蒼術(shù)素調(diào)節(jié)腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息調(diào)節(jié)因子1信號(hào)通路對(duì)白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞自噬和凋亡的影響

沈曉娟，程磊，劉琳

作者單位：上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院藥學(xué)部，上海200032

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性疾病，主要病理改變表現(xiàn)為軟骨退化、骨贅形成、滑膜炎癥，隨著年齡的增長(zhǎng)，患病率呈升高趨勢(shì)，嚴(yán)重影響病人身心健康，OA 的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，軟骨細(xì)胞凋亡在OA 的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，抑制細(xì)胞凋亡是治療OA 的一個(gè)方向［1-2］。自噬又稱Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，研究顯示，自噬參與OA 的進(jìn)展，增強(qiáng)自噬可以抑制軟骨細(xì)胞凋亡，延緩骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展［3］。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種能量傳感器，可激活Unc-51 樣自噬激活蛋白酶（Unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1）正調(diào)控自噬，激活A(yù)MPK 增強(qiáng)自噬，抑制OA 軟骨細(xì)胞凋亡［4］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent message modulator 1，SIRT1）是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴的去乙?；?，磷酸化的AMPK 可提高細(xì)胞內(nèi)NAD+濃度，激活SIRT1 的表達(dá)，激活A(yù)MPK/SIRT1 信號(hào)通路，可抑制炎癥反應(yīng)，改善OA 癥狀［5］。蒼術(shù)素（atractylodin，ATR）是從蒼術(shù)中提取有效物質(zhì)，具有降糖、抗炎、抗氧化及抗腫瘤的作用［6］。研究顯示，蒼術(shù)素可抑制白細(xì)胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)［7］，但其具體作用機(jī)制尚不清楚，本研究2022 年1—8 月通過觀察蒼術(shù)素對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬及對(duì)AMPK/SIRT1信號(hào)通路的影響，探索蒼術(shù)素對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡與自噬可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑1 周齡SD 雄性乳鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2021-0011。蒼術(shù)素（HPLC≥98%）購自四川成都/思克生物；重組大鼠IL-1β（GS4468）購自北京百奧萊博科技有限公司；AMPK 抑制劑compound C（純度99.91%）購自美國(guó)MCE 公司；Annexin VFITC/PI 凋亡試劑盒（CA1020）、噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（M1020）、單丹磺酰尸胺（montane sulfonyl cadaverine，MDC）試劑盒（G0170）、TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒（綠色熒光）（T2130）購自北京索萊寶生物科技有限公司；LC3（AL221）、Beclin-1（AF5123）、Atg5（AF2269）、AMPK（AF1627）、p-AMPK（AF2677）、SIRT1（AF5300）抗體購自碧云天生物科技有限公司，ULK1（ab167139）、p-ULK1（ab203207）抗體購自美國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1軟骨細(xì)胞的分離與鑒定 1 周齡SD 乳鼠麻醉后處死，根據(jù)參考文獻(xiàn)［8］，無菌條件下取軟骨組織，采用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶兩步酶消化法提取軟骨細(xì)胞，原代細(xì)胞培養(yǎng)3 d 后，顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，采用甲苯胺藍(lán)染色與Ⅱ型膠原蛋白（collagen Ⅱ）免疫熒光染色進(jìn)行鑒定，鑒定過的細(xì)胞傳代培養(yǎng)，選取第3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2蒼術(shù)素濃度的篩選 第3代軟骨細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，按照4×104個(gè)接種于96 孔板中，使用不同濃度的蒼術(shù)素（0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）處理軟骨細(xì)胞，同時(shí)加入10 μg/L 的IL-1β 共同處理24 h 后，另設(shè)正常培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組，加入20 μL 的MTT 溶液，孵育4 h 后，加入DMSO 終止反應(yīng)，檢測(cè)490 nm處的光密度值（OD值）。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將軟骨細(xì)胞隨機(jī)分成4組，分別為對(duì)照組、IL-1β 組、蒼術(shù)素組（蒼術(shù)素組）、蒼術(shù)素+AMPK 抑制劑組（蒼術(shù)素+compound C 組），其中IL-1β 組使用10 μg/L 的IL-1β［8］誘導(dǎo)24 h，建立細(xì)胞模型；蒼術(shù)素組使用20 μmol/L 的蒼術(shù)素與10 μg/L 的IL-1β 共同處理細(xì)胞24 h，蒼術(shù)素+compound C 組在建立細(xì)胞模型前，使用50 μmol/L 的compound C［9］預(yù)處理2h，再使用20 μmol/L 的蒼術(shù)素與10 μg/L 的IL-1β 共同處理細(xì)胞24 h，對(duì)照組用等量的PBS處理細(xì)胞。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將各組處理的軟骨細(xì)胞按照4×104個(gè)接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，使用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

另取各組處理的軟骨細(xì)胞按照1×104個(gè)細(xì)胞接種于無菌蓋玻片上，培養(yǎng)24 h 后，使用預(yù)冷的甲醇固定10 min，加入TUNEL 反應(yīng)液，37 ℃，染色1 h，光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5MDC 染色觀察自噬小體 收集各組處理的軟骨細(xì)胞800 ×g離心5 min，使用Wash buffer 將細(xì)胞制成109個(gè)/升的細(xì)胞懸液，取90 μL細(xì)胞懸液加入10 μL的MDC 染色液，避光染色30 min，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中自噬及AMPK/SIRT1 通路相關(guān)蛋白表達(dá) 使用RIPA 裂解液從各組處理的細(xì)胞中提取總蛋白，取30 μg 蛋白SDSPAGE電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉，LC3（1∶1 000）、Beclin-1（1∶1 000）、Atg5（1∶1 500）、p-AMPK（1∶1 000）、AMPK（1∶1 500）、SIRT1（1∶1 000）、ULK1（1∶1 500）、p-ULK1（1∶1 500）抗體，4 ℃孵育過夜，再加入酶標(biāo)二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h，ECL 試劑顯色，以β-actin為內(nèi)參，利用Image J軟件分析蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符以±s表示，數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性和方差齊性分別通過Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)和Levene 檢驗(yàn)進(jìn)行分析（P＞0.05）；方差齊（P＞0.05）時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，組間兩兩比較采用Games-Howell檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 軟骨細(xì)胞的分離與鑒定顯微鏡下觀察顯示，分離的原代大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)3 d 后，細(xì)胞呈橢圓形或梭形，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)（圖1A），甲苯胺藍(lán)染色顯示，細(xì)胞核被染成深藍(lán)色，核仁呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)褐紅色（圖1B），collagen Ⅱ免疫熒光染色顯示，細(xì)胞呈綠色（圖1C），經(jīng)DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色，證明分離的細(xì)胞為軟骨細(xì)胞。

2.2 蒼術(shù)素對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增殖活性的影響與對(duì)照組（1.22±0.11）比較，IL-1β 組軟骨細(xì)胞增殖活性（0.60±0.07）顯著降低（F=45.91，P＜0.001）；使用不同濃度蒼術(shù)素（5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 μmol/L）預(yù)處理軟骨細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活性增加（0.63±0.07、0.65±0.08、0.78±0.08、0.95±0.09、1.06±0.10），且蒼術(shù)素濃度在20 μmol/L 以上，可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖，因此選擇蒼術(shù)素濃度20 μmol/L進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 蒼術(shù)素對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組（2.54±0.82）%比較，IL-1β 組軟骨細(xì)胞凋亡率（28.46±3.55）%顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β 組比較，蒼術(shù)素組軟骨細(xì)胞凋亡率（14.26±2.45）%顯著降低（P＜0.05）；與蒼術(shù)素組比較，蒼術(shù)素+compound C組軟骨細(xì)胞凋亡率（22.36±2.71）%顯著升高（P＜0.05）。

TUNEL 染色結(jié)果顯示，凋亡細(xì)胞為綠色，細(xì)胞核為藍(lán)色，與對(duì)照組比較，IL-1β 組細(xì)胞綠色熒光增多，與IL-1β 組比較，蒼術(shù)素組綠色熒光減少；與蒼術(shù)素組比較，蒼術(shù)素+compound C 組綠色熒光增多，見圖2。

圖2 TUNEL染色觀察蒼術(shù)素對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的乳鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響（×1 000）

2.4 蒼術(shù)素對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬的影響熒光顯微鏡下觀察顯示，MDC 染色自噬小體呈綠色，與對(duì)照組相比，IL-1β 組軟骨細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度減弱；與IL-1β 組相比，蒼術(shù)素組細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)；與蒼術(shù)素組比較，蒼術(shù)素+compound C 組細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度減弱，見圖3。

圖3 乳鼠軟骨細(xì)胞自噬小體（MDC染色×400）：A為對(duì)照組；B為I L-1 β組；C為蒼術(shù)素組；D為蒼術(shù)素+C o m p o u n d 組

2.5 蒼術(shù)素對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響與對(duì)照組比較，IL-1β 組軟骨細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與IL-1β 組相比，蒼術(shù)素組軟骨細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與IL-1β+蒼術(shù)素組比較，蒼術(shù)素+compound C組軟骨細(xì)胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。見圖4；表1。

表1 蒼術(shù)素對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞LC3、Beclin-1、Atg5表達(dá)的影響/± s

表1 蒼術(shù)素對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞LC3、Beclin-1、Atg5表達(dá)的影響/± s

注：LC3為微管相關(guān)蛋白輕鏈3，Atg5為自噬相關(guān)基因-5。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與IL-1β 組比較，P＜0.05。③與蒼術(shù)素組比較，P＜0.05。

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圖4 各組軟骨細(xì)胞LC3、Atg5、Beclin-1蛋白表達(dá)情況

2.6 蒼術(shù)素對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞AMPK/SIRT1通路相關(guān)蛋白的影響與對(duì)照組相比，IL-1β組軟骨細(xì)胞中p-AMPK、SIRT1、p-ULK1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與IL-1β 組相比，蒼術(shù)素組軟骨細(xì)胞中p-AMPK、SIRT1、p-ULK1 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與蒼術(shù)素組比較，蒼術(shù)素+compound C 組細(xì)胞p-AMPK、SIRT1、p-ULK1 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），各組之間AMPK、ULK1表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5和表2。

表2 各組軟骨細(xì)胞SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)/± s

表2 各組軟骨細(xì)胞SIRT1、p-ULK1/ULK1、p-AMPK/AMPK蛋白表達(dá)/± s

注：AMPK 為腺苷酸活化蛋白激酶，SIRT1 為沉默信息調(diào)節(jié)因子1，ULK1為Unc-51樣自噬激活蛋白酶。①與對(duì)照組比較，P＜0.05。②與IL-1β 組比較，P＜0.05。③與蒼術(shù)素組比較，P＜0.05。

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圖5 各組軟骨細(xì)胞SIRT1、ULK1、p-ULK1、AMPK、p-AMPK蛋白表達(dá)情況

3 討論

IL-1β 是一種促炎細(xì)胞因子，可通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶與炎癥因子表達(dá)，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，參與OA 進(jìn)展，常作為誘導(dǎo)OA 細(xì)胞模型的因子［10］。本研究從乳鼠軟骨組織分離軟骨細(xì)胞，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色和collagen Ⅱ免疫熒光染色證明成功分離軟骨細(xì)胞。使用IL-1β 處理軟骨細(xì)胞后，細(xì)胞增殖活性降低，凋亡率升高，表明OA 細(xì)胞模型建模成功。蒼術(shù)素為蒼術(shù)提取物，可以調(diào)控炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、腫瘤細(xì)胞增殖與遷移等，具有多種藥理學(xué)作用［11］。研究顯示，蒼術(shù)素抑制核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域-（nucleotide binding domain，NOD-）樣受體蛋白3（like receptor protein 3，NLRP3）炎性體和toll 樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）激活，抑制炎癥反應(yīng)，減輕脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷［12］。蒲博強(qiáng)等［13］發(fā)現(xiàn)，蒼術(shù)提取物可通過下調(diào)miR-378c 表達(dá)，抑制IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究使用不同濃度蒼術(shù)素預(yù)處理細(xì)胞24h，再使用IL-1β 處理細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖活性增加，且在20 μmol/L以上時(shí)，細(xì)胞增殖活性顯著增加，選擇20 μmol/L 的蒼術(shù)素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)20 μmol/L 的蒼術(shù)素可顯著抑制IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。這與既往的研究結(jié)果［13］一致，再次證實(shí)蒼術(shù)素是OA的潛在治療藥物。

自噬是依賴溶酶體途徑對(duì)細(xì)胞器及大分子物質(zhì)進(jìn)行降解的過程，具有維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用，參與細(xì)胞凋亡過程［14］。研究顯示，自噬參與維持軟骨內(nèi)平衡，參與OA 進(jìn)展，激活自噬可減輕OA 嚴(yán)重程度［15］。LC3、Beclin-1、Atg5 是自噬通路相關(guān)的調(diào)控因子，LC3 有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種形式，發(fā)生自噬時(shí)，LC3-I 轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-Ⅱ，Beclin-1 可調(diào)控自噬前體的形成，Atg5 是自噬活性標(biāo)志物，與Beclin-1 共同參與正向調(diào)控自噬［16］。蒼術(shù)素參與自噬調(diào)節(jié)，如在膽管癌細(xì)胞中，蒼術(shù)素可通過誘導(dǎo)自噬，抑制細(xì)胞增殖與遷移［17］。本研究結(jié)果顯示，在10 μg/L IL-1β刺激24 h 后，軟骨細(xì)胞中自噬小體水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中自噬被抑制；使用20 μmol/L 的蒼術(shù)素處理細(xì)胞后，IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬小體水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1、Atg5 蛋白表達(dá)水平顯著升高，提示蒼術(shù)素可促進(jìn)IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬，降低IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。

AMPK 是細(xì)胞ATP 水平的代謝傳感器，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝，AMPK 激活可使其下游底物磷酸化，ULK1 是AMPK 通路的下游分子，參與自噬的起始，SIRT1是NAD+依賴性組蛋白脫乙酰酶，AMPK可促進(jìn)NAD+的生成，激活SIRT1 因子［18］。研究顯示，白果內(nèi)酯通過激活A(yù)MPK/SIRT1/mTOR 通路，抑制IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、環(huán)氧合酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶13（Matrix metalloproteinase 13，MMP-13）的產(chǎn)生［19］。蒼術(shù)素也參與AMPK/SIRT1 通路的調(diào)節(jié)，如蒼術(shù)素通過Sirt1/AMPK 軸誘導(dǎo)的自噬調(diào)節(jié)減輕癌癥厭食惡病質(zhì)綜合征［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，使用蒼術(shù)素處理軟骨細(xì)胞后，p-AMPK、SIRT1、p-ULK1蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明蒼術(shù)素可能激活SIRT1/AMPK 信號(hào)通路。本研究進(jìn)一步使用AMPK 抑制劑compound C 與蒼術(shù)素共同處理軟骨細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)compound C 可逆轉(zhuǎn)蒼術(shù)素對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的抑制作用，提示蒼術(shù)素可能通過激活A(yù)MPK/SIRT1 信號(hào)通路提高IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞自噬，降低細(xì)胞凋亡。

綜上所述，蒼術(shù)素通過激活A(yù)MPK/SIRT1 信號(hào)通路促進(jìn)IL-1β 誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡。但本研究局限于AMPK/SIRT1 信號(hào)通路相關(guān)的部分蛋白，蒼術(shù)素的具體作用機(jī)制仍須結(jié)合動(dòng)物模型做更深入的研究。