理后的番茄葉片再接種早疫病菌，葉片病斑面積顯著小于對(duì)照，且隨白藜蘆醇濃度的增大病斑面積逐漸減小，說明白藜蘆醇可以在一定程度上保護(hù)番茄葉片免遭早疫病菌的侵害。Schulze等研究表明白藜蘆醇對(duì)蘋果黑星病菌孢子萌發(fā)無抑制作用，但能抑制其孢子的入侵，提高蘋果葉片對(duì)黑星病菌的抵抗力。本研究用500ug/mL白藜蘆醇處理蘋果輪紋病抗、感材料的葉片后再接種輪紋病菌，相比于對(duì)照，病斑面積均減小，說明白藜蘆醇對(duì)葉片起到一定的保護(hù)作用。

植物激素是植物體內(nèi)合成的微量有機(jī)物，對(duì)其抗病性和生長發(fā)育具有顯著作用。有研究表明，植物可以利用體內(nèi)激素間的協(xié)同作用抵御病原菌的入侵。本研究中KEGG代謝通路的分析結(jié)果顯示，蘋果輪紋病抗、感材料中富集在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的DEGs較多，抗病材料比較組接菌0h和96h富集到該途徑的DEGs分別為127個(gè)和138個(gè)，而感病材料0h和96h富集到該途徑的DEGs分別為16個(gè)和131個(gè)，說明抗病材料體內(nèi)有豐富的抗性系統(tǒng)，可在病原菌侵染后立刻做出反應(yīng)，而感病材料反應(yīng)相對(duì)緩慢。

苯丙烷代謝途徑在植物的抗病系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，其產(chǎn)物木質(zhì)素、類黃酮和植保素等是植物抗逆防御反應(yīng)不可或缺的，對(duì)真菌和細(xì)菌具有抑制活性。類黃酮可以提高植物自身的防御能力，如激活水楊酸、脫落酸等逆境響應(yīng)激素的信號(hào)通路，以應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的刺激，提高植物的抗病性。本研究中白藜蘆醇處理后蘋果輪紋病抗性材料中DEGs在苯丙素和類黃酮生物合成途徑也有顯著富集，而感病材料中沒有，因此推測苯丙素和類黃酮生物合成途徑與蘋果輪紋病抗性相關(guān)。此外，有研究表明，部分ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白影響病原真菌的致病力，葡萄孢菌中已克隆了14個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且已證實(shí)其中Bcatr B、Bcatr D和Bcatr K 3個(gè)蛋白與多藥抗性有關(guān)。而本研究中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白途徑也在抗病材料中被顯著富集。

遭受病原菌侵染時(shí)，不同植物的反應(yīng)機(jī)制不同。類鈣調(diào)蛋白（calmodulin-like protein，CML）是植物細(xì)胞中的鈣離子結(jié)合蛋白，在植物生長發(fā)育和逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要功能，主要通過調(diào)節(jié)各類靶點(diǎn)而在細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而響應(yīng)植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)和系統(tǒng)發(fā)育。本研究中，在植物一病原互作途徑發(fā)現(xiàn)多個(gè)CML基因（CML42、CML49、CML36、CML50），在抗病材料中，與對(duì)照相比，白藜蘆醇處理后除CML50呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)趨勢外，其他均呈顯著上調(diào)表達(dá)趨勢：而在感病材料中，這些基因的表達(dá)變化并不明顯，說明在抗病材料中Ca2+信號(hào)被激活，也參與了蘋果輪紋病菌入侵信號(hào)調(diào)控的抗病反應(yīng)。

綜上所述，白藜蘆醇處理能顯著降低蘋果輪紋病抗、感材料葉片接菌96～144h的病斑面積；白藜蘆醇處理后抗病材料各比較組的DEGs及其富集的代謝通路均多于感病材料。白藜蘆醇能在一定程度上提高蘋果的輪紋病菌抗性。