半乳糖凝集素-3、白細(xì)胞介素35、白細(xì)胞介素17在支氣管哮喘病兒血清中的水平及與肺功能的相關(guān)性

孫云萍，武怡，孟令建

作者單位：徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，江蘇 徐州221002

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是兒童最常見的慢性炎癥性疾病之一，嬰幼兒期即可發(fā)病，嚴(yán)重影響兒童身心健康。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展，環(huán)境污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，支氣管哮喘作為呼吸道疾病，其發(fā)病率有逐漸上升趨勢(shì)。近年來(lái)我國(guó)部分兒童哮喘仍未得到良好的控制，早期診斷、規(guī)范化管理和早期干預(yù)，是提高兒童控制水平和改善預(yù)后的重要手段［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣流受限是哮喘的三大特征，其中氣道炎癥是該病的病理基礎(chǔ)，炎癥因子的過(guò)量釋放在哮喘發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起主要作用［3］。 因此，監(jiān)測(cè)病兒的氣道炎癥指標(biāo)對(duì)于本病的診治、預(yù)后評(píng)估具有重要意義。半乳糖凝集素-3（Galectin-3、Gal-3）也稱半乳糖結(jié)合蛋白-3，是半乳糖凝集素家族的重要成員之一，具有參與炎性反應(yīng)和介導(dǎo)細(xì)胞黏附等生物學(xué)功能，Gal-3通過(guò)嗜酸性粒細(xì)胞與呼吸道上皮細(xì)胞緊密黏合，釋放炎癥因子，促進(jìn)哮喘發(fā)生［4-5］。白細(xì)胞介素（IL）-17、IL-35 是近年來(lái)廣泛研究的兩種細(xì)胞因子，IL-17 是由Th17 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，能夠介導(dǎo)并放大氣道炎癥反應(yīng)過(guò)程，而IL-35 屬于Treg 細(xì)胞分泌的IL-12 家族成員，具有較強(qiáng)的抗炎功能，有研究顯示二者在兒童哮喘中存在異常表達(dá)［6］，本研究試圖通過(guò)分析哮喘病兒血清Gal-3、IL-35 及IL-17 表達(dá)水平及與肺功能的關(guān)系，探討Gal-3、IL-35 及IL-17 在哮喘病兒發(fā)病過(guò)程中的作用及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究共納入2021 年8 月至2022年8 月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科收治的77 例支氣管哮喘病兒（4～14 歲）為研究對(duì)象，其中輕中度急性發(fā)作組40 例，緩解組37 例，對(duì)照組26 例（本研究對(duì)照組僅為26例，因?yàn)檫@段時(shí)間內(nèi)本地區(qū)間斷發(fā)生新冠疫情，因疫情防控之下，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院門診健康體檢兒童數(shù)量急劇下降，因此符合入組條件并能配合完善肺功能、家長(zhǎng)配合同意簽署知情同意書的兒童甚少，因此對(duì)照組例數(shù)在基本達(dá)到統(tǒng)計(jì)樣本量的要求后，未能再繼續(xù)擴(kuò)充樣本量）。本研究獲得徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)XYFY2022-KL159-01）。所有入組病兒監(jiān)護(hù)人對(duì)研究方案均簽署知情同意書。

1.2 入選及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1入選標(biāo)準(zhǔn) 兒童哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)呼吸學(xué)組制定的兒童支氣管哮喘規(guī)范化診治建議（2020年版）［2］。輕中度哮喘急性發(fā)作組及緩解組病兒評(píng)估依據(jù)兒童支氣管哮喘規(guī)范化診治建議（2020 年版）及全球哮喘防治協(xié)議（GINA）2020版診斷標(biāo)準(zhǔn)［2］。對(duì)照組健康兒童無(wú)哮喘及家族史，無(wú)濕疹史、過(guò)敏性鼻炎史，無(wú)其他變態(tài)反應(yīng)性疾病史，無(wú)糖皮質(zhì)激素應(yīng)用史，無(wú)免疫抑制藥物使用史及資料完整的病例。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) ①有過(guò)敏性鼻炎或其他過(guò)敏性疾病史者；②不能配合肺功能檢查者；③合并炎癥性疾病、惡性血液系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、癲癇或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；④合并心臟、肝臟、腎臟或其他器官、系統(tǒng)慢性病者；⑤入組前3個(gè)月內(nèi)應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑。

1.3 標(biāo)本采集

1.3.1血清Gal-3、IL-35、IL-17 水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immu- nosorbent assay，ELISA）檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血清Gal-3、IL-35、IL-17 表達(dá)水平。試劑盒購(gòu)自上海雅吉生物有限公司，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書執(zhí)行。

1.3.2肺功能檢測(cè) 采用Master Screen 肺功能檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)，主要檢測(cè)指標(biāo)包括第1 秒用力呼氣容積/1 s 用力呼氣量預(yù)計(jì)值百分比（FEV1%）、1 s 用力呼氣量占用力肺活量比值（FEV1/FVC）、最大呼氣50%瞬間流量（FEF50%），最大呼氣75%瞬間流量（FEF75%）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用±s表示，進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組一般情況一般資料結(jié)果，輕中度急性發(fā)作組、緩解組及對(duì)照組之間性別、年齡比較，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 支氣管哮喘77例及對(duì)照組26例年齡、性別比較

2.2 三組血清Gal-3、IL-35、IL-17 比較三組血清Gal-3、IL-35、IL-17 水平經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)對(duì)各組Gal-3、IL-35、IL-17水平進(jìn)行兩兩比較結(jié)果顯示，輕中度急性發(fā)作組血清Gal-3 水平顯著高于緩解組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），輕中度急性發(fā)作組血清IL-17 水平顯著高于緩解組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），輕中度急性發(fā)作組血清IL-35 水平顯著低于緩解組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 三組半乳糖凝集素-3（Galectin-3）、白細(xì)胞介素35（IL-35）及白細(xì)胞介素17（IL-17）水平比較/（ng/L，± s）

表2 三組半乳糖凝集素-3（Galectin-3）、白細(xì)胞介素35（IL-35）及白細(xì)胞介素17（IL-17）水平比較/（ng/L，± s）

注：①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與輕中度急性發(fā)作組比較，P＜0.05。

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2.3 三組肺功能指標(biāo)水平比較三組肺功能指標(biāo)FEV1%、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)對(duì)各組肺功能指標(biāo)進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示輕中度急性發(fā)作期肺功能指標(biāo)FEV1%、FEV1/FVC 顯著低于緩解組及對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。輕中度急性發(fā)作組FEF50%、FEF75%顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），輕中度急性發(fā)作組與緩解組FEF50%、FEF75% 比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.153、0.098）。見表3。

表3 各組肺功能FEV1% 、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%結(jié)果比較/（%，± s）

表3 各組肺功能FEV1% 、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%結(jié)果比較/（%，± s）

注：FEV1%為第1 秒用力呼氣容積/1 s 用力呼氣量預(yù)計(jì)值百分比，F(xiàn)EV1/FVC 為1 s 用力呼氣量占用力肺活量比值，F(xiàn)EF50%為最大呼氣50%瞬間流量，F(xiàn)EF75%為最大呼氣75%瞬間流量。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與輕中度急性發(fā)作組比較，P＜0.05。

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2.4 血清Gal-3、IL-35 分別與IL-17 的相關(guān)性分析經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血清Gal-3 與IL-17 呈正相關(guān)（r=0.63，P＜0.001）；血清IL-35 與IL-17呈負(fù)相關(guān)（r=-0.72，P＜0.001），見圖1。

圖1 相關(guān)性分析：A為Gal-3與IL-17間的相關(guān)性分析；B為IL-35與IL-17間的相關(guān)性分析

2.5 血清Gal-3 、IL-17、IL-35與肺功能指標(biāo)間的相關(guān)性分析血清Gal-3、IL-17 水平與肺功能參數(shù)FEV1、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.001），血清IL-35 與肺功能參數(shù)FEV1、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75% 血清呈顯著正相關(guān)（P＜0.001）。見表4。

表4 Gal-3、IL-17及IL-35與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

哮喘的主要特征是慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)，易反復(fù)發(fā)作、病程長(zhǎng)，可引發(fā)肺部及全身反應(yīng)，嚴(yán)重影響病人的生活和身心健康，給家庭、社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。該疾病具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，經(jīng)典理論認(rèn)為 Th1/Th2 細(xì)胞功能失衡是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵機(jī)制，然而Th17 細(xì)胞和Treg 細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡也參與支氣管哮喘發(fā)病的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。Th17 亞群細(xì)胞可誘導(dǎo)機(jī)體炎癥發(fā)生炎癥反應(yīng)，且分泌的IL-17是影響氣道炎癥反應(yīng)的重要因子，Treg細(xì)胞分泌的IL-35 為抗炎癥細(xì)胞因子。Th17 細(xì)胞過(guò)度活化和Treg 數(shù)目及功能下降是哮喘的免疫防病機(jī)制之一［7-8］。魯珊珊等［9］指出在兒童支原體肺炎中Gal-3 可作為強(qiáng)大的促炎因子，反映Th17 細(xì)胞功能，Gal-3 促進(jìn)Th17 細(xì)胞表達(dá)IL-17 等效應(yīng)因子，參與支原體肺炎的發(fā)病。目前Gal-3、IL-35 及IL-17 與兒童哮喘相關(guān)報(bào)道較少，本研究通過(guò)分析哮喘病兒血清Gal-3、IL-35 及IL-17 的水平，探究血清Gal-3、IL-35及IL-17在兒童哮喘中可能的作用機(jī)制及意義。

Gal-3 是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的β-半乳糖苷結(jié)合蛋白，在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中廣泛表達(dá)，具有調(diào)節(jié)炎癥因子、參與過(guò)度炎癥反應(yīng)和纖維化為特征疾病的發(fā)病過(guò)程［10］。Gal-3與多種呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)，在卵白蛋白（OVA）誘發(fā)的哮喘小鼠模型中，Gal-3的表達(dá)在支氣管周炎性細(xì)胞及支氣管肺泡灌洗液中明顯升高，Gal-3可能在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起重要作用［11］。Feng等［12］發(fā)現(xiàn)Gal-3 在急性加重期慢性阻塞性肺疾病病人血清水平顯著高于恢復(fù)期慢性阻塞性肺疾病病人，Gal-3可能促進(jìn)慢性阻塞性肺疾病病人炎癥反應(yīng)。IL-17 是具有強(qiáng)大促炎能力的前炎癥因子，能誘導(dǎo)和促使中性粒細(xì)胞在呼吸道聚集，發(fā)揮致炎、損傷修復(fù)、清除病原菌等作用，參與肺部感染、哮喘等多種肺部疾病進(jìn)展［13］。有研究報(bào)道，在過(guò)敏性哮喘小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Gal-3 作為關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子通過(guò)中性粒細(xì)胞募集促進(jìn)IL-17分泌，在自身免疫性膽管炎小鼠模型中也顯示Gal-3 可增加IL-17 的合成［14-15］。本研究結(jié)果顯示輕中度哮喘急性發(fā)作組病兒血清Gal-3及IL-17水平明顯高于緩解組及對(duì)照組，且Gal-3水平越高，IL-17水平越高，二者呈正相關(guān)，這表明，Gal-3可能通過(guò)炎性反應(yīng)相關(guān)途徑調(diào)控Th17 及IL-17 的表達(dá)，促進(jìn)IL-17表達(dá)增強(qiáng)，引起氣道及全身炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)疾病的發(fā)展和病程，抑制Gal-3 的表達(dá)，有望為支氣管哮喘等免疫性疾病提供新的治療思路。

IL-35 作為IL-12 家族新成員之一，通過(guò)增強(qiáng)Tregs 亞群的功能、抑制Th17 細(xì)胞的增殖分化和IL-17的分泌，參與哮喘的發(fā)病［16］。在小鼠的過(guò)敏性氣道疾病模型中，靜脈給予表達(dá)IL-35 的腺病毒質(zhì)粒或直接注射IL-35，觀察到氣道的高反應(yīng)性及組織病理學(xué)氣道及肺部的炎癥反應(yīng)明顯減輕，肺泡盥洗液中巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞以及細(xì)胞因子（IL-4、IL-5、IL-13 和IL-17 等）都明顯降低［17-18］。本研究結(jié)果顯示，急性發(fā)作組哮喘病兒血清IL-35 水平明顯低于緩解組及對(duì)照組，與現(xiàn)有文獻(xiàn)［19］報(bào)道相同。這表明IL-35 在哮喘急性發(fā)作期抗炎作用減弱，促炎因子作用加強(qiáng)，進(jìn)而參與哮喘的發(fā)病。經(jīng)相關(guān)性分析顯示血清Gal-3與IL-17呈正相關(guān)，IL-35 與IL-17 呈負(fù)相關(guān)，這表明，哮喘血清中IL-17 的表達(dá)改變可影響其他細(xì)胞因子水平的表達(dá)。Gal-3、IL-17 水平的升高及IL-35 的降低，可能在Th17/Treg 細(xì)胞平衡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，影響哮喘的發(fā)生。Gal-3、IL-17 可能通過(guò)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)而加重疾病進(jìn)展，IL-35則在抑制氣道炎癥反應(yīng)中發(fā)揮積極作用，哮喘中Treg/Th17 的表達(dá)失衡，為研究哮喘的免疫學(xué)機(jī)制提供了新的理論依據(jù)，進(jìn)一步研究發(fā)展新型抗炎分子和新的免疫治療方法，有可能為今后治療支氣管哮喘提供新策略。

判斷氣流受限的重要客觀指標(biāo)是肺功能檢查指標(biāo)，肺功能檢測(cè)是診斷哮喘的重要手段，同時(shí)也是評(píng)估哮喘控制水平和病情嚴(yán)重程度的重要依據(jù)［20-21］。本研究結(jié)果顯示哮喘緩解期反映大氣道功能的指標(biāo)FEV1%、FEV1/FVC 與輕中度哮喘急性發(fā)作組比較，有明顯改善，而反映小氣道功能的指標(biāo)FEF50%、FEF75%與輕中度哮喘急性發(fā)作組比較，無(wú)顯著變化，與對(duì)照組比較亦明顯下降，這表明部分哮喘病兒緩解期仍存在小氣道功能異常。陳俊松等［22］研究也顯示在哮喘緩解期小氣道功能障礙組病程明顯長(zhǎng)于肺功能正常組，哮喘病兒小氣道功能指標(biāo)對(duì)于緩解期的氣道阻塞敏感，對(duì)兒童哮喘緩解期的病情評(píng)估具有臨床意義。因此我們可以得出小氣道功能指標(biāo)是監(jiān)測(cè)、評(píng)估哮喘緩解期療效的重要指標(biāo)。通過(guò)相關(guān)性分析顯示，血清Gal-3、IL-17與肺功能FEV1%、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%呈負(fù)相關(guān)，血清IL-35 與肺功能參數(shù)FEV1%、FEV1/FVC、FEF50%、FEF75%呈正相關(guān)，血清Gal-3、IL-17、IL-35 可間接反應(yīng)哮喘病人肺功能氣道炎癥變化，可作為輔助支氣管哮喘診斷、病情判斷的參考指標(biāo)之一。

綜上所述，哮喘病兒Gal-3表達(dá)上調(diào)，IL-35表達(dá)下調(diào)，引起IL-17 促表達(dá)增強(qiáng)、表達(dá)抑制作用減弱，IL-17水平升高從而導(dǎo)致氣道炎癥加重，可能是輕中度哮喘急性發(fā)作的發(fā)病機(jī)制之一；亦可能是哮喘緩解期部分病兒小氣道炎癥持續(xù)存在的可能機(jī)制之一。Gal-3、IL-35、IL-17水平測(cè)定有助于預(yù)測(cè)輕中度哮喘急性發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)及指導(dǎo)調(diào)整吸入性糖皮質(zhì)激素用藥。