乳腺癌組織lncRNA CASC2、miR-532-3p表達(dá)水平與患者術(shù)后5年內(nèi)生存的相關(guān)性

卜德永,趙連,周應(yīng)強(qiáng),劉亮,王帥

乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常見腫瘤,其特點(diǎn)是在分子和臨床水平上的異質(zhì)性[1]。近年來,BC的治療已取得許多進(jìn)展,但其仍是女性癌癥死亡的重要原因[2]。長鏈非編碼RNA癌易感性候選基因2(long non-coding RNA cancer susceptibility candidate 2,lncRNA CASC2)是一種腫瘤抑制基因,能參與調(diào)節(jié)血管生成及癌細(xì)胞增殖和侵襲,其在BC等多種癌癥中下調(diào),與癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡具有密切關(guān)聯(lián)[3-4]。微小RNA(microRNA,miRNA)能參與癌癥在內(nèi)的多種人類疾病。其中,BC組織中miR-532-3p呈高表達(dá),具有致癌作用[5]。報(bào)道顯示,lncRNA-miRNA軸在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和癌癥干細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用,參與癌癥進(jìn)展[6]。研究表明,lncRNA CASC2能通過靶向調(diào)節(jié)miR-532-3p抑制氧化型低密度脂蛋白誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。但目前l(fā)ncRNA CASC2、miR-532-3p與BC患者預(yù)后的關(guān)系尚未見研究報(bào)道。因此,現(xiàn)分析lncRNA CASC2、miR-532-3p在BC組織中的表達(dá)及其與患者預(yù)后的相關(guān)性,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年1月—2018年6月大同市第五人民醫(yī)院普通外科收治女性BC患者127例,年齡34～67(52.15±6.22)歲,其中≥52歲63例,<52歲64例;絕經(jīng)69例,未絕經(jīng)58例;腫瘤直徑:≥2 cm 62例,<2 cm 65例;TNM分期:Ⅰ～Ⅱ期84例,Ⅲ期43例;腫瘤分化程度:中、高分化88例,低分化39例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例;分子分型:Luminal A型37例,Luminal B型35例,HER2過表達(dá)型25例,基底樣型30例。手術(shù)過程中收集患者BC組織及癌旁正常組織。本研究已經(jīng)獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(臨床2014-10-2),患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《乳腺癌診療規(guī)范(2018年版)》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn),且經(jīng)病理學(xué)確診;②臨床資料完整,且接受隨訪者;③均是初次確診患者,入組前未進(jìn)行相關(guān)治療。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①存在其他部位惡性腫瘤;②自身免疫性疾病或全身感染性疾病;③臟器功能嚴(yán)重?fù)p傷。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 BC組織和癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA CASC2、miR-532-3p表達(dá)檢測:將BC組織及癌旁正常組織制成勻漿,采用RNA抽提試劑盒(廣州瑞博公司,批號RB7915)提取BC組織及癌旁正常組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(試劑盒購自太原市川至生物公司,批號16724L)。采用PCR擴(kuò)增儀(美國賽默飛世爾公司,型號SimpliAmp)進(jìn)行擴(kuò)增?？偡磻?yīng)體系30 μl根據(jù)PCR試劑盒(廣州瑞博公司,批號RB8139)配制。PCR反應(yīng)條件:86℃ 4 min、95℃ 17 s、72℃ 15 s、81℃ 22 s,共35個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法計(jì)算lncRNA CASC2(內(nèi)參為GAPDH)、miR-532-3p(內(nèi)參為U6)相對表達(dá)量。所有引物均由深圳子科生物公司合成,引物序列見表1。

表1 lncRNA CASC2、miR-532-3p引物序列

1.3.2 隨訪:BC患者術(shù)后隨訪5年(以電話和門診復(fù)查為隨訪方式),隨訪開始時(shí)間為術(shù)后第1日,截止時(shí)間為2023年6月30日或患者死亡。隨訪頻率:前2年每3個(gè)月進(jìn)行1次隨訪,后3年每6個(gè)月進(jìn)行1次隨訪。記錄患者5年內(nèi)生存和死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1 癌旁正常組織和BC組織lncRNA CASC2、miR-532-3p表達(dá)比較 BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2表達(dá)水平低于癌旁正常組織,miR-532-3p表達(dá)水平高于癌旁正常組織(P<0.01),見表2。

表2 癌旁正常組織和BC組織lncRNA CASC2、miR-532-3p表達(dá)比較

2.2 BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2和miR-532-3p表達(dá)在不同臨床病理特征中的差異比較 分別以BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2、miR-532-3p表達(dá)水平的平均值(0.59、3.17)作為臨界值,將患者分為lncRNA CASC2高表達(dá)組(≥0.59)65例和低表達(dá)組(<0.59)62例、miR-532-3p高表達(dá)組(≥3.17)61例和低表達(dá)組(<3.17)66例。結(jié)果發(fā)現(xiàn),BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2、miR-532-3p表達(dá)水平與年齡、是否絕經(jīng)、分子分型無關(guān)(P>0.05);腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、腫瘤分化程度低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比例lncRNA CASC2低表達(dá)組高于高表達(dá)組,而miR-532-3p低表達(dá)組低于高表達(dá)組(P均<0.01),見表3。

表3 BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2和miR-532-3p表達(dá)水平在不同臨床病理特征患者中差異比較 [例(%)]

2.3 生存組和死亡組患者臨床病理特征及BC組織lncRNA CASC2、miR-532-3p表達(dá)差異比較 127例BC患者術(shù)后隨訪5年,生存99例(生存組),死亡28例(死亡組)。2組BC患者年齡、是否絕經(jīng)、分子分型比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、腫瘤分化程度低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者比例及miR-532-3p表達(dá)水平死亡組高于生存組,而lncRNA CASC2表達(dá)水平死亡組低于生存組(P<0.01),見表4。

表4 生存組和死亡組臨床病理特征及BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2、miR-532-3p表達(dá)比較

2.4 BC組織lncRNA CASC2、miR-532-3p表達(dá)的相關(guān)性分析 由TargetScanHuman網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果可知,lncRNA CASC2與miR-532-3p之間有12個(gè)互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),lncRNA CASC2可能靶向作用于miR-532-3p表達(dá),見圖1。BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2與miR-532-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.561,P<0.001)。

圖1 lncRNA CASC2靶向miR-532-3p的生物信息學(xué)分析

2.5 BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2、miR-532-3p表達(dá)與患者術(shù)后5年內(nèi)生存的關(guān)系 lncRNA CASC2高表達(dá)組BC患者術(shù)后5年內(nèi)總生存率為89.23%(58/65),顯著高于lncRNA CASC2低表達(dá)組66.13%(41/62)(χ2=9.854,P=0.002);miR-532-3p高表達(dá)組BC患者術(shù)后5年內(nèi)總生存率為65.57%(40/61),顯著低于miR-532-3p低表達(dá)組的89.39%(59/66)(χ2=10.466,P=0.001)。

2.6 影響B(tài)C患者術(shù)后5年內(nèi)生存的多因素Cox回歸分析 以BC患者術(shù)后5年內(nèi)生存為因變量(賦值:是為“0”;否為“1”),以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量進(jìn)行多因素Cox回歸分析,結(jié)果顯示:腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、腫瘤低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA CASC2低表達(dá)、miR-532-3p高表達(dá)均是影響B(tài)C患者術(shù)后5年內(nèi)生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見表5。

表5 影響B(tài)C患者術(shù)后5年內(nèi)生存的多因素Cox回歸分析

2.7 lncRNA CASC2、miR-532-3p預(yù)測BC患者術(shù)后5年內(nèi)的生存價(jià)值 繪制lncRNA CASC2、miR-532-3p預(yù)測BC患者術(shù)后5年內(nèi)的生存價(jià)值ROC曲線,并計(jì)算AUC,結(jié)果顯示:lncRNA CASC2、miR-532-3p及二者聯(lián)合預(yù)測BC患者術(shù)后5年內(nèi)生存的AUC分別為0.840、0.852、0.908,二者聯(lián)合預(yù)測的AUC大于各自單獨(dú)預(yù)測(Z/P=2.246/0.025、2.033/0.042),見表6、圖2。

圖2 lncRNA CASC2、miR-532-3p預(yù)測BC患者術(shù)后5年內(nèi)生存的ROC曲線Fig.2 ROC curves of lncRNA CASC2 and miR-532-3p predicting survival within 5 years after surgery in patients with BC

表6 lncRNA CASC2、miR-532-3p預(yù)測BC患者術(shù)后5年內(nèi)生存的價(jià)值分析

3 討 論

BC是一種高度異質(zhì)性腫瘤,其病因和病理表現(xiàn)因人而異。近年來,BC發(fā)病率逐年上升,但由于診斷、治療及護(hù)理的改善,病死率有所下降[9]。BC由復(fù)雜的細(xì)胞類型組成,包括腫瘤、基質(zhì)和免疫細(xì)胞,每種細(xì)胞都可以呈現(xiàn)不同的表型,通過相互作用促進(jìn)腫瘤進(jìn)展和治療耐藥性,也強(qiáng)烈影響患者病情進(jìn)展及預(yù)后[10]。因此,尋找預(yù)測BC進(jìn)展及預(yù)后的指標(biāo)至關(guān)重要。

許多miRNA和lncRNA能參與乳腺惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)育過程,可能在BC的早期診斷、治療和預(yù)后方面提供新的見解[11-12]。lncRNA是一種新型基因調(diào)節(jié)因子,不編碼蛋白質(zhì),但以RNA的形式調(diào)節(jié)不同水平的基因表達(dá),與人類疾病尤其是癌癥的進(jìn)展和預(yù)后有關(guān)。部分lncRNA的異常表達(dá)可能與癌細(xì)胞過度生長和BC預(yù)后不良有關(guān)[13-14]。已有研究表明,lncRNA CASC2在BC組織和細(xì)胞中表達(dá)顯著降低,其過表達(dá)能抑制BC細(xì)胞活力和遷移[15]。Zhang等[16]報(bào)道,lncRNA CASC2在BC組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào),其能誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯,通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路抑制BC細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)BC的早期凋亡。lncRNA CASC2還能調(diào)控細(xì)胞腫瘤抗原p53基因表達(dá),進(jìn)而阻斷包括乳腺組織在內(nèi)的多種組織中的癌變過程[17]。在本研究中,BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織;且lncRNA CASC2高表達(dá)組BC患者術(shù)后5年內(nèi)總生存率較lncRNA CASC2低表達(dá)組高;與Orak等和Zhang等研究結(jié)果一致[15-16]。表明lncRNA CASC2可能與BC的發(fā)生及預(yù)后有關(guān),其高表達(dá)提示患者預(yù)后生存較好。可能原因是lncRNA CASC2活性低會(huì)導(dǎo)致BC細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng),導(dǎo)致BC的進(jìn)展惡化。

miRNA通過抑制信使RNA翻譯負(fù)調(diào)節(jié)下游基因表達(dá),在生物過程中起著重要作用[18-21]。有研究表明,miR-532-3p在BC中表達(dá)顯著上調(diào),是環(huán)狀RNA(circRNA)103809的直接靶標(biāo),其水平上調(diào)能逆轉(zhuǎn)circRNA 103809誘導(dǎo)的抗腫瘤效果,進(jìn)而在BC進(jìn)展中發(fā)揮作用[22]。Peng等[23]報(bào)道,三陰性BC組織中miR-532-5p水平升高,miR-532-5p可預(yù)測三陰性BC的惡性腫瘤發(fā)生和預(yù)后不良。本研究發(fā)現(xiàn),BC組織中miR-532-3p表達(dá)顯著高于癌旁正常組織,且miR-532-3p高表達(dá)組BC患者術(shù)后5年內(nèi)總生存率較miR-532-3p低表達(dá)組低;與Liu等和Peng等報(bào)道的結(jié)果一致[22-23]。提示miR-532-3p可能參與BC的發(fā)生和預(yù)后,其高表達(dá)提示患者預(yù)后生存較差。可能原因是miR-532-3p高表達(dá)會(huì)促進(jìn)BC細(xì)胞惡性生物學(xué)行為,進(jìn)而使BC惡性生長。

本研究發(fā)現(xiàn),BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2與miR-532-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān),二者表達(dá)與腫瘤直徑、TNM分期、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),表明lncRNA CASC2和miR-532-3p可能存在靶向調(diào)控關(guān)系,影響B(tài)C患者臨床病理特征。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),死亡組BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2表達(dá)水平較生存組低,miR-532-3p表達(dá)水平較生存組高,表明lncRNA CASC2和miR-532-3p表達(dá)與BC患者術(shù)后5年內(nèi)生存關(guān)系密切,可影響B(tài)C患者預(yù)后。Cox回歸分析和ROC曲線發(fā)現(xiàn),腫瘤直徑≥2 cm、TNM分期Ⅲ期、腫瘤低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA CASC2低表達(dá)、miR-532-3p高表達(dá)均是影響B(tài)C患者術(shù)后5年內(nèi)生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;lncRNA CASC2和miR-532-3p二者聯(lián)合對BC患者術(shù)后5年內(nèi)生存具有較高預(yù)測效能。提示臨床上要重點(diǎn)關(guān)注BC患者的上述危險(xiǎn)因素,對于lncRNA CASC2和miR-532-3p表達(dá)異常的BC患者,臨床上給予及時(shí)的治療和干預(yù),可延長患者生存期。

綜上所述,BC組織中l(wèi)ncRNA CASC2表達(dá)下調(diào),miR-532-3p表達(dá)上調(diào),且術(shù)后5年內(nèi)死亡的BC患者較存活患者變化更顯著,對預(yù)測BC患者術(shù)后5年內(nèi)生存情況價(jià)值較高。但本研究未探究lncRNA CASC2靶向調(diào)控miR-532-3p的具體機(jī)制,下一步將通過基礎(chǔ)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)來加以驗(yàn)證。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

卜德永:設(shè)計(jì)研究方案,實(shí)施研究過程,論文撰寫;趙連:提出研究思路,分析試驗(yàn)數(shù)據(jù);周應(yīng)強(qiáng):實(shí)施研究過程,資料搜集整理,論文修改;劉亮、王帥:進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,論文審核